李亞嬌， 馬培杰， 龍忠富， 舒健虹， 陳 瑩， 王小利

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所， 貴州 貴陽 550006)

低磷和干旱脅迫影響植物的形態(tài)、生理和生物化學(xué)過程，降低其光合作用[1]，同時(shí)其在植物細(xì)胞的伸長(zhǎng)和分裂[2]，能量代謝、細(xì)胞膜的合成等方面起著抑制作用[3]。低磷和干旱脅迫還會(huì)抑制植物對(duì)養(yǎng)分的吸收，抑制相關(guān)功能基因和結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[4-6]。代謝物在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用，非生物脅迫下，代謝產(chǎn)物參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、能量?jī)?chǔ)存、膜的形成以及整個(gè)植物物質(zhì)的分配[7]。各種逆境脅迫會(huì)造成植物各種代謝酶活性抑制、底物短缺、對(duì)某些化合物的過度需求，影響植物正常物質(zhì)代謝活性[8]。面對(duì)各種脅迫，植物會(huì)重新分配代謝物質(zhì)反應(yīng)流程，包括初級(jí)或次級(jí)代謝物質(zhì)，以便于調(diào)節(jié)植物細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程、氧化還原穩(wěn)定性、離子轉(zhuǎn)運(yùn)和酶活性，以維持植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中必要的物質(zhì)代謝[9-10]。

隨著高通量檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，代謝組學(xué)已經(jīng)滲透到多個(gè)領(lǐng)域。在植物研究中，代謝組學(xué)現(xiàn)在被認(rèn)為是不同分子生物學(xué)研究中廣泛使用的重要生物技術(shù)工具[11-12]。許多研究利用代謝組學(xué)探究植物在應(yīng)對(duì)不同環(huán)境脅迫(包括干旱、鹽、熱、冷和光脅迫等)時(shí)的代謝物變化[13-14]。代謝物分析方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于植物對(duì)逆境脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制，并用來評(píng)估某一特定代謝物類或途徑中的代謝物水平[15-16]，包括用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、核磁共振(NMR)、高效液相色譜(HPLC)和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜(CE-MS)等多種方法鑒定植物、動(dòng)物和微生物在各種逆境脅迫下的代謝物反應(yīng)機(jī)制[17-18]。代謝組學(xué)可以通過測(cè)量參與各種生化過程的代謝物來揭示這些復(fù)雜的機(jī)制[19]。為了應(yīng)對(duì)非生物脅迫，植物可以調(diào)節(jié)其代謝網(wǎng)絡(luò)，合成一系列代謝物，以幫助其修復(fù)損傷[20]。百脈根(Lotuscorniculatus)屬多年生草本植物，具有改良土壤的功能，也是優(yōu)良的蜜源和藥用植物[21]。目前，關(guān)于百脈根在低磷和干旱脅迫下代謝物的變化的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在利用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)技術(shù)，研究低磷和干旱脅迫下百脈根的代謝產(chǎn)物變化，以對(duì)進(jìn)一步研究百脈根抵御低磷和干旱脅迫的機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、處理和取樣

百脈根于貴州省草業(yè)研究所人工氣候室內(nèi)種植(光照16 h，黑暗8 h，生長(zhǎng)溫度25℃)，先于11 cm×15 cm的花盆內(nèi)撒播種植，2～3葉時(shí)移栽入蒸餾水配置的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液瓶中?？瞻讓?duì)照(CK)：pH為8.1±0.5的1/8-霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，添加10 mmol·L-1的NaHCO3，NH4H2PO4的濃度為0.25 mmol·L-1。低磷(LP)：pH為8.1±0.5的1/8-霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，添加10 mmol·L-1的NaHCO3。20%干旱脅迫(PEG)：pH為8.1±0.5的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，添加10 mmol·L-1的NaHCO3，NH4H2PO4的濃度為0.25 mmol·L-1，添加200 g·L-1的聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG-6000)。每瓶5株苗，每3天換1次營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)1個(gè)月后收獲，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定和樣品采集。

1.2 代謝組樣品處理和數(shù)據(jù)分析

本項(xiàng)目選取未處理的對(duì)照組(CK)、低磷(LP)和干旱脅迫(PEG)3組樣本，每組6個(gè)樣品，共計(jì)18個(gè)樣品進(jìn)行代謝物測(cè)定。代謝物提取流程：稱取50 mg樣本，加入1 000 μL含有內(nèi)標(biāo)(1 000∶2)的提取液(甲醇乙腈水體積比2∶2∶1，內(nèi)標(biāo)濃度 2 mg·L-1)，渦旋混勻30 s；加入瓷珠，45 Hz研磨儀處理10 min，超聲10 min(冰水浴)；-20℃靜置1 h；將樣本在4℃下，12 000 r·min-1離心15 min；小心地取出500 μL上清液于EP管中；在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入160 μL提取液(乙腈和水體積比1∶1)復(fù)溶；渦旋混勻30 s，冰水浴超聲10 min；將樣本在4℃下，12 000 r·min-1離心15 min；小心地取出120 μL上清液于2 mL進(jìn)樣瓶，每個(gè)樣本各取10 μL混合成QC樣本并上機(jī)檢測(cè)。用于代謝組學(xué)分析的液-質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)由沃特世Acquity I-Class PLUS超高效液相串聯(lián)沃特世Xevo G2-XS QTof高分辨質(zhì)譜儀組成，所使用色譜柱為購自沃特世的Acquity UPLC HSS T3色譜柱(1.8 μm,2.1×100 mm)。使用MassLynx V4.2采集的原始數(shù)據(jù)通過Progenesis QI軟件做峰提取、峰對(duì)齊等數(shù)據(jù)處理操作，基于Progenesis QI軟件在線METLIN數(shù)據(jù)庫及百邁客自建庫進(jìn)行鑒定，同時(shí)進(jìn)行理論碎片識(shí)別，質(zhì)量數(shù)偏差均在100 ppm以內(nèi)[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 百脈根低磷和干旱脅迫下外觀特征

百脈根經(jīng)過低磷和干旱脅迫處理生長(zhǎng)一個(gè)月與對(duì)照相比，百脈根地上部分長(zhǎng)勢(shì)明顯變?nèi)酰o變短、葉減少(圖1A，圖1B)。百脈根地下根系部分長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酰鞲兌?，?cè)根大量減少(圖1C，圖1D)。

圖1 百脈根在低磷和干旱脅迫下的外觀特征Fig.1 Appearance characteristics of Lotus Corniculatus L. with low phosphorus and drought stress

2.2 質(zhì)譜分析體系建立

樣品的重復(fù)相關(guān)性評(píng)估至關(guān)重要，相關(guān)性分析可以評(píng)估組內(nèi)樣品之間的生物學(xué)重復(fù)。同時(shí)組內(nèi)樣品相對(duì)組間樣品的相關(guān)系數(shù)越高，獲得的差異代謝物越可靠。將斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)r(Spearman Rank Correlation)作為生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性的評(píng)估指標(biāo)。r2越接近1，說明2個(gè)重復(fù)樣品相關(guān)性越強(qiáng)。結(jié)果見圖2A，2個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)間的相關(guān)系數(shù)均在較好的范圍內(nèi)。聚類分析是對(duì)樣品指標(biāo)進(jìn)行分類的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法[23]，由圖2C中得知，不同的處理間代謝物有上調(diào)也有下調(diào)。從圖2B中可以看出，干旱和低磷脅迫處理組和對(duì)照組6個(gè)重復(fù)的數(shù)據(jù)點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果都很好地被分成3組，并分別集中在一起，說明在整個(gè)試驗(yàn)過程中系統(tǒng)誤差較小，數(shù)據(jù)可重復(fù)性很好，可用于后續(xù)分析。干旱脅迫、低磷脅迫和對(duì)照百脈根葉片在PC1上有明顯分離，PC1的貢獻(xiàn)率為56.42%，而PC2貢獻(xiàn)率則為22.31%，表明3組樣品間的代謝調(diào)控不同。其次，從圖2D可以看出3組樣品的數(shù)據(jù)點(diǎn)在空間上可以明顯區(qū)分，表明3組樣品的代謝產(chǎn)物在種類、數(shù)量和濃度等方面存在差異。因此，對(duì)代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步分析，可揭示貴州天然豆科牧草百脈根耐旱耐貧瘠的調(diào)控機(jī)制。

圖2 全部樣品質(zhì)譜分析體系圖Fig.2 Quality spectrum analysis system diagram of all samples注：A：樣品間相關(guān)性圖；B：代謝物質(zhì)聚類圖；C：所有樣本的主成分分析PCA圖；D：所有樣本的主成分分析PCA-3D圖Note:A:correlation diagram between samples；B:Cluster diagram of metabolites；C:PCA diagram of all samples；D:PCA-3D diagram of all samples

2.3 主成分分析

由圖3A(干旱處理)和圖3B(低磷處理)可知，干旱和低磷處理百脈根葉片相對(duì)于對(duì)照組CK在PC1上有明顯分離，PC1的貢獻(xiàn)率分別為66.67%和78.11%，而PC2貢獻(xiàn)率則為13.38%和10.44%，其中百脈根代謝葉片響應(yīng)干旱的第一主成分大于其響應(yīng)低磷第一主成分的方差貢獻(xiàn)率，說明低磷脅迫條件下百脈根的代謝表型較干旱變化更為劇烈?？傮w來看，對(duì)照組與百脈根兩個(gè)脅迫處理組間的代謝表型差異明顯，代謝調(diào)控不同。

圖3 百脈根脅迫處理主成成分分析Fig.3 PCA analysis of Lotus Corniculatus under stress

2.4 差異代謝物篩選

用t檢驗(yàn)和正交偏最小二乘法判別方法的VIP值相結(jié)合的方法來篩選差異代謝物，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05和VIP值>1。各種差異代謝物數(shù)目統(tǒng)計(jì)如表1所列，從表中可看出，干旱脅迫的差異代謝物最多，為390種，而低磷脅迫理的差異代謝物則只有332種，說明代謝物質(zhì)變化在干旱脅迫中更為復(fù)雜。兩種脅迫處理中，差異代謝物主要以上調(diào)為主，其中干旱和低磷脅迫上調(diào)代謝物分別占80.51%和62.95%。韋恩圖(圖4)中顯示，兩組脅迫處理共同差異代謝物達(dá)151種，火山圖(Volcano plot)是綜合差異倍數(shù)分析和t檢驗(yàn)的一種單變量分析方法。圖中矩形所圈的點(diǎn)為變化倍數(shù)(Fold change)，其大于2.0且P<0.05的代謝物，即單變量統(tǒng)計(jì)分析篩選的差異代謝物。從火山圖中也可以清楚的對(duì)比出上調(diào)的差異代謝物和下調(diào)的差異代謝物(圖5A，圖5B)。

圖4 差異代謝物數(shù)量韋恩圖Fig.4 Wenn plot of differential metabolites

圖5 差異代謝物火山圖Fig.5 Volcanic map of differential metabolites注：火山圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)代謝物，橫坐標(biāo)代表該組對(duì)比各物質(zhì)的倍數(shù)變化(取以2為底的對(duì)數(shù))，縱坐標(biāo)表示t檢驗(yàn)的P值(取以10為底的對(duì)數(shù))，散點(diǎn)大小代表OPLS-DA模型的VIP值，散點(diǎn)越大，VIP值越大，篩選得到的差異表達(dá)代謝物越可靠。圖中灰色的點(diǎn)代表下調(diào)差異表達(dá)代謝物，黑色的點(diǎn)代表上調(diào)差異表達(dá)代謝物，比較淺色的點(diǎn)代表檢測(cè)到但差異不顯著的代謝物Note:Each dot of volcano represents a metabolite in the figure,the abscissa represents the group contrast ratio of each material change (with 2 logs base),the vertical represents the P-t test value (in the logarithm of 10 at the bottom),the size of scatter represents the VIP value of OPLS-DA model,the larger the scatter,the greater the VIP value,the differential expressed metabolites obtained by screening are more reliable. Grey dots in the figure represent downregulated and differentially expressed metabolites,black dots represent up-regulated and differentially expressed metabolites,and light dots represent detected but not significantly different metabolites

表1 差異代謝物統(tǒng)計(jì)Table 1 Differential metabolite statistics

2.5 差異代謝物定量分析

對(duì)所檢測(cè)到的代謝物進(jìn)行定性和定量分析后，可先比較在各分組中代謝物定量信息發(fā)生的差異倍數(shù)變化。根據(jù)VIP值選擇差異代謝物上調(diào)顯著前20個(gè)和下調(diào)顯著前20個(gè)進(jìn)行熱圖繪制(圖6)，低磷和干旱脅迫處理與對(duì)照相比代謝物上調(diào)顯著共同有meta_225、meta_344和meta_574三個(gè)代謝物。低磷和干旱脅迫處理與對(duì)照相比，代謝物下調(diào)顯著的有meta_493，meta_588，meta_627，meta_728，meta_819，meta_821，meta_900，meta_913和meta_960等9個(gè)代謝物。

圖6 低磷和干旱脅迫下差異代謝物定量熱圖Fig. 6 Quantitative heat map of differential metabolites under low phosphorus and drought stress注：第一列為上調(diào)顯著的前20個(gè)代謝物，第二列為下調(diào)顯著的前20個(gè)代謝物Note：The first column showed the first 20 metabolites significantly up-regulated,and the second column showed the first 20 metabolites significantly down regulated

2.6 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異代謝物進(jìn)行注釋，將篩選出的差異代謝物映射到KEGG通路上，并將其在KEGG通路圖上進(jìn)行標(biāo)記。分析結(jié)果顯示，干旱脅迫差異物質(zhì)共映射到70條代謝通路，主要聚類為脂肪?；Ⅳ人峒捌溲苌?、有機(jī)氧化合物、類黃酮、甘油磷脂、異黃酮、多聚異戊二烯醇脂質(zhì)。富集程度最顯著的途徑為類固醇生物合成、二苯乙烯、二芳庚烷和姜酚的生物合成、脂肪酸生物合成、花生四烯酸代謝、泛素及其他萜類醌類生物合成、嘌呤代謝、二萜生物合成、氨基糖和核苷酸糖的代謝、生物素代謝、次生代謝物的生物合成(圖7A，圖7B)。低磷脅迫差異物質(zhì)共映射到58條代謝通路。主要聚類為脂肪?；?、羧酸及其衍生物、有氧化合物、類黃酮、甘油磷脂、嘌呤核苷、肉桂酸及其衍生物。富集程度最顯著的途徑為苯乙烯、二芳庚烷和姜酚的生物合成、甘油磷脂新陳代謝、二萜生物合成、類苯基丙烷生物合成、嘧啶代謝(圖7C，圖7D)。

圖7 各組差異代謝物HMDB分類圖和氣泡圖Fig.7 HMDB classification diagram and bubble diagram of different metabolites in each group注：圖7A中，1=脂肪?；?；2=羧酸及其衍生物；3=有機(jī)氧化合物；4=黃酮類化合物；5=甘油磷脂；6=異黃酮；7=異戊二烯脂類；8=嘌呤核苷酸；9=類固醇和類固醇衍生物；10=肉桂酸及其衍生物；11=苯丙酸；12=嘌呤核苷；13=嘧啶核苷；14=四吡咯及其衍生物；15=生物素及其衍生物；16=碳水化合物和碳水化合物結(jié)合物；17=香豆素及其衍生物；18=二嗪類；19=二氫呋喃；20=吲哚及其衍生物。圖7B中，1=淀粉和蔗糖代謝；2=萜類骨架生物合成；3=異喹啉生物堿生物合成；4=嘌呤代謝；5=單萜生物合成；6=鞘脂代謝；7=嘧啶代謝；8=花生四烯酸代謝；9=泛醌和其他萜類-醌生物合成；10=生物素代謝；11=氨基糖和核苷酸糖代謝；12=二萜生物合成；13=脂肪酸生物合成；14=芪類、二芳基庚烷類和姜辣素生物合成；15=抗壞血酸和醛糖酸鹽代謝；16=糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定生物合成；17=內(nèi)吞作用；18=自噬-動(dòng)物；19=RNA轉(zhuǎn)運(yùn)；20=類固醇生物合成。圖7C中，1=脂肪酰基；2=羧酸及其衍生物；3=有機(jī)氧化合物；4=黃酮類化合物；5=甘油磷脂；6=嘌呤核苷；7=肉桂酸及其衍生物；8=有機(jī)氮化合物；9=異戊二烯脂類；10=嘧啶核苷；11=四吡咯及其衍生物；12=5'-脫氧核糖核苷；13=苯和取代衍生物；14=香豆素及其衍生物；15=二氫呋喃；16=雜芳族化合物；17=吲哚及其衍生物；18=有機(jī)碳酸及其衍生物；19=酚類；20=苯丙酸。圖7D中，1=嘌呤代謝；2=卟啉和葉綠素代謝；3=氰基氨基酸代謝；4=苯丙氨酸代謝；5=單萜生物合成；6=異喹啉生物堿生物合成；7=不飽和脂肪酸的生物合成；8=β-丙氨酸代謝；9=淀粉和蔗糖代謝；10=檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))；11=嘧啶代謝；12=苯丙烷生物合成；13=甘油磷脂代謝；14=二萜生物合成；15=芪類、二芳基庚烷類和姜辣素生物合成；16=抗壞血酸和醛糖酸鹽代謝；17=RNA轉(zhuǎn)運(yùn)；18=內(nèi)吞作用；19=糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定生物合成；20=自噬-動(dòng)物Note:In figure 7A,1=fatty acyl group;2=carboxylic acid and its derivatives;3=organic oxygen compound;4=flavonoids;5=glycerophospholipids;6=isoflavones;7=isoprene lipids;8=purine nucleotides;9=steroids and steroid derivatives;10=cinnamic acid and its derivatives;11=phenyl propionic acid;12=purine nucleoside;13=pyrimidine nucleoside;14=tetrapyrrole and its derivatives；15=Biotin and its derivatives;16=Carbohydrate and carbohydrate conjugates;17=Coumarin and its derivatives;18=Diazines;19=Dihydrofuran;20=Indole and its derivatives. In Figure 7B,1=fatty acyl;2=carboxylic acid and its derivatives;3=organic oxygen compounds;4=flavonoids;5=glycerophospholipids;6=purine nucleosides;7=cinnamic acid and its derivatives;8=organic nitrogen compounds;9=isoprene lipids;10=pyrimidine nucleosides;11=tetrapyrroles and their derivatives;12=5'-deoxyribonucleosides;13=benzene and substituted derivatives;14=Coumarin and its derivatives;15=dihydrofuran;16=heteroaromatic compounds;17=indole and its derivatives;18=organic carbonic acid and its derivatives;19=phenols;20=phenyl propionic acid. In figure 7C,1=starch and sucrose metabolism;2=terpenoid skeleton biosynthesis;3=isoquinoline alkaloid biosynthesis;4=purine metabolism;5=monoterpene biosynthesis;6=sphingolipid metabolism;7=pyrimidine Metabolism;8=arachidonic acid metabolism;9=ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis;10=biotin metabolism;11=amino sugar and nucleotide sugar metabolism;12=diterpene biosynthesis;13=fatty acid Biosynthesis;14=Stilbene,diarylheptanes and gingerol biosynthesis;15=Ascorbic acid and aldonate metabolism;16=Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored biosynthesis;17=Endocytosis;18=autophagy-animal;19=RNA transfer;20=steroid biosynthesis. In figure 7D,1=purine metabolism;2=porphyrin and chlorophyll metabolism;3=cyanoamino acid metabolism;4=phenylalanine metabolism;5=monoterpene biosynthesis;6=isoquinoline alkaloid biosynthesis 7=Biosynthesis of unsaturated fatty acids;8=β-alanine metabolism;9=starch and sucrose metabolism;10=citric acid cycle (TCA cycle);11=pyrimidine metabolism;12=phenylpropane biosynthesis;13=Glycerol phospholipid metabolism;14=diterpene biosynthesis;15=stilbene,diarylheptanes and gingerol biosynthesis;16=ascorbic acid and aldonic acid metabolism;17=RNA transport;18=endocytosis;19=Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored biosynthesis;20=autophagy-animal

從表2中可知，干旱脅迫處理百脈根葉片的前19種差異顯著的代謝產(chǎn)物中，14種代謝產(chǎn)物上調(diào)，其中7,12-二甲基苯[a]蒽5,6-氧化物(Dimethylbenz[a]anthracene 5，6-oxide)、1-水楊酸葡萄糖醛酸苷(1-Salicylate glucuronide)、2,3,23-三乙酰絲膠酸(2,3,23-Triacetylsericic acid)顯著上調(diào)，小柱孢酮(Scytalone)、(E)-3-(2-羥基苯基)-2-丙烯醛顯著下調(diào)。從表3中可知，低磷脅迫處理百脈根葉片的前19種差異顯著的代謝產(chǎn)物中，12種代謝產(chǎn)物上調(diào)，其中丙二酸氫乙酯(Ethyl hydrogen malonate)、5′-O-(吡喃葡萄糖基)吡哆辛(5′-O-β-D-Glucosylpyridoxine)、D-α-葡萄庚糖(D-α-Glucoheptose)顯著上調(diào)。塞蘭寧(Salannin)、6-十五烷基水楊酸(6-pentadecyl Salicylic Acid)顯著下調(diào)。

表2 干旱脅迫條件下百脈根葉片中主要差異代謝物Table 2 Main differential metabolites in the leaves of Lotus corniculatus under drought stress

表3 低磷脅迫條件下百脈根葉片中主要差異代謝物Table 3 Major difference metabolites in leaves of Lotus corniculatus under low phosphorus stress

3 討論

植物對(duì)逆境脅迫最重要的響應(yīng)是代謝的改變，即植物通過調(diào)節(jié)代謝網(wǎng)絡(luò)以誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列特殊代謝物，從而達(dá)到對(duì)生物、非生物脅迫的防御作用。代謝組學(xué)可以通過監(jiān)測(cè)植物體系受到脅迫或刺激后代謝產(chǎn)物的變化來揭示脅迫環(huán)境下植物的應(yīng)答機(jī)制，是植物抗逆研究的很好的途徑[24]。本研究通過PCA和OPLS-DA分析、差異倍數(shù)柱圖和差異代謝物火山圖分析表明，貴州天然豆科牧草百脈根在干旱和低磷環(huán)境中均具有非常明顯的代謝特征，推測(cè)基礎(chǔ)代謝物組成作為植物生化反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)在應(yīng)答兩種脅迫方面具有重要意義。干旱脅迫下百脈根390條差異代謝物比低磷脅迫高出58條，表明百脈根在應(yīng)答干旱脅迫中積累了更多的代謝物。Bailin[25]等的研究表明，正向和負(fù)向電離模式下分別有448個(gè)上調(diào)基因和918個(gè)下調(diào)基因以及325種和219種化合物分別響應(yīng)短期和長(zhǎng)期熱脅迫而上調(diào)或下調(diào)。植物生長(zhǎng)和防御的主要調(diào)節(jié)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是植物應(yīng)答非生物脅迫的重要過程[26]。甘油磷脂作為植物細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)的重要代謝物，是植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫應(yīng)答機(jī)制之一，本試驗(yàn)干旱和低磷脅迫差異物質(zhì)映射的代謝通路中，都注釋到了甘油磷脂通路。酮體、萜類化合物有助于增強(qiáng)植物的抗旱性[27-28]，兩種脅迫處理百脈根注釋到的通路中，酮體的合成和降解、萜類化合物代謝等揮發(fā)性物質(zhì)都表現(xiàn)為上調(diào)。植物產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)，如烷烴類、烯烴類、醛類、酮類、萜烯類化合物影響植物的抗旱調(diào)節(jié)[29]。本實(shí)驗(yàn)干旱脅迫處理百脈根葉片中前19種差異顯著的代謝產(chǎn)物中絕大多數(shù)都是此類物質(zhì)。李小冬[30]等研究在干旱脅迫下高羊茅(Festucaarundinacea)葉片代謝組中鑒定出282種物質(zhì)存在差異，其中脂代謝產(chǎn)物和芳香族化合物含量差別較大，與本實(shí)驗(yàn)干旱脅迫主要聚類為脂肪酰基、多聚異戊二烯醇脂質(zhì)研究結(jié)果一致。植物需要使用專門的新陳代謝機(jī)制以免受環(huán)境壓力這一觀點(diǎn)需要通過解決以下問題來證明：專門的新陳代謝機(jī)制所能承受的壓力是否直接歸因于代謝產(chǎn)物，如類黃酮。前人在茶樹研究中發(fā)現(xiàn)，酮類化合物具有清除活性氧的作用，增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性[31]。在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，類黃酮具有自由基清除活性，增強(qiáng)了擬南芥對(duì)非生物脅迫的耐受性[3,32]，這與本研究的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

在研究中，我們對(duì)低磷和干旱脅迫下的百脈根進(jìn)行了代謝物分析。通過分析對(duì)照組、低磷脅迫組和干旱脅迫組之間的差異代謝物、差異代謝定量差異倍數(shù)、差異代謝物KEGG代謝通路和主要差異代謝物類型，發(fā)現(xiàn)百脈根在低磷和干旱脅迫下多種代謝物發(fā)生了變化，這些產(chǎn)物可能參與調(diào)控百脈根抵御低磷和干旱脅迫，為進(jìn)一步研究百脈根抵御低磷和干旱脅迫的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。