陳夢婷，董志國，張殷建，田源

青光眼是一種致盲性眼病，以特征性視神經(jīng)萎縮以及視野缺失為主要特征，病理性眼壓增高是其主要危險因素[1]。2020 年全球范圍內(nèi)青光眼患者預估有7，600 萬[2]，到2040 年可能會達到1.118 億，對于青光眼篩查和治療不可懈怠[3]。青光眼會引起不可逆性的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGC）損傷，如何抑制RGC 凋亡，保護視神經(jīng)成為治療青光眼的關鍵。中醫(yī)藥在慢性青光眼的治療中有一定優(yōu)勢，受到越來越多的重視。清肝利水方（QGLS）是上海市名老中醫(yī)、眼科專家鄒菊生治療青光眼的臨床經(jīng)驗方，應用多年，取得了良好的效果。課題組前期基礎研究[4-5]也證實了其有抑制RGC 細胞凋亡的作用，本研究擬進一步探究其保護RGC 的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗選用6～8 周齡清潔級健康雄性SD 大鼠20 只，體重（150±30）g，上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于復旦大學動物實驗中心，溫度維持在21℃左右，12 h 光/暗循環(huán)照明，常規(guī)飼料飼養(yǎng)，給予充足的水和活動空間。相關實驗操作均符合動物倫理及動物中心相關管理辦法。

1.2 主要儀器、試劑與藥物

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠，RE-2000A），OPMI VISU 顯微鏡（德國Carl Zeiss Jena 公司，OPMI Lumera300），高速離心機（德國Eppendorf 公司，Centrifuge 5810R），酶標儀（美國Biotek 公司，SynergyH4）、電泳儀（美國BIO-RAD 公司，PowerPacBasic Power Supply 164-5050）、小型電泳槽（美國BIO-RAD 公司，Mini-PROTEAN Tetra Cell 1658001）、轉(zhuǎn)移脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造有限公司，TS-8）、凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司，Chemiscope 6300）、電子天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司，ME104）、流式細胞儀（美國BD 公司，F(xiàn)ACS Verse）。

RGC-5 細胞（中國科學院細胞庫），水合氯醛、烏拉坦、甲醇、無水乙醇（國藥集團工業(yè)股份有限公司，30037527、H37022259、67561、64175），B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（杭州華安生物技術有限公司，ET1702-53），瞬時受體電位陽離子通道6（transient receptor potential channel 6，TRPC6）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）、β-actin、二抗（美國CST公司，16716、14220、14796、4970、7074），PAGE 凝膠試劑盒、蛋白Marker、化學發(fā)光液（上海雅酶生物科技有限公司，PG112、WJ102、Omni-ECT SQ202）。

QGLS 水煎劑：QGLS 由夏枯草12 g、葛根15 g、車前子15 g、枸杞子12 g 組成。生藥購于上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中藥房，由上海華宇藥材有限公司提供，加入7 倍生藥重量體積水沸騰煎煮2 次后濃縮至1 倍體積生藥重量，無菌陰干制備成藥物浸膏，使用前加入適量體積水溶解成需要濃度。

1.3 缺氧缺糖-復氧復糖損傷模型的建立

配制終濃度為100 mM 的CoCl2溶液（使用時加入無糖DMEM 稀釋），RGC-5 細胞以1×104個/孔鋪于96 孔板中，每孔100 μL，分為6 組，每組6 個復孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后無血清的DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)24h。正常對照組加入正常無血清DMEM，其余5 組分別加入CoCl2濃度為100、200、400、600、800 μM的無糖DMEM，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h 后更換培養(yǎng)液為無血清的培養(yǎng)液復氧復糖24 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，1 h 后于酶標儀450 nm 波長測其OD 值，篩選出最佳的造模時間及濃度。結果進行至少3 次重復實驗。

1.4 細胞毒性試驗

制備QGLS 含藥血清：將20 只SD 大鼠（150±30）g 稱重，分為正常對照組（CG）、清肝利水方低、中、高濃度組（LQGLS、MQGLS、HQGLS），每組5 只。CG 大鼠灌胃飲用水2 mL/d，其余各組每日灌胃1 次低、中、高濃度QGLS（為3.1、6.2、12.4 g/kg，按人與動物之間體表面積關系換算得出該水煎劑的正常給藥量為6.2 g/kg，低、高濃度組給藥量為正常給藥量的1/2 倍和2 倍），各組灌胃體積相同。連續(xù)灌胃4 d，于末次灌胃1.5～2 h 后進行腹主動脈取血。取血后將血液室溫靜置15min 后，3000rpm 離心10min 得到上清液，將上清液置于56℃水浴滅菌30 min，0.22 μM 過濾網(wǎng)過濾分裝，最后-20℃冰箱保存。

細胞毒性實驗：RGC-5 細胞以1×104個/孔鋪于96 孔板，每孔100 μL，每組6 個復孔，培養(yǎng)24 h 后換液為無血清的DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再將各組含藥血清均以3%、5%、10%、20%的濃度分別干預細胞，CG 加入無血清DMEM，培養(yǎng)24 h 后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，1 h 后于酶標儀450 nm 波長測其OD 值。3 次重復實驗結果后，取各組均無細胞毒性的含藥濃度作為干預濃度。

1.5 QGLS 藥效實驗

RGC-5 細胞以1×104個/孔鋪于96 孔板，分為CG、模型組（MG）、LQGLS、MQGLS、HQGLS 組，每組6 個復孔。培養(yǎng)24 h 后換為無血清培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，CG、MG 加入含大鼠空白血清的DMEM，各中藥濃度組加QGLS 含藥血清DMEM，各組均培養(yǎng)24 h，MG 及各中藥濃度組換液為已篩選好濃度的含CoCl2的無糖DMEM 造模，CG 換液為無血清DMEM，適當時間后，棄造模液，各組均加入無血清DMEM 復氧復糖24 h。最后每孔加入10 μL CCK-8試劑1 h 后，于酶標儀450 nm 波長下測其OD 值。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

RGC-5 細胞以2×105個/孔鋪于6 孔板中，每孔2 mL，分 為CG、MG、LQGLS、MQGLS、HQGLS，每 組做3 個復孔。干預造模等全部操作完成后，棄培養(yǎng)液，PBS 沖洗后收集細胞于Falcon 流式管，1，200 rpm離心5 min，棄上清，加入200 μL 的Binding buffer重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-APC 避光孵育15 min。再1，500 rpm 離心3 min，棄上清，吸取100 μL的Binding buffer 重懸細胞并加入5 μL PI 染液染色5 min，將Binding buffer 補足至300 μL，上流式細胞儀檢測。

1.7 Western Blot 檢測

RGC-5 細胞以2×105個/孔鋪于6 孔板中，每孔2 mL，分為CG、MG、LQGLS、MQGLS、HQGLS 組，每組做3 個孔，中藥干預造模后，棄上清液，收集各組細胞，提取不同干預組細胞總蛋白，蛋白濃度測定后，經(jīng)凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h 后加一抗（β-actin、TRPC6、Caspase-3、Bax，兔抗鼠單克隆抗體）4℃暗盒過夜，TBST 洗膜后加入相應的二抗（抗兔IgG、HRP 抗體）37℃孵育1 h，TBST 洗膜，采用ECL 熒光底物進行化學發(fā)光、顯色，于凝膠成像儀拍照，以Image J 進行灰度分析。目的蛋白相對表達量=目的蛋白表達量/同一樣本內(nèi)參表達量。

1.8 Fluo-3 AM 熒光探針Ca2+檢測

RGC-5 細胞以2×105個/孔鋪于6 孔板中，每孔2 mL，分為CG、MG、LQGLS、MQGLS、HQGLS 組，每組做3 個復孔，所有給藥干預后棄培養(yǎng)液，PBS 沖洗，胰酶消化后加入無血清DMEM 1，300 rpm 離心3 min，棄上清加入含終濃度為4 μM Fluo-3 AM 的無血清DMEM 溶液，和細胞一起置于37℃避光孵育30 min后進行熒光探針裝載，離心后PBS 洗滌，加入PBS重懸細胞并再適當孵育20～30 min，使用Fluo-3 AM熒光探針對細胞內(nèi)Ca2+進行熒光標記，運用流式細胞儀進行Ca2+檢測，激發(fā)波長為488 nm，以熒光強度表示細胞內(nèi)Ca2+濃度。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料，方差分析（ANOVA）進行多組變量間的比較，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，當P＜0.05 時被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 QGLS 對RGC-5 細胞存活率的影響

建立缺氧缺糖-復氧復糖細胞損傷模型，篩選出各組QGLS 含藥血清濃度無細胞毒性的濃度范圍為0%～5%，因此選取最高5%濃度作為各組干預濃度（表1）。缺氧缺糖再復氧復糖后，發(fā)現(xiàn)12 h 后各濃度細胞存活率明顯下降，且與CoCl2的濃度呈負相關（圖1A、1B、1C）。缺氧缺糖處理24 h，600 μM CoCl2細胞存活率為（62.5±2.3）%，選取此時間及造模濃度。各組QGLS 干預后，MG 細胞存活率為（63.9±3.5）%，LQGLS、MQGLS、HQGLS 存活率分別為（93.3±2.1）%、（79.2±3.0）%、（44.5±2.6）%，較CG 均降低，差異有統(tǒng)計學意義（tMG=31.286，tLQGLS=8.611，tMQGLS=20.774，tLQGLS=61.477，均P=0.000）；LQGLS、MQGLS 較MG 存活率顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（tLQGLS=25.401，tMQGLS=11.805，均P=0.000）（圖1D）。

圖1 細胞存活率。1A、1B、1C 分別表示分別處理12、24、48 h 再進行復氧復糖24 h 后的各時間點各濃度細胞存活率；1D 表示加入5%低、中、高濃度QGLS 含藥血清預處理24 h 后再進行缺氧缺糖-復氧復糖造模后的細胞存活率，缺氧缺糖時間為24 h

表1 各組含藥血清細胞存活率（，%）

表1 各組含藥血清細胞存活率（，%）

注：* 與本組含藥血清濃度0%比較，P＜0.05；CG 正常對照組；LQGLS、MQGLS、HQGLS 分別為清肝利水方低、中、高濃度組

2.2 QGLS 對RGC-5 細胞凋亡率的影響

本實驗中使用Annexin V-APC／PI 復染法檢測細胞凋亡（圖2）。CG 細胞凋亡率為（6.13±1.11）%，MG 細胞凋亡率為（41.73±3.15）%，其他各組細胞凋亡率分別為LQGLS（18.34±1.86）%、MQGLS（18.32±1.92）%、HQGLS（36.94±2.63）%，各實驗組較CG 細胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學意義（tMG=15.035，tLQGLS=7.961，tMQGLS=7.752，tHQGLS=15.214，均P=0.000），LQGLS、MQGLS 較MG 降低，差異均有統(tǒng)計學意義（tLQGLS=9.020，tMQGLS=8.953，均P=0.000），HQGLS 組與MG 組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 細胞凋亡情況。2A、2B、2C、2D、2E 分別表示CG、MG、LQGLS、MQGLS、HQGLS 細胞凋亡的情況。十字象限左上表示壞死細胞，左下表示正常細胞，右上表示晚期凋亡細胞，右下表示早期凋亡細胞。2F 表示各組細胞凋亡率。

2.3 QGLS 對TRPC6、Bcl-2、Bax、Caspase-3 的影響

細胞缺氧缺糖-復氧復糖損傷后，TRPC6 表達MG、LQGLS、MQGLS 較CG 升高（tMG=13.331，P=0.000；tLQGLS=5.756，P=0.000；tMQGLS=5.385，P=0.001），而MQGLS、HQGLS 較MG 降低（tMQGLS=7.365，tHQGLS=9.075，均P=0.000），LQGLS 較MG 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Caspase-3 表達MG 較CG 顯著升高（tMG=39.004，P=0.000），LQGLS、MQGLS、HQGLS 較MG 均顯著下降（tLQGLS=4.816，P=0.001；tMQGLS=35.131，P=0.000；tHQGLS=28.227，P=0.000）；Bax 表達MG 較CG顯著升高（tMG=17.374，P=0.000），LQGLS、MQGLS、HQGLS 較MG 均顯著下降（tLQGLS=14.912，tMQGLS=10.194，tHQGLS=12.838，均P=0.000）；Bcl-2 表達MG、LQGLS 較CG 顯著下降（tMG=9.466，tLQGLS=6.135，均P=0.000），LQGLS、MQGLS、HQGLS 較MG 均升高（tLQGLS=8.871，tMQGLS=12.729，tHQGLS=9.298，均P=0.000）（圖3、表2）。

圖3 各組TRPC6、Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白相對表達水平

表2 各組TRPC6、Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白相對表達水平（，n=5）

表2 各組TRPC6、Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白相對表達水平（，n=5）

注：* 與CG 比較，P＜0.05；# 與MG 比較，P＜0.05；CG 正常對照組；MG 模型組；LQGLS、MQGLS、HQGLS 分別為清肝利水方低、中、高濃度組；Bcl-2 B 細胞淋巴瘤-2；TRPC6 瞬時受體電位陽離子通道6；Caspase-3 半胱氨酸蛋白酶-3；Bax Bcl-2 相關X 蛋白

2.4 QGLS 對細胞內(nèi)Ca2+的影響

使用FACS 軟件分析結果，CG、MG 細胞內(nèi)Ca2+熒光強度分別為：（5.33±0.74）和（41.51±3.59），LQGLS、MQGLS、HQGLS 細胞內(nèi)Ca2+熒光強度分別為：（16.71±2.63）、（21.52±2.80）、（36.21±2.33），MG、LQGLS、MQGLS、HQGLS 細胞內(nèi)Ca2+熒光強度較CG均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（tMG=13.960，P=0.000；tLQGLS=5.889，P=0.001；tMQGLS=7.877，P=0.000；tHQGLS=17.815，P=0.000）。LQGLS、MQGLS 較MG細胞內(nèi)Ca2+濃度顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（tLQGLS=7.881，tMQGLS=6.204，均P=0.000），HQGLS 較MG 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

目前，臨床上治療青光眼的方法仍以降眼壓為主，降眼壓可以有效控制一部分青光眼患者視野缺失，減緩視神經(jīng)萎縮以及緩解眼部不適癥狀，但降眼壓藥水帶來的諸如眼干澀、結膜充血等副作用明顯，并且部分患者在降眼壓治療處理后仍無法阻止視野及視盤損害[6-7]。鄒菊生[8]認為本病病位在肝，病機是情志不暢致肝失疏泄，日久肝郁氣滯而化火，肝火上擾于目，致使目中脈絡阻滯，玄府郁閉，神水滯留，運行不暢，而導致眼脹視物膜糊，久則損害目系，故創(chuàng)立清肝利水方（QGLS）。該方以夏枯草、葛根清肝瀉火為君，車前子利水為臣，佐以枸杞子補肝腎明目，共筑清肝利水明目之效。課題組在前期臨床研究[8]中發(fā)現(xiàn)，較單純使用降眼壓滴眼液，肝郁氣滯型原發(fā)性開角型青光眼患者采用QGLS 聯(lián)合降眼壓滴眼液總有效率升高，且在視力、視力平均敏感度及全身癥狀均改善明顯。

細胞凋亡通過激活Caspase 來介導，細胞凋亡的效應器Caspase 與一些底物反應，導致凋亡細胞發(fā)生特有的生化和形態(tài)學改變，形成凋亡復合體被吞噬細胞吞噬[9-10]。Bcl-2 家族蛋白是細胞凋亡的關鍵調(diào)節(jié)因子，主要作用于線粒體外膜[11]，它會促進細胞存活而不促進細胞增殖[12-14]。Semaan 等[15]發(fā)現(xiàn)敲除Bax 基因的小鼠對神經(jīng)損傷后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡通路有永久性阻斷作用。本實驗中，模型組RGC-5 細胞中Caspase-3、Bax 表達水平較對照組明顯上升，并且Bcl-2 表達水平下降，表明造模后，由于細胞缺血缺氧，RGC 凋亡明顯，而中藥組Caspase-3、Bax 表達水平較模型組明顯下降，Bcl-2表達上升，說明QGLS 抗RGC 凋亡的機制與提高Bcl-2 的表達和降低Bax 的表達有關。

RGC 是一種神經(jīng)元，位于RGC 層，可以從光感受器接收視覺信息，并以產(chǎn)生動作電位的形式傳遞視覺信息使其形成在視網(wǎng)膜上[16]，視網(wǎng)膜病變引起的神經(jīng)元結構變化以RGC 的變化最為顯著[17-18]，目前明確認為RGC 的凋亡是漸進而不可逆的[19-21]。

TRPC6 屬于TRPC 基因家族[22-24]，是一種通透膜通道蛋白，是Ca2+滲透性的非選擇性陽離子通道[25-26]，參與神經(jīng)元存活與凋亡[27]，其分布在視網(wǎng)膜上的具體位置主要位于RGC[28-29]，對RGC 在缺血前具有早期神經(jīng)保護作用[30]。本次實驗中，Western Blot 結果顯示模型組的RGC-5 細胞中TRPC6 蛋白表達較對照組顯著上升，表明造模后RGC 損傷嚴重，TRPC6應激性升高，而QGLS 低、中、高劑量組較模型組的TRPC6 蛋白表達水平明顯下降，已知TRPC6 對RGC 具有保護作用，QGLS 各劑量組均降低了此蛋白表達，可能由于QGLS 保護了RGC，延緩了TPRC6 信號通道的激活。

Ca2+作為細胞內(nèi)的第二信使，參與轉(zhuǎn)錄因子的激活、細胞增殖與凋亡、蛋白質(zhì)的修飾等細胞內(nèi)生理活動[31]。細胞內(nèi)外Ca2+濃度梯度差異是其信號傳導的前提和重要條件[32]，Ca2+內(nèi)流導致細胞內(nèi)Ca2+超載會最終導致RGC-5 細胞的凋亡[33]。本次實驗，模型組細胞內(nèi)Ca2+明顯增加而導致細胞損傷，用藥后，QGLS 中、高劑量組細胞內(nèi)Ca2+濃度下降，表示QGLS 抑制了Ca2+內(nèi)流并提高線粒體膜電位，降低線粒體促凋亡信號因子Caspase-3 的表達，抑制RGC-5 細胞的凋亡。

雖然中藥復方的成分復雜多樣，而且作用機制和靶點不一，但通過此實驗，初步發(fā)現(xiàn)QGLS 抑制慢性青光眼RCG 凋亡，保護視神經(jīng)的作用機制可能是通過降低TRPC6 的表達以減少Ca2+內(nèi)流來實現(xiàn)的，并且在RGC-5 缺氧缺糖-復氧復糖細胞損傷模型中也有一定的保護作用。未來需要進行更深入的研究以明確QGLS 對視神經(jīng)細胞的保護作用。