李鈺昕 張洪春 李 云 疏欣楊 △

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029；3.國家呼吸醫(yī)學(xué)中心，北京 100029；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院呼吸病學(xué)研究院，北京 100029；5.國家呼吸疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100029；6.世界衛(wèi)生組織戒煙與呼吸疾病預(yù)防合作中心，北京 100029）

慢性支氣管炎急性加重（AECB）是急診或呼吸科臨床常見疾病?？股厥侵委烝ECB的常用選擇，但其無法改變AECB反復(fù)發(fā)作的特點，且常因AECB的反復(fù)發(fā)作引起抗生素耐藥的發(fā)生［1］。預(yù)防AECB的反復(fù)發(fā)作才能從根本上解決其對患者生命健康的威脅。AECB常由細菌或病毒感染誘發(fā)，多見于抵抗力下降的老年患者，因此免疫調(diào)節(jié)成為防治AECB的新方向［2］。冬蟲夏草是我國有兩千多年歷史的傳統(tǒng)補益藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明冬蟲夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗癌等藥理作用［3］。冬蟲夏草作為具有調(diào)節(jié)免疫功效的藥食兩用中藥材，在防治AECB方面具有廣闊的前景，多項臨床研究已證實冬蟲夏草不僅可顯著改善患者的肺功能，還可以提高患者免疫力［4］，從而達到減少AECB的發(fā)生的目的。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，以中藥化學(xué)成分、作用靶點為信號節(jié)點，整合系統(tǒng)生物學(xué)、基因?qū)W、計算機分析科學(xué)等學(xué)科的理論，分析藥物活性成分與作用靶點之間的聯(lián)系，探討藥物治療疾病的信號通路，在整體角度上預(yù)測藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)性，可以針對疾病的靶點，有效提高藥物治療疾病的療效，減少毒副作用。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討冬蟲夏草預(yù)防AECB的可能性及相關(guān)分子機制，以期為AECB的免疫調(diào)節(jié)治療提供一定的理論依據(jù)，為后期的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 冬蟲夏草活性化合物和靶點的篩選 基于TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）及《中華人民共和國藥典》（2020版），篩選冬蟲夏草的化學(xué)成分及分子結(jié)構(gòu)信息等。納入符合口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18［5］的標(biāo)準化合物，篩選出候選活性化合物。通過Pub-Chem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得藥物活性化合物的標(biāo)準結(jié)構(gòu)，利用SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測活性成分靶點并納入Probability＞0.02［6］的靶點。將獲得的冬蟲夏草相關(guān)的活性化合物及靶點導(dǎo)入Cytoscape3.7.1繪制冬蟲夏草-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 預(yù)測目標(biāo)靶點 利用GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫檢索AECB疾病相關(guān)靶點，取冬蟲夏草活性化合物和AECB疾病集合的靶點交集作為目標(biāo)靶點。

1.3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 基于STRING工具（https：//www.string-db.org/）構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape3.7.1繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用Cytoscape3.7.1插件CytoHubba篩選重點靶點，納入最大集團中心性法分析得到的前10個靶點。

1.4 GO和KEGG富集分析 將目標(biāo)靶點列表導(dǎo)入DAVIDE 工 具（https：//david.ncifcrf.gov/），選 擇 GO 和KEGG分別進行通路和疾病的富集分析。結(jié)果用R軟件（version 3.6.2）繪制的氣泡圖展示。

2 結(jié)果

2.1 冬蟲夏草的活性成分 共篩選出冬蟲夏草的主要活性成分7個，主要可分為脂肪酸類［花生四烯酸（Arachidonic acid）、乙酸亞油脂酸（Linoleyl acetate）、棕櫚酸膽固醇酯（Linoleyl acetate）］，以及甾醇類化合物［β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、麥維甾醇（Cerevisterol）、過氧麥角甾醇（Peroxyergosterol）、35，6-膽甾醇-3β-醇（CLR）］。通過SwissTargetPrediction工具預(yù)測冬蟲夏草活性成分的靶點234個，繪制冬蟲夏草-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。圖中圓圈節(jié)點代表化合物預(yù)測的靶點，長方形節(jié)點代表化合物，6邊形節(jié)點代表冬蟲夏草。甾醇類化合物中以麥維甾醇靶點最多，脂肪酸類化合物中以花生四烯酸靶點最多。

2.2 目標(biāo)靶點 GeneCard數(shù)據(jù)庫收集AECB的相關(guān)靶點697個，將冬蟲夏草的234個靶點與之進行映射，得到共同靶點61個，這61個靶點即為冬蟲夏草防治AECB的目標(biāo)靶點，目標(biāo)靶點占冬蟲夏草靶點的26%，因而日常服用冬蟲夏草提高免疫力對預(yù)防AECB有一定意義。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將61個目標(biāo)靶點輸入STRING工具，構(gòu)建目標(biāo)靶點的蛋白質(zhì)互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖2，共有61個節(jié)點，385條邊，節(jié)點越大，顏色越暖代表度值（Degree）越大。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1并用CytoHubba插件篩選重點靶點，節(jié)點越大代表度值越大，節(jié)點越紅代表最大集團中心性算法后的分值越高。重要的靶點有 TP53、TNF、MAPK1、EGFR、MAPK8、MAPK14、PTGS2、SRC、AR、NR3C1。見圖2。

2.4 GO和KEGG富集分析 GO富集分析結(jié)果顯示生物過程主要包括蛋白質(zhì)改變、細胞周期調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)，細胞成分主要涉及質(zhì)膜和細胞表面，分子功能主要有激酶活性和蛋白質(zhì)結(jié)合。KEGG富集分析顯示的條目包括免疫調(diào)節(jié)相關(guān)通路如NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、RIG-I樣受體信號通路、T細胞受體信號通路；感染相關(guān)通路如肺結(jié)核、百日咳、單純皰疹病毒感染、HTLV-I感染、志賀菌病、幽門螺桿菌感染、美國錐蟲病、弓形蟲病等病毒、細菌以及寄生蟲感染通路等；炎癥相關(guān)通路如TNF信號通路、EGFR信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路、ErbB信號通路、FcεRI信號通路、TRP通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、花生四烯酸代謝通路；以及癌癥相關(guān)的通路如前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、癌癥蛋白多糖、小細胞肺癌、癌癥中樞碳代謝、癌癥microRNA、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、細胞周期、Rap1信號通路等；富集分析的結(jié)果提示了冬蟲夏草可能通過影響免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抗炎及抗癌等通路發(fā)揮防治AECB的作用。見圖3。

3 討 論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法得到了冬蟲夏草防治AECB的目標(biāo)靶點和信號通路，發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草可以通過調(diào)節(jié)機體免疫和營造不利于病原微生物的生存環(huán)境發(fā)揮防治AECB的作用。AECB屬于中醫(yī)學(xué)“咳嗽”范疇，多由肺衛(wèi)功能不足，六淫外邪侵襲肺系，肺失宣降所致。因此補肺益氣固衛(wèi)、止咳化痰平喘是預(yù)防AECB反復(fù)發(fā)作的根本手段。冬蟲夏草是傳統(tǒng)補益藥，具有“百藥之王”的稱號，用于久咳虛喘，勞嗽咯血，通過補肺腎、益精氣增加人體的御邪能力，化痰平喘改善氣道緩解，從而發(fā)揮防治AECB的作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為免疫力低下、病原微生物感染及氣道炎癥環(huán)境在AECB的發(fā)病中起著重要作用。麥維甾醇可以通過對MAPK/NF-κB/AP-1和Nrf2/HO-1炎癥信號通路的抑制緩解氣管慢性炎癥環(huán)境［7］。花生四烯酸則可通過對促炎因子和抑炎因子的調(diào)節(jié)、對包膜病毒的滅活、對細菌結(jié)構(gòu)及活動的破壞，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗感染的作用［8］。重要靶點 PTGS2、MAPK、NR3C1、TP53、TNF、EGFR、SRC均與免疫調(diào)節(jié)、感染調(diào)控及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。其中PTGS2與慢性炎癥的形成關(guān)系密切［9］；MAPK家族參與感染［10］、炎癥［11］、免疫［12］的調(diào)節(jié)；NR3C1參與糖皮質(zhì)激素對氣道上皮炎癥的調(diào)節(jié)［13］；TP53的突變會削弱機體的免疫功能［14］；TNF可觸發(fā)多條炎癥途徑；EGFR是細菌［15］、病毒［16］等微生物感染誘導(dǎo)的炎癥和相關(guān)致癌作用的潛在治療靶點；SRC在巨噬細胞介導(dǎo)的先天免疫中發(fā)揮多重作用［17］。

呼吸道感染是AECB最常見的病因，而感染常發(fā)生于免疫力低下時。既往研究表明冬蟲夏草可以通過對NOD樣受體、RIG-I樣受體、Toll樣受體和T細胞信號通路的調(diào)節(jié)，發(fā)揮抗感染和提高免疫力的作用［18-22］，與本研究富集結(jié)果相符。病原微生物感染導(dǎo)致的氣道炎癥反應(yīng)是AECB發(fā)病的關(guān)鍵，既往研究表明冬蟲夏草及其活性成分可以通過對NF-κB、MAPK、TNF［23］、EGFR［24］、PI3K-Akt［25］等信號通路的調(diào)控，抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激［14，26］，減少嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的浸潤，減輕氣道壁厚度，抑制氣道重塑［27］，與本研究富集結(jié)果相符。此外，本研究亦發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草防治AECB的信號通路中有多條癌癥途徑參與其中，這可能是由于癌癥和感染激活生物合成途徑的相似性導(dǎo)致的。起源于20世紀的病毒致癌說就曾提出病毒致癌的證據(jù)，臨床中包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥亦與感染有關(guān)［28-29］，病原體感染人體后的代謝變化與腫瘤相似，故可以推測用冬蟲夏草可以通過調(diào)節(jié)人體代謝環(huán)境，營造不利于病原微生物的生存環(huán)境［6］。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體上分析了冬蟲夏草預(yù)防AECB的作用機制，結(jié)果表明冬蟲夏草預(yù)防AECB是通過多成分、多靶點、多通路的協(xié)同來發(fā)揮其治療作用的。其發(fā)生作用的機制與免疫調(diào)節(jié)、抗感染和抗炎調(diào)節(jié)有關(guān)。預(yù)測的潛在活性成分、靶點、生物功能及通路與文獻報道基本相一致，因此說明本研究的預(yù)測具有一定的可靠性，能為挖掘中藥潛在價值提供可靠依據(jù)，為進一步深入研究冬蟲夏草防治AECB提供新的思路與理論參考。