趙 兵，宮麗鴻，肖福龍

（1.遼寧中醫(yī)藥大學，2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的病變基礎為脂質代謝障礙，在AS 病變早期，血管內(nèi)皮受損，大量脂質堆積，誘發(fā)炎癥反應，釋放各種炎癥因子如IL-1β 等，導致斑塊形成［1］。炎癥與脂質共同參與AS 的發(fā)生、發(fā)展［2］，血脂的異常管理是動脈粥樣硬化疾病一級和二級預防的基石，每降低1 mmol/L 低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），主要心血管事件的相對風險會降低20%［3］。炎癥反應被廣泛研究，顯示在AS、冠狀動脈疾病和心肌缺血再灌注損傷的進展中發(fā)揮關鍵作用，并且在急性冠脈綜合征中具有重要作用［4，5］，其下游的炎癥因子IL-1β 是一種特征明確的促炎細胞因子，在許多炎癥性疾病中起著核心作用。AS 患者冠狀動脈的外膜血管壁中IL-1β 蛋白含量明顯增加，這種增加與AS 的嚴重程度成正比，抑制IL-1β 的生成可以改善心血管結構［6］，減少斑塊產(chǎn)生。因此，AS 早期通過各種途徑抑制炎癥因子IL-1β 的釋放、改善血脂，可以干預AS 的發(fā)展進程［7］，從而減少斑塊的產(chǎn)生。搜風祛痰法是臨床治療AS 行之有效的中醫(yī)治則［8］，前期體內(nèi)動物實驗已證實搜風祛痰中藥抗AS 及穩(wěn)定斑塊作用顯著［9，10］，在此基礎上，本研究觀察搜風祛痰中藥對動脈粥樣硬化ApoE基因敲除小鼠血脂以及IL-1β 的干預作用，從而進一步探討搜風祛痰中藥防治AS 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60 只6 周齡雄性ApoE 小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2020-0004。20 只6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（遼）2020-0001。動物實驗符合遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會標準，實驗動物倫理審查編號：21000042020038。

1.2 實驗藥品

搜風祛痰中藥：全蝎5 g，蜈蚣1 條，地龍15 g，陳皮15 g，法半夏15 g，白術15 g，水蛭15 g，加工制成含生藥2 g/mL 中藥濃縮液備用，購自遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥局；阿托伐他汀鈣片：10 mg/片（輝瑞制藥有限公司，批準文號EG6187）。

1.3 實驗試劑及儀器

蘇木素伊紅染色液（批號：G1120，北京索萊寶）；ELISA 試劑盒（批號：202104，江蘇酶標）；TC、TG、LDL-C、HDL-C 測試盒（批號：20210519 南京建成生物）。冷凍離心機、FC 型酶標儀（Thermo）；脫水機、石蠟包埋機、切片機（Leica）；CHA 型光學顯微鏡（Olympus）。

1.4 構建AS 模型

ApoE基因敲除小鼠60 只，給予1 周適應性普食后改為高脂喂養(yǎng)，飼料購買于沈陽市于洪區(qū)盛旺牧業(yè)飼料廠。13 周后，采用隨機數(shù)字表法選取4 只處死，取腹主動脈血管，HE 染色確定造模是否成功［11］。

1.5 分組與處理

取造模成功的50 只ApoE基因敲除小鼠，隨機分為模型組，搜風祛痰中藥低、中、高劑量組，阿托伐他汀組，每組10 只，繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)?？瞻讓φ战M為10 只C57BL/6J 小鼠，每日普通飼料喂養(yǎng)。根據(jù)臨床推薦成人每日劑量以及小鼠和人的等效劑量換算公式［12］，得出小鼠每日灌胃量。空白對照組和模型組小鼠予以0.3 mL/d 生理鹽水；阿托伐他汀組小鼠予以阿托伐他汀片25.4 mg·kg-1·d-1。中藥治療組的劑量在成人每日臨床口服推薦劑量的基礎上，根據(jù)人和小鼠的等效劑量換算系數(shù)算出小鼠灌胃劑量；高劑量組是中劑量組的兩倍。中劑量組是低劑量組的2 倍，所以搜風祛痰中藥各劑量組小鼠分別予以搜風祛痰中藥6.175、12.35、24.7 g·kg-1·d-1灌胃給藥，每日1 次，共13 周。實驗結束時，小鼠眼球取血，存放于抗凝管中，在4 ℃環(huán)境下，以r/min 離心15 min，分離血清并除菌，放置在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。脫頸處死小鼠，解剖并取心臟及腹主動脈，利用10%甲醛固定心臟及腹主動脈。

1.6 觀察指標及方法

1.6.1 HE 染色檢測斑塊面積 動物處死后，立即提取腹主動脈，用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋。腹主動脈樣本切成5 μm 切片，蘇木精和伊紅染色，用光學顯微鏡觀察。

1.6.2 生化自動分析儀檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C 含量 實驗結束后，小鼠眼球取血，EP 管分裝，離心取上層血清，依據(jù)說明書檢測各指標含量。

1.6.3 ELISA 法檢測IL-1β 含量 取血清，酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定指標。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠HE 染色結果

空白對照組小鼠的血管未見斑塊，腹主動脈內(nèi)膜光滑完整。模型組小鼠腹主動脈壁破損，可見大量泡沫細胞聚集，導致內(nèi)膜增厚，形成動脈粥樣硬化斑塊。搜風祛痰中藥低、中、高劑量組以及阿托伐他汀組小鼠腹主動脈內(nèi)膜均有不同程度的斑塊，但其面積均小于模型組，其中搜風祛痰中藥中劑量組斑塊面積最小。見圖1。

圖1 各組小鼠腹主動脈斑塊面積（HE 染色，×100 倍）Fig 1 Plaque area of abdominal aorta of mice in each group（HE staining，×100）

2.2 各組小鼠血脂檢測結果

與空白對照組相比，模型組TC、TG、LDL-C 含量均顯著升高（P＜0.05），而HDL-C 含量顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，搜風祛痰中藥各劑量組與阿托伐他汀組TG、TC、LDL-C 含量均顯著降低（P＜0.05），HDL-C 含 量 顯 著 升 高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C 檢測結果比較（mmol/L，n=10，±s）Tab 1 Comparison of TC，TG，LDL-C，and HDL-C levels of mice in each group（mmol/L，n=10，±s）

表1 各組小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C 檢測結果比較（mmol/L，n=10，±s）Tab 1 Comparison of TC，TG，LDL-C，and HDL-C levels of mice in each group（mmol/L，n=10，±s）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05。

組別空白對照組模型組搜風祛痰中藥低劑量組搜風祛痰中藥中劑量組搜風祛痰中藥高劑量組阿托伐他汀組HDL-C 2.360±0.190 0.870±0.130*1.260±0.210△1.850±0.180△1.360±O.170△1.710±0.100△0.002 0.001 FP TC 2.845±0.464 22.998±4.771*16.401±3.584△15.348±5.340△16.515±2.765△15.607±2.160△13.554＜0.001 TG 1.178±0.207 8.828±2.120*6.977±1.047△4.520±0.743△6.748±1.290△4.638±0.773△5.626＜0.001 LDL-C 0.230±0.089 6.500±1.701*3.570±1.384△2.440±0.462△3.210±1.104△2.600±1.714△2.517 0.001

2.3 各組小鼠血清IL-1β 檢測比較

與空白對照組相比，模型組IL-1β 表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，搜風祛痰中藥各劑量組與阿托伐他汀組IL-1β 表達水平均顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血清IL-1β 含量比較（pg/g，n=10，±s）Tab 2 Comparison of serum IL-1β levels of mice in each group（pg/g，n=10，±s）

表2 各組小鼠血清IL-1β 含量比較（pg/g，n=10，±s）Tab 2 Comparison of serum IL-1β levels of mice in each group（pg/g，n=10，±s）

注：與空白對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05。

組別空白對照組模型組搜風祛痰中藥低劑量組搜風祛痰中藥中劑量組搜風祛痰中藥高劑量組阿托伐他汀組F P IL-1β 21.458±1.833 23.465±1.177*23.103±0.842△22.630±1.055△23.158±1.099△22.649±1.074△3.020 0.006

3 討論

脂質和炎癥因子的異常是AS 發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，改善血脂、減少相關炎癥因子可降低心血管事件的發(fā)生。脂蛋白沉積造成斑塊形成是誘發(fā)AS 的常見原因，降低脂蛋白、血漿膽固醇水平在一定程度上能夠逆轉AS 的發(fā)生、發(fā)展［13］。IL-1β 是最早與AS 發(fā)病機制有關的炎癥因子之一，研究證明各種炎性體刺激物誘導成熟IL-1β 的產(chǎn)生有助于AS 斑塊的形成［14］，Ridker 等［15］的臨床試驗表明，以IL-1β 為靶點的卡納單抗治療AS 具有可行性，抑制IL-1β 在改善AS 方面具有強大功效［16］，干擾IL-1β的臨床治療干預措施可以改善心血管結構，開創(chuàng)了AS 抗炎療法的新時代［6］，顯示其在預防未來的心血管事件中的重要意義。此外，IL-1β 水平升高與血脂異常因素相關［17］，通過促進Ox-LDL 的攝取影響膽固醇穩(wěn)態(tài)［18］，所以在抑制IL-1β 生成的同時，也起到了對血脂的改善作用，并且能降低心血管疾病的風險。

他汀類藥物降低血脂的臨床功效被廣泛認可，并與LDL-C 的降低成正比［19］，而且阿托伐他汀可降低IL-1β 等相關炎癥因子的形成，抑制細胞凋亡［20］。由于阿托伐他汀對IL-1β 以及血脂都有一定的影響，因而本實驗選擇阿托伐他汀作為對照藥。

AS 據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸于“胸痹”、“真心痛”等范疇，治療多以活血化瘀、溫經(jīng)散寒、通陽豁痰等治法［21］。宮麗鴻教授根據(jù)西醫(yī)學“心血管事件鏈”概念，提出中醫(yī)學AS 事件鏈假說：“虛-痰-瘀-毒（熱）-風”，用風痰理論創(chuàng)新性解釋了AS 的發(fā)生與發(fā)展［22］。老年人脾胃虛弱、嗜食肥甘厚味或情志失調，可影響脾胃運化功能，水濕津液停滯則生痰濁。痰濁日久、年老腎虛或情志內(nèi)傷等，可致氣血運行不暢，瘀血內(nèi)生，阻滯心脈，隨著病程進一步發(fā)展，臨床表現(xiàn)為心絞痛劇烈、疼痛持續(xù)時間長、舌質紫絳或舌苔厚膩、脈弦滑或弦緊而數(shù)等。此時病機為痰濁與瘀血相互影響，不能排出，交結蓄積，日久可化生為毒（熱），毒（熱）邪積久可生“風”，“風”有“善行而數(shù)變”之性，運用取類比象法，類似于AS 不穩(wěn)定斑塊臨床表現(xiàn)，因此提出“虛”是AS 發(fā)病基礎，“痰-瘀-毒（熱）”為AS 發(fā)病條件，“風”為AS 斑塊“不穩(wěn)定性”，故宮麗鴻教授總結多年臨床經(jīng)驗，認為“風痰”是引起AS 的主要病因［23，24］，以《醫(yī)學衷中參西錄》中逐風湯化裁擬定搜風祛痰中藥，對心血管疾病的治療具有顯著效果。方中全蝎、蜈蚣具有搜風解痙、通絡止痛的功效，兩者合用其力相得益彰，地龍通絡活絡，三者共為君藥；陳皮、半夏、白術為臣藥，既可健脾化濕，又可化痰散結，使運化得復，痰飲得降；水蛭破瘀為佐藥。

本研究結果表明，通過HE 染色觀察，空白對照組腹主動脈無明顯斑塊出現(xiàn)，模型組顯示斑塊較多，搜風祛痰中藥各劑量組以及阿托伐他汀組斑塊面積較模型組均減少，通過檢測斑塊面積說明搜風祛痰中藥和阿托伐他汀對動脈粥樣硬化的治療有一定效果。而血管內(nèi)皮受到損傷后，脂質堆積，IL-1β 被激活，故模型組血脂出現(xiàn)異常現(xiàn)象，IL-1β 的表達水平增高。搜風祛痰中藥與阿托伐他汀均可改善血脂，減少IL-1β 的生成，故TG、TC、LDL-C、IL-1β 表達水平降低，HDL-C 表達水平增高。

綜上所述，搜風祛痰中藥可抑制細胞炎癥反應的進展，下調IL-1β 的表達，減少斑塊脂質含量，改善血脂，這可能是搜風祛痰中藥早期治療動脈粥樣硬化的分子機制之一。