馬 莉 李玉紅 王保和 谷旭放△

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300150）

心血管疾病是引起全球范圍內(nèi)人口死亡的重大衛(wèi)生公共事件之一，其中心肌梗死（MI）是導(dǎo)致心血管疾病高死亡率的“罪魁禍?zhǔn)住?，?jù)估計(jì)全世界每年有730萬(wàn)人死于MI［1］。目前MI的治療主要包括藥物治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)等外科手術(shù)療法［2］，雖然這些治療有一定的療效，但它們均不能降低MI不良預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)。面對(duì)此挑戰(zhàn)，中醫(yī)藥憑借其多種活性成分和多種作用機(jī)制的特性，在MI的治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和良好的應(yīng)用前景。

中醫(yī)學(xué)中并無(wú)病名，但依據(jù)其臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“胸痹”“真心痛”等范疇［3］；其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，即氣虛為本，血瘀為標(biāo)。治療應(yīng)標(biāo)本兼顧，因而采用補(bǔ)氣通脈、活血化瘀的治療大法［4］?！包S芪-丹參”是補(bǔ)氣活血的常用藥對(duì)。黃芪為補(bǔ)氣圣藥，可補(bǔ)氣益心。丹參具有活血，通心包絡(luò)之功，常與黃芪配伍治療胸痹［5］。目前研究表明“黃芪-丹參”藥對(duì)具有改善微循環(huán)、抗纖維化、抗炎等作用，廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病、肝腎和呼吸系統(tǒng)疾病等［6］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是具有整體性和系統(tǒng)性的“網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)”的新方法，通過(guò)多學(xué)科交叉互補(bǔ)結(jié)合，根據(jù)藥物對(duì)疾病靶點(diǎn)的調(diào)控作用，構(gòu)建蛋白網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)圖，進(jìn)而預(yù)測(cè)中藥治療的有效途徑［7］。本文研究依托國(guó)家自然科學(xué)基金，初步對(duì)“黃芪-丹參”抗MI的分子機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)性挖掘，從生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)角度探索關(guān)鍵活性成分及靶點(diǎn)，為課題后續(xù)研究把握較為精準(zhǔn)的方向。

1 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立與可視化分析

1.1 檢索“黃芪-丹參”藥對(duì)的活性化合物及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）是一個(gè)包含中國(guó)藥典中注冊(cè)的所有中草藥的數(shù)據(jù)庫(kù)，利用TCMSP數(shù)據(jù)檢索黃芪—丹參化合物成分，并以口服利用度（OB）≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18為條件［8］篩選黃芪、丹參的有效化合物成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。然后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/uniprot/）統(tǒng)一進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，最后利用Microsoft Office Excel文本進(jìn)行去重，梳理藥物活性成分和靶點(diǎn)基因。

1.2 構(gòu)建藥物-疾病共同靶點(diǎn)

GeneCard是一個(gè)可提供有關(guān)所有帶注釋和預(yù)測(cè)的人類(lèi)基因的集成數(shù)據(jù)庫(kù)。OMIM是人類(lèi)基因和遺傳表型的全面而又權(quán)威的數(shù)據(jù)庫(kù)。以“Myocardial infarction”為檢索詞，應(yīng)用GeneGard和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索MI相關(guān)靶點(diǎn)，之后MI疾病靶點(diǎn)去重，最后利用Venny2.1.0軟件，構(gòu)建可視化共有基因和差異基因的韋恩圖。

1.3 構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape3.7.1軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖。并通過(guò)Cytoscape3.7.1軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，節(jié)點(diǎn)（node）代表藥物、藥物有效成分、疾病、疾病-藥物共同潛在作用靶點(diǎn)，邊（edge）代表“藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”的聯(lián)系。

1.4 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及預(yù)測(cè)關(guān)鍵靶點(diǎn)

利用BisoGenet構(gòu)建蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)。將藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)分別導(dǎo)入BisoGenet內(nèi)，生成2個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape中的Merge功能篩選出2個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)的交集網(wǎng)絡(luò)，并利用CytoNCA對(duì)交集網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，然后根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)分析節(jié)點(diǎn)屬性值進(jìn)行篩選，從而預(yù)測(cè)出關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 GO和KEGG富集分析

富集分析是將目標(biāo)基因與基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的成千上萬(wàn)的基因集進(jìn)行比較，得出目標(biāo)基因參與特定的生物學(xué)過(guò)程、蛋白質(zhì)注釋、基因的功能或基因的其他特征性的過(guò)程。利用Omicshare平臺(tái)對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）二級(jí)分類(lèi)富集分析。Metascape是一個(gè)可進(jìn)行富集分析的可靠且權(quán)威的數(shù)據(jù)平臺(tái)，將篩選后的關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入Metascape平臺(tái)進(jìn)行KEGG途徑富集分析，識(shí)別關(guān)鍵靶點(diǎn)治療疾病的信號(hào)通路。并利用Omicshare平臺(tái)對(duì)KEGG富集分析結(jié)果構(gòu)建可視化氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 “黃芪-丹參”藥對(duì)有效成分及作用靶點(diǎn) 見(jiàn)表1。利用TCMSP檢索“黃芪-丹參”活性化學(xué)成分，篩選出85個(gè)有效成分，其中黃芪相關(guān)化學(xué)成分20個(gè)，與丹參相關(guān)化學(xué)成分65個(gè)。85個(gè)有效成分對(duì)應(yīng)1 239個(gè)作用靶點(diǎn)，其中與黃芪相關(guān)靶點(diǎn)308個(gè)，與丹參相關(guān)靶點(diǎn)931個(gè)。再借助Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化成已驗(yàn)證的相應(yīng)基因，去重和刪去無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)后，獲得藥物靶點(diǎn)基因58個(gè)。

表1 “黃芪-丹參”有效活性成分表

2.2 “黃芪-丹參”和MI共同靶點(diǎn)

通過(guò)檢索MI疾病靶點(diǎn)共獲得3 677個(gè)，將MI靶點(diǎn)及“黃芪-丹參”藥物有效成分對(duì)應(yīng)的基因輸入Venny2.1.0軟件，得出疾病和藥物活性化學(xué)成分共同靶點(diǎn)50個(gè)（見(jiàn)圖1）。

2.3 構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用Cytocsape3.7.1軟件構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中有211個(gè)節(jié)點(diǎn)（node）和1 156條邊，節(jié)點(diǎn)大小與節(jié)點(diǎn)度值成正比。六邊形為活性化合物成分，圓形為藥物，菱形為藥物—疾病共同靶點(diǎn)，余為疾?。ㄒ?jiàn)圖2）。

2.4 “黃芪-丹參”治療MI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.4.1 “黃芪-丹參”治療MI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用BisoGenetfen分別構(gòu)建疾病和藥物的蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，心肌梗死潛在靶點(diǎn)通過(guò)251 771種直接或間接關(guān)系與14 814個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生作用，“黃芪-丹參”潛在靶點(diǎn)通過(guò)76 382種直接或者間接關(guān)系與3 031個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生作用。二者交集網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3，交集網(wǎng)絡(luò)共有3 023個(gè)靶點(diǎn)，交集網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析得出靶點(diǎn)自由度值的中位數(shù)為30。

2.4.2 篩選關(guān)鍵靶點(diǎn) 首次篩選出大于自由度中位數(shù)2倍的“Big hubs”節(jié)點(diǎn)［9］，然后依據(jù)“Big hubs”節(jié)點(diǎn)的幾個(gè)屬性值（具體篩選策略見(jiàn)圖4）篩選出一個(gè)具有9 505條邊，251個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖5），“黃芪-丹參”治療MI可能就是通過(guò)這些關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用的。

2.5 富集分析

借助Omicshare平臺(tái)，對(duì)251個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析。并以P＜0.05作為差異統(tǒng)計(jì)的篩選條件。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞氮化合物、細(xì)胞蛋白質(zhì)、細(xì)胞芳香化合物、細(xì)胞大分子的細(xì)胞代謝過(guò)程及基因表達(dá)調(diào)控等介導(dǎo)生物過(guò)程；通過(guò)DNA結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、酶結(jié)合、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等介導(dǎo)分子功能；通過(guò)細(xì)胞外泌體、細(xì)胞器、核質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器等介導(dǎo)細(xì)胞成分（如圖6）；借助Metascape平臺(tái)，對(duì)篩選出的251個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析。并以P＜0.05作為差異統(tǒng)計(jì)的篩選條件，選取Log10（P）值排名前20的信號(hào)通路，并利用Omicshare平臺(tái)對(duì)KEGG富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化氣泡圖處理（如圖7）氣泡顏色由藍(lán)色到紅色代表Log10（P）值從小到大，橫軸代表通路上的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)數(shù)量占核心靶點(diǎn)的比值。

3 討 論

中醫(yī)藥對(duì)MI相關(guān)描述最早記載可追溯于《黃帝內(nèi)經(jīng)》。病機(jī)的梳理在《張氏醫(yī)通·諸血門(mén)》記載“蓋氣與血，兩相維附。氣不得血，則散而無(wú)統(tǒng)；血不得氣，則凝而不流”。又如中醫(yī)理論，“氣為血之帥，血為氣之母”，均闡明了氣血互根互用，相輔相成的關(guān)系，即氣虛則可致血瘀，治療應(yīng)予補(bǔ)氣活血。且在臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，益氣活血療法能夠明顯升高心肌梗死患者心臟射血功能、減輕中醫(yī)癥候、改善MI預(yù)后和提高患者生活質(zhì)量［10-11］。在中藥學(xué)研究中，黃芪-丹參是治療MI的重要藥對(duì)，且被證明具有廣泛的心血管藥理作用。黃芪提取物可預(yù)防缺血性和缺氧性的心肌細(xì)胞損傷，增強(qiáng)心肌收縮力，改善心臟舒張功能障礙，減輕血管內(nèi)皮功能障礙，并促進(jìn)血管生成等。丹參藥理作用包括抗氧化、抗炎、內(nèi)皮保護(hù)、心肌保護(hù)，抗凝和抗動(dòng)脈粥樣硬化，以及有助于減少血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移等［6，12］。

3.1 藥物活性成分分析

MI是一種心肌細(xì)胞進(jìn)展性死亡的疾病，其死亡方式包括壞死、凋亡、自噬等。冠狀動(dòng)脈廣泛的炎癥風(fēng)暴和高含量的活性氧（ROS）是疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)鍵因素。通過(guò)“藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病”的可視化網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)黃芪-丹參治療MI的核心成分可能為山柰酚、木樨草酸、丹參酮ⅡA等。山柰酚和木樨草酸分別屬于黃芪和丹參的活性成分之一，且均屬于黃酮類(lèi)［13］。兩者在抑制與凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)自噬通量等方面具有積極的作用。此外兩者均可通過(guò)減少肌酸激酶和乳酸脫氫酶等心臟損傷標(biāo)記物的釋放，衰減MI誘導(dǎo)的心臟損傷，改善MI后的心臟功能［14］。丹參酮ⅡA屬于丹參親脂性活性成分之一，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。研究表明丹參酮ⅡA能夠通過(guò)提高心臟射血分?jǐn)?shù)、減少左室收縮末期容積，改善MI患者的心功能［15］。另外，丹參酮ⅡA也可通過(guò)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路和減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血再灌注的損傷［16］，具體機(jī)制包括降低炎性因子水平、抑制血小板聚集、減少ROS的產(chǎn)生等。不僅如此，丹參酮ⅡA還能夠顯著抑制慢性缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C釋放、線粒體膜電位去極化和促凋亡蛋白的表達(dá)，抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等［17］。

3.2 關(guān)鍵靶點(diǎn)的確定

經(jīng)過(guò)PPI篩選，共獲得251個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括淀粉樣前體蛋白、雌激素受體α、腫瘤蛋白53等。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，心臟中的淀粉樣蛋白過(guò)度積累可激活線粒體凋亡途徑，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡［18］。雌激素受體是心臟保護(hù)的潛在藥理靶點(diǎn)，雌激素受體α是其亞型之一，廣泛地分布于心血管系統(tǒng)中。此外，還具有抗炎、抗凋亡、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞和心臟的作用，因此被認(rèn)為是治療MI的潛在靶點(diǎn)［19］。MI后的脆弱心肌可誘導(dǎo)心臟破裂，過(guò)度的炎癥和細(xì)胞凋亡是MI后形成脆弱心肌的主要危險(xiǎn)因素，而P53是炎癥和凋亡的激活因子，因此下調(diào)P53的表達(dá)可抑制炎癥和細(xì)胞凋亡，從而預(yù)防MI誘導(dǎo)的心臟破裂［20］。

3.3 通路和生物學(xué)過(guò)程分析

本研究通過(guò)富集分析，發(fā)現(xiàn)了黃芪-丹參治療MI的主要途徑：包括泛素介導(dǎo)的蛋白水解途徑、MAPK信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路、P3信號(hào)通路等。泛素介導(dǎo)的蛋白水解途徑，是降解某些異常細(xì)胞內(nèi)蛋白的主要途徑。在參與清除與炎癥調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)以及其他生物學(xué)功能的受損蛋白質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用。且已被證實(shí)參與心血管疾病的發(fā)展和心室重構(gòu)［21］。促分裂原活化蛋白激酶途徑是一個(gè)重要的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，通過(guò)抑制P38 Mapk的磷酸化，可減少氧化應(yīng)激和炎性因子的產(chǎn)生，進(jìn)而改善MI之后的心室重構(gòu)和心肌細(xì)胞收縮功能障礙［22］。甲狀腺激素信號(hào)通路可通過(guò)減少梗死疤痕面積改善心臟功能，并防止MI向心力衰竭發(fā)展，這種有益效應(yīng)歸因于其增加毛細(xì)血管的形成、防止心肌細(xì)胞死亡、挽救線粒體生物發(fā)生和功能等［23］。缺氧誘導(dǎo)因子-1在缺氧條件下協(xié)調(diào)凋亡與自噬的平衡狀態(tài)，以維持缺氧細(xì)胞的存活［24］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路參與MI中的多種信號(hào)級(jí)聯(lián)通路的調(diào)節(jié)，如在梗死的心臟中，通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β/Smad信號(hào)通路抑制MI大鼠心肌纖維化，逆轉(zhuǎn)心臟的不良重塑，改善心功能［25］。

綜上所述，在這項(xiàng)研究中，我們通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了一系列“黃芪-丹參”治療MI的有效成分、作用靶點(diǎn)及關(guān)鍵通路。課題組將在本研究基礎(chǔ)上，開(kāi)展動(dòng)物、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證靶點(diǎn)；同時(shí)會(huì)深入開(kāi)展對(duì)“中藥藥對(duì)”之間協(xié)同/拮抗作用的研究。