吳 悅，楊 旭，孫 濤，劉 濤

（1.海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院，海南 ?？冢?71199；2.秦皇島市第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，河北 秦皇島 066000）

呼吸道合胞體病毒（respiratory syncytial virus，RSV），屬于副黏液病毒科，肺炎病毒屬，是一種單負(fù)鏈RNA 病毒［1］。RSV 是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒支氣管炎和肺炎等下呼吸道感染的最主要病原體之一，也是引起嬰幼兒及免疫力低下人群致病和死亡的重要病原體之一［2］。一項(xiàng)調(diào)查研究表明，2005年在全球范圍內(nèi)有340 萬(wàn)人因RSV 感染住院，并造成66 000～199 000 例5 歲以下嬰幼兒死亡［3］。目前針對(duì)RSV 感染尚未有安全有效的預(yù)防性疫苗，并且滅活病毒疫苗的接種會(huì)加重RSV 的感染。核苷類似物藥物利巴韋林是目前唯一被批準(zhǔn)的RSV 治療藥物，但是其存在治療效果不理想且副作用明顯等問(wèn)題［4-6］。人源化單克隆抗體Palivizumab（Synagis）的作用靶點(diǎn)是病毒膜融合蛋白，其僅能用于RSV 的預(yù)防性治療，且價(jià)格昂貴，目前主要用于早產(chǎn)兒和具有嚴(yán)重免疫缺陷的兒童［7，8］。因此，臨床迫切需要有效而安全的RSV 治療藥物。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了很多中醫(yī)藥抗流感病毒的實(shí)驗(yàn)研究［9-11］，尤其是2019 年爆發(fā)新型冠狀病毒感染的肺炎以來(lái)，中醫(yī)藥在新型冠狀病毒感染肺炎的預(yù)防和治療中發(fā)揮了重要作用［12，13］，中醫(yī)藥治療新型冠狀病毒感染肺炎經(jīng)驗(yàn)成為中國(guó)方案的亮點(diǎn)，正在為國(guó)際社會(huì)防控疫情提供中國(guó)經(jīng)驗(yàn)和中國(guó)智慧，助力人類命運(yùn)共同體建設(shè)［14］。中成藥貫黃感冒顆粒能夠辛涼解毒，宣肺止咳，主要用于風(fēng)熱感冒，發(fā)熱惡風(fēng)，頭痛鼻塞，咳嗽痰多等癥［15］。貫黃感冒顆粒是臨床較為常用的治療感冒用藥，但是其作用的病原種類并不清楚，治療效果的分子機(jī)制尚未被闡釋。本研究采用Hep-2 細(xì)胞［16，17］培養(yǎng)技術(shù)在體外評(píng)估中成藥貫黃感冒顆粒抗RSV 的效果，為貫黃感冒顆粒針對(duì)RSV感染的預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒株

人喉癌上皮細(xì)胞Hep-2（ATCC CCL-23）和人呼吸道合胞體病毒A 型（RSV-A，ATCC VR-26）為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存細(xì)胞和毒株。Hep-2 細(xì)胞用含有10%FBS 和青霉素-鏈霉素雙抗（青霉素10 000 U/mL，鏈霉素10 mg/mL，Invitrogen）的DMEM 培養(yǎng)基（Invitrogen），于37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，視細(xì)胞密度2～3 d 傳代一次。RSV-A 經(jīng)Hep-2 細(xì)胞擴(kuò)增后，利用終點(diǎn)稀釋法測(cè)定其滴度，本次實(shí)驗(yàn)病毒TCID50為1.5 × 106/mL。

1.2 藥物的配制

貫黃感冒顆粒生產(chǎn)廠家為海南制藥廠有限公司，將貫黃感冒顆粒溶解于純水，經(jīng)0.22 微米濾器過(guò)濾后制成貫黃感冒顆粒水溶液，濃度為50 mg/mL，藥物配制后于-20℃保存。

陽(yáng)性對(duì)照藥物cyclopiazonic acid（CPA）［18］購(gòu)于Sigma 公司，用DMSO 溶液溶解配制成200 μmol/L濃度的母液，經(jīng)0.22 μmol/L 濾器過(guò)濾除菌，于-20℃保存。

1.3 藥物的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

取5×103個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep-2 細(xì)胞連同100 μL DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將Hep-2 細(xì)胞于37℃5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，將待檢測(cè)藥物按2 倍比方法稀釋后，向96 孔板中加入梯度稀釋的藥物，每個(gè)藥物濃度做5 個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)定未加藥物的細(xì)胞對(duì)照孔及只含有DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基的對(duì)照孔。于37℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后，向每個(gè)孔加入10 μL CCK-8 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（Beyotime 生物技術(shù)，上海，中國(guó)），于37℃5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，用酶標(biāo)儀（SpectraMax i3x，Molecular Devices）測(cè)定在450 nm 波段處的吸光度。依照CCK-8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)公式計(jì)算細(xì)胞存活率及運(yùn)用GraphPadPrism 6 軟 件 的nonlinear regression 計(jì) 算 藥物半數(shù)致死率（TC50）。

1.4 藥物對(duì)RSV-A 病毒的直接抑制作用

取2 倍梯度稀釋的貫黃感冒顆粒和CPA，分別與50 μL 稀釋的病毒液混合（MOI 為0.5），于37℃保持緩慢搖動(dòng)的狀態(tài)孵育1 h。將藥物和病毒的混合液加入到接種有5×103個(gè)Hep-2 細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度藥物組設(shè)5 個(gè)重復(fù)孔，置于37℃5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h 后，棄掉培養(yǎng)上清，用無(wú)菌PBS 清洗貼壁細(xì)胞3 次，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)基，于37℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后，用CCK-8 法檢測(cè)藥物對(duì)病毒抑制率。

1.5 藥物抗HRSV-A 效果的檢測(cè)

基于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以無(wú)明顯細(xì)胞毒性的最高藥物濃度為最高起始濃度，2 倍比稀釋藥物獲得梯度稀釋的待檢測(cè)藥物，將50 μL 含有5×103個(gè)Hep-2 細(xì)胞的培養(yǎng)基接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄掉上清，用無(wú)菌PBS 清洗細(xì)胞兩次，將50 μL 含有濃度梯度稀釋藥物和50 μL 稀釋的病毒液加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，病毒感染復(fù)數(shù)MOI 為0.5，每個(gè)濃度藥物組設(shè)5 個(gè)重復(fù)孔。將96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板于37℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 波段處吸光度（OD）。根據(jù)OD 值計(jì)算細(xì)胞存活率，進(jìn)而計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度（EC50）。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)不加抗病毒藥物的病毒感染細(xì)胞組，不加病毒只加藥物的細(xì)胞組、不加病毒藥物的正常細(xì)胞組為對(duì)照。根據(jù)不同藥物濃度下細(xì)胞的存活率，運(yùn)用GraphPad-Prism 6 軟件的nonlinear regression 計(jì)算出藥物的半數(shù)有效濃度（EC50）及藥物的治療指數(shù)藥物治療指數(shù)（TI），并與陽(yáng)性藥物CPA 進(jìn)行比對(duì)。藥物治療指數(shù)（TI）=藥物半數(shù)致死率（CC50）/藥物半數(shù)有效濃度（EC50）

1.6 病毒感染后不同時(shí)間加藥對(duì)RSV-A 的抑制作用

將5×103個(gè)Hep-2 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃孵育2 h 后，接種50 μL 用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋的病毒液（MOI 為0.5），之后在病毒感染的0、2、4、6、8 h 分別加入0.125 mg/mL 的貫黃感冒顆粒和20 μmol/L 的CPA，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照和病毒感染細(xì)胞對(duì)照。37℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，用CCK-8 法檢測(cè)病毒抑制率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用Excel 2013、SPSS 20.0 及GraphPad Prism 6.0 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)均采用平均值（xˉ）±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，Z 因子計(jì)算方式為Z factor =1-3×（σc+σv/|（μc-μv）|，σc表示細(xì)胞孔數(shù)值方差，σv表示病毒孔數(shù)值方差，μc表示細(xì)胞孔平均值，μv表示病毒孔平均值，Z factor 在0.5～1.0 之間證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。實(shí)驗(yàn)兩組比較運(yùn)用t檢驗(yàn)。所有圖形由Prism 6.0 繪制。

2 結(jié)果

2.1 貫黃感冒顆粒對(duì)Hep-2 細(xì)胞的毒性作用

貫黃感冒顆粒經(jīng)2 倍梯度稀釋后加入到Hep-2細(xì)胞中，48 h 后利用CCK-8 法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞的毒性。結(jié)果如表1 所示，隨著貫黃感冒顆粒藥物濃度的增加，藥物對(duì)細(xì)胞存活的抑制率呈現(xiàn)明顯的遞減趨勢(shì)，用SPSS 20.0 的Probit 回歸法計(jì)算，藥物濃度與細(xì)胞存活率之間存在線性關(guān)系［PROBIT（p）=-0.495-1.138×ln（濃度），P＜0.05］，直線擬合系數(shù)為0.898，表明直線擬合效果高，回歸方程為：Y=0.019X-0.010（X：EGCG 藥物濃度，Y：細(xì)胞存活率）。貫黃感冒顆粒的TC50為0.647 mg/mL。

將陽(yáng)性對(duì)照藥物CPA 梯度稀釋后加入到Hep-2 細(xì)胞中，以同樣的方法計(jì)算CPA 的半數(shù)毒性濃度TC50為47.73 μmol/L。見(jiàn)表1。

表1 貫黃感冒顆粒和CPA 的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)Tab 1 The toxic effect of Guanhuang Ganmao Keli and CPA on Hep-2 cells

2.2 貫黃感冒顆粒對(duì)RSV-A 的直接作用

為檢測(cè)貫黃感冒顆粒對(duì)RSV-A 的直接抑制作用，將梯度稀釋的藥物與RSV-A 孵育1 h 后接種于Hep-2 細(xì)胞檢測(cè)病毒的感染性。經(jīng)CCK-8 檢測(cè)計(jì)算結(jié)果表明，各藥物濃度梯度孵育組病毒抑制率與病毒對(duì)照組無(wú)顯著差異，且不受藥物濃度的影響，表明貫黃感冒顆粒對(duì)RSV-A 無(wú)直接殺傷作用，見(jiàn)表2。對(duì)照藥物CPA 同樣對(duì)RSV-A 無(wú)明顯地直接抑制作用。

表2 貫黃感冒顆粒和CPA 對(duì)RSV-A 的直接抑制作用Tab 2 The direct inactivation of Guanhuang Ganmao Keli and CPA on RSV-A virus

2.3 貫黃感冒顆粒對(duì)RSV-A 感染的抑制作用

不同劑量貫黃感冒顆粒對(duì)RSV-A 感染的抑制作用結(jié)果如表3 所示，貫黃感冒顆粒對(duì)RSV-A 的感染具有顯著的抑制作用，并且該抑制作用具有顯著的劑量依賴關(guān)系，經(jīng)直線回歸分析，藥物濃度與細(xì)胞存活率之間存在線性關(guān)系（P＜0.05），直線擬合系數(shù)為0.714，表明直線擬合效果高，回歸方程為：Y=0.001X-0.044（X：EGCG 藥物濃度，Y：細(xì)胞存活率）。其中貫黃感冒顆粒EC50為0.014 mg/mL，藥物治療指數(shù)TI 為46.21；陽(yáng)性對(duì)照藥物CPA 的EC50為2.52 μmol/L，TI 為20.61。

表3 貫黃感冒顆粒和CPA 對(duì)RSV-A 的抑制作用Tab 3 The inhibition of Guanhuang Ganmao Keli and CPA on RSV-A virus

2.4 不同時(shí)間給藥對(duì)RSV-A 的抑制作用

為進(jìn)一步探討貫黃感冒顆粒抑制RSV-A 在Hep-2 細(xì)胞中復(fù)制的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在RSV-A 感染Hep-2 細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)加入有效濃度的藥物，結(jié)果見(jiàn)表4。在RSV-A 感染0、2、4、6、8 h 后加入藥物，貫黃感冒顆粒在RSV-A 在病毒感染后6 h 內(nèi)加入都有明顯的抑制作用，說(shuō)明貫黃感冒顆粒不僅影響病毒過(guò)程中的穿入，而且也影響了病毒的復(fù)制過(guò)程，其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入細(xì)致地研究。陽(yáng)性對(duì)照藥物CPA 同樣具有影響病毒復(fù)制的效果。

表4 貫黃感冒顆粒和CPA 不同給藥時(shí)間對(duì)RSV-A 的抑制作用Tab 4 The inhibition of Guanhuang Ganmao Keli and CPA on RSV-A replication in different time post infection

3 討論

RSV-A 首次于1956 年在患有傷風(fēng)鼻炎的黑猩猩體內(nèi)被分離到［19］。RSV-A 被發(fā)現(xiàn)起至今的60 年多年時(shí)間，大量科學(xué)家致力于研究該病毒的防治，然而至今仍然沒(méi)有開(kāi)發(fā)出有效的疫苗和抗病毒藥物［20，21］。中醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合方案治療傳染性非典型肺炎的療效得到世界衛(wèi)生組織肯定［22］。本次席卷全球的新冠肺炎治療過(guò)程中，從《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第四版）》開(kāi)始，藿香正氣、連花清瘟、金花清感顆粒等中藥就被推薦用于新型冠狀病毒感染的預(yù)防和治療［23，24］，在我國(guó)新型冠狀病毒感染的肺炎的防治中發(fā)揮重要作用［25，26］，并得到世界范圍的廣泛認(rèn)可。貫黃感冒顆粒的主要成分為貫眾、三叉苦、黃皮葉、生姜、路邊青、馬來(lái)酸氯苯那敏，具有辛涼解毒，宣肺止咳的作用［15］，是臨床治療風(fēng)熱感冒，發(fā)熱惡風(fēng)，頭痛鼻塞，咳嗽痰多等癥的常用藥。本研究利用RSV-A 體外細(xì)胞感染模型，證明了貫黃感冒顆粒對(duì)RSV-A 具有明顯的抗病毒效果，并且進(jìn)一步通過(guò)在感染后不同時(shí)間給藥，初步證明貫黃感冒顆粒在RSV-A 感染的穿入和復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮顯著的作用，首次明確了貫黃感冒顆粒能夠治療臨床重要的呼吸道傳染病病原體之一，呼吸道合胞體病毒的感染，并探討了其抗病毒機(jī)理。天然產(chǎn)物一直是抗感染和抗癌新藥的最主要的來(lái)源，本研究為臨床應(yīng)用貫黃感冒顆粒預(yù)防和治療RSV-A 感染提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為RSV-A 新藥的開(kāi)發(fā)提供重要的參考。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

孫濤：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、作圖、文章撰寫及指導(dǎo)；吳悅、楊旭：藥物細(xì)胞毒性及抗病毒實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；劉濤：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、作圖及文章撰寫指導(dǎo)。