劉子璇 劉文麗 郝 浩 孔 立 傅一鑫 田新誠 李 肖 劉慧宇

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250355）

目前，膿毒癥發(fā)病率、病死率居高不下，臨床救治十分困難，是當今重癥醫(yī)學所面臨的難題［1］。膿毒癥最新定義為宿主對感染引起失控反應導致危及生命的器官功能障礙綜合征，具有30%～70%的病死率，嚴重威脅人類生命健康［2］。膿毒癥休克因細菌細胞壁上的脂多糖（LPS）導致，根據(jù)流行病學調查，肺為膿毒癥最早累及的器官，約半數(shù)膿毒癥休克患者伴隨急性肺損傷（ALI）或者急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）［3］，其特征是肺部炎癥、肺水腫、低順應性和由于肺血管通透性增加引起的毛細血管滲漏。通常有呼吸窘迫、呼吸衰竭、低氧血癥的表現(xiàn)，臨床上通過機械通氣糾正低氧血癥、液體管理控制炎癥以治療ALI，但部分患者病情仍有進展。研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液治療膿毒癥有較好療效［4］。如何應用中西醫(yī)結合方法治療膿毒癥相關肺損傷是目前我國醫(yī)學研究重要課題之一。有學者稱參附注射液可通過減少肺氧自由基產(chǎn)生，減輕膿毒癥ALI［5］。我們先前的研究表明參附注射液可降低肺血管通透性，這可能與抑制細胞內(nèi)皮的多糖包被降解有關，但分子機制還有待探究［6］。

經(jīng)過先前預實驗和參附注射液的動物研究表明10 mg/kg的參附注射液可抑制LPS誘導的肺部炎癥及損傷［7］。本研究通過建立膿毒癥大鼠模型，通過參附注射液對膿毒癥大鼠的干預，研究對膿毒癥大鼠肺損傷的保護作用，探索其對內(nèi)毒素所致ALI的保護機制，為參附注射液治療膿毒癥的臨床應用提供理論依據(jù)，并嘗試尋找中西醫(yī)結合治療膿毒癥的新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體（SPF）級SD大鼠30只，6～7周齡，體質量200～250 g，雄性，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物許可證號：SCXK（魯）20170007。經(jīng)檢驗檢疫合格。動物房光照時間12 h，溫度20～24℃，濕度60%。飼養(yǎng)地點為山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗中心，自由取食。實驗動物的飼養(yǎng)及實驗方案經(jīng)山東中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，實驗操作和取材均遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》《實驗動物管理條例》和《實驗動物許可管理辦法》規(guī)定進行。

1.2 試藥與儀器 參附注射液，華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司，批號：國藥準字Z5120664。脂多糖，美國Sigma公司，批號065M8209V。10%水合氯醛溶液，山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗中心提供；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA kit、大鼠基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）ELISA kit、大鼠 syndecan-1 ELISA kit，USCN life公司；大鼠硫酸類肝素ELISA kit，武漢科晶科技有限公司；硫酸軟骨素ELISA kit，武漢云克隆科技股份有限公司。BP310S電子天平，德國Sartorius公司；Cascadal超純水系統(tǒng)，美國PALL公司；ST8型低速自動平衡離心機，美國Thermo Scientific公司；5424R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；XW-80A旋渦混合儀，海門其林貝爾儀器有限公司；KG19V21電冰箱，德國西門子公司；微量移液器，德國Thermo Scientific公司；-80℃超低溫冰箱，日本SANYO公司；全波長酶標儀，德國Thermo Scientific公司；DK-8D型電熱恒溫水浴鍋，上海比郎儀器有限公司；TP1020自動脫水機，德國LEICA公司；EG1150H石蠟包埋機，德國LEICA公司；RM2016輪旋式切片機，德國LEICA公司；PHY-Ⅲ全自動病理組織烘片儀，常州中威電子儀器有限公司；400-S-Ⅱ電熱恒溫干燥箱，上海躍進醫(yī)療儀器廠；全自動血氣分析機，美國NOVA-K型。

1.3 造模與分組 30只健康SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、參附組3組，每組10只。采用單次小劑量輸注脂多糖的方法建立膿毒癥模型［8］。模型組、參附組分別尾靜脈注射0.1% LPS溶液10 mL/kg（即10 mg/kg），空白對照組注射等體積0.9%氯化鈉注射液。模型組和參附組注射LPS后逐漸出現(xiàn)行動遲緩、嗜睡、呼吸急促和顫抖。空白對照組與實驗前無明顯差別。建模后參附組立即尾靜脈注射參附注射液10 mL/kg（根據(jù)臨床用藥劑量的5倍換算而得），空白對照組、模型組分別尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg。造模后觀察6 h，如有大鼠死亡則記錄死亡時間，存活大鼠取標本進行檢測。

1.4 標本采集與檢測 各組大鼠均于造模6 h后腹腔注射10%水合氯醛溶液3 mL/kg，充分麻醉后固定大鼠，腹面向上，常規(guī)消毒胸、腹部皮膚，自陰囊上1cm至膈肌頂部，應用組織剪逐層剪開皮膚、腹壁肌肉層，應用無菌棉棒小心游離內(nèi)臟組織，充分暴露腹主動脈，鉗夾雙側髂總動脈分叉處，于該處近心端應用5號針頭抽血至無法抽出并應用生化管暫存。1）經(jīng)腹主動脈采血處死后，立即剪開大鼠膈肌、胸骨，充分暴露心肺，取左肺下葉、右肺下葉各1塊，左下肺行肺組織病理檢測，右下肺記錄肺濕/干重比（W/D）。2）血氣分析：腹主動脈取血0.5 mL，用于測定血氣分析。記錄pH、PaO2和乳酸（Lac）。3）肺組織病理檢測：取左下肺用10%甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、制成4 μm厚的切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織結構，每組隨機觀察3只大鼠的切片，每張切片隨機選出5個高倍視野，采取雙盲法進行肺損傷的輕重程度評分［9］。正?；驑O輕度損傷：0分；輕度損傷（＜25%）：1分；中度損傷（25%～50%）：2分；重度損傷（50%～75%）：3分；嚴重損傷（＞75%）：4分；將4項指標評分相加作為總分，分值越高，說明肺組織損傷越嚴重，見表1。4）血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、硫酸乙酰肝素（HS）、硫酸軟骨素（CS）檢測：取各組大鼠腹主動脈血4 mL靜置1 h待自然凝固后，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，采用ELISA 法檢測血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS水平。

表1 肺組織損傷評分表（分）

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS26.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，符合方差齊性的計量資料，組間比較采用單因素方差分析；不符合方差齊性的計量資料，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，等級資料組間比較用Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠pH、PaO2和Lac水平比較 見表2。模型組、參附組大鼠較空白對照組pH、PaO2顯著降低、Lac顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而參附組大鼠較模型組pH、PaO2有明顯上升、Lac明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠pH、PaO2水平為：空白對照組＞參附組＞模型組。Lac水平為：模型組＞參附組＞空白對照組。

表2 各組大鼠pH、PaO2和Lac水平比較（±s）

表2 各組大鼠pH、PaO2和Lac水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。1 mmHg≈0.133 kPa。

組別空白對照組模型組參附組n 10 10 10 pH 7.38±0.03△△7.25±0.06**7.36±0.05△△PaO2（mmHg）94.69±5.57△△70.65±7.84**82.79±6.75*△Lac（mmol/L）2.05±0.36△△4.34±0.65**3.33±0.54**△△

2.2 各組大鼠肺組織濕干重比的比較 見表3。結果顯示，模型組、參附組大鼠較空白對照組W/D顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而參附組顯著低于模型組（P＜0.01）。各組大鼠肺組織濕干重比水平為：模型組＞參附組＞空白對照組。

2.3 各組大鼠肺組織病理學改變 空白對照組大鼠肺組織結構完整，肺泡腔清晰，支氣管纖毛柱狀上皮細胞結構完整，內(nèi)有少量白細胞浸潤，未見水腫、滲出，血管周圍無水腫；模型組大鼠肺泡間隔增厚，肺泡破壞，肺泡壁水腫，肺泡內(nèi)見滲出、充血，肺間質大量中性粒細胞浸潤，氣管纖毛柱狀上皮倒伏、脫落，氣管內(nèi)炎性滲出，血管周圍水腫、白細胞浸潤，病理學評分顯著升高（P＜0.01）；參附組大鼠肺組織病變性質與模型組相同，肺組織損傷程度較模型組減輕，肺泡結構相對完整，肺間質有輕度或中度水腫，炎性細胞浸潤程度也較模型組明顯改善，肺損傷程度評分顯著降低（P＜0.05），3組肺損傷程度評分結果比較見表3，差異有顯著性（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠肺組織濕干重比及肺操作損傷程度評分比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織濕干重比及肺操作損傷程度評分比較（±s）

組 別n 肺W/D 肺損傷程度評分（分）空白對照組模型組參附組10 10 10 4.07±0.20△△5.15±0.19**4.55±0.13**△△0.90±0.74△△10.60±2.01**6.30±1.34*△

2.4 各組大鼠血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS水平比較 見表4。結果顯示，與空白對照組相比，模型組、參附組大鼠TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而參附組顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS 水平為：模型組＞參附組＞空白對照組。

表4 各組大鼠血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS水平比較（ng/mL，±s）

表4 各組大鼠血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS水平比較（ng/mL，±s）

組別空白對照組模型組參附組n 10 10 10 TNF-α 3.06±0.25△△4.44±0.27**3.50±0.27*△△MMP-1 166.98±15.25△△266.31±29.76**229.05±22.69**△Syndecan-1 14.45±1.77△△59.03±7.07**42.40±5.36**△△HS 73.76±5.03△△112.37±8.31**93.02±5.56**△△CS 1 412.07±215.95△△2 454.75±257.32**1 829.37±256.49*△△

3 討論

膿毒癥的發(fā)病機制很復雜［10］，內(nèi)皮細胞的活化和功能異常在膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，炎癥反應和抗炎反應失控是其突出表現(xiàn)，高發(fā)病率、高死亡率及發(fā)病機制復雜是其主要特點，器官損傷可見于肺、肝、腎、心臟和腸中，治療不及時可發(fā)展為ALI、ARDS和多器官功能障礙綜合征（MODS）［11］。

膿毒癥可歸屬于中醫(yī)學傷寒、溫病的范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》云“正氣存內(nèi)，邪不可干”“邪之所湊，其氣必虛”，其病機為正虛毒損、絡脈瘀滯［12］?！皽匦吧鲜?，首先犯肺”，肺為嬌臟，其位最高，正氣虛弱，毒邪驅散無力，毒邪內(nèi)侵使臟真受損；肺朝百脈，在膿毒癥傳變過程中，肺臟是易受毒邪侵襲之地，亦為毒邪積聚蘊生之所，內(nèi)外毒邪互結，灼傷肺臟脈絡及氣陰，肺宣降功能受損，發(fā)而致喘。故膿毒癥ALI為本虛標實證，其中陽氣虧虛是其本，痰濁、水飲、瘀血為其標，核心治法為益氣溫陽［13］。參附注射液來自傳統(tǒng)中醫(yī)方劑參附湯，由紅參、附子組成，主治元氣大虧。紅參為君藥，可大補元氣，益氣回陽，補陽固脫，附子大辛大熱，益火補陽，溫通經(jīng)脈，是為臣藥。二藥合用可增效減毒，有回陽救逆、益氣固脫的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)其具有抗缺血［14］、抗缺氧［14］、抗休克［15］、清除氧自由基、抗脂質過氧化［16］、減輕肺缺血/再灌注［17］、增強機體非特異性抵抗力、雙向調節(jié)血壓［18］、降低血清炎癥因子水平、改善過度炎癥反應［19］、減輕血管內(nèi)皮損傷［20］等作用。一系列臨床及實驗研究表明參附注射液治療膿毒癥可提高臨床治愈率和效率，改善預后和器官功能［21］。參附注射液干預ALI大鼠能夠提高細胞免疫功能，改善機體防御機制，減少氧自由基，改善肺組織炎性浸潤，減輕肺部出血、水腫及肺不張，并促進肺組織的修復［22］。

LPS可引起大鼠肺臟腫脹、出血、結構破壞、炎性細胞浸潤，因此常用于建立膿毒癥ALI模型。內(nèi)皮細胞過度活化可導致血管通透性增加、內(nèi)皮損傷、白細胞黏附增加、凝血功能障礙，并最終導致微循環(huán)功能障礙并促進膿毒癥的進展。因此，一些研究人員認為膿毒癥主要是微循環(huán)疾?。?3］。在生理條件下，內(nèi)皮細胞表面覆蓋有多糖包被，可以維持正常的血管通透性。它可以防止白細胞黏附于內(nèi)皮細胞，防止凝血機制過度活化，減少微血栓形成，并保持內(nèi)腔暢通。多糖包被主要由糖胺聚糖側鏈和核心蛋白組成，最重要的核心糖蛋白是syndecan-1，它對于維持多糖包被的正常結構和功能至關重要。MMP-1是基質金屬蛋白酶（MMPs）家族的重要成員，能特異性剪切syndecan-1，從而導致多糖包被降解，進而引發(fā)微循環(huán)障礙。多項動物研究證明：膿毒癥時循環(huán)中MMP-1水平顯著升高［24-25］。syndecan-1、HS、CS在維持多糖包被結構、血管通透性、信號傳導、炎癥反應、微生物侵襲和凝血功能方面均發(fā)揮重要作用。TNF-α由活化的單核-巨噬細胞產(chǎn)生，參與炎癥反應的發(fā)生，常用于評估炎癥反應程度。

目前認為：多糖包被的破壞是導致膿毒癥中毛細血管通透性增加的主要機制［26］，而膿毒癥局部或全身的炎癥反應可以加速破壞多糖包被的結構與功能［27］。在膿毒癥中，促炎細胞因子激活導致基質金屬蛋白酶過量表達，使多糖包被被降解并且無法執(zhí)行其正常功能，使血管通透性下降并加重水、蛋白及各種溶質的丟失，造成組織間隙水腫。Schmidt EP等［28］發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠通過TNF-α快速誘導肺微血管多糖包被降解，降解將多糖包被成分，例如syndecan-1、HS、CS、硫酸軟骨素（HA）釋放到血漿中，從而導致血管通透性增強，組織間隙水腫，彌散距離增大，影響肺內(nèi)氣體交換和組織供氧，并可導致肺水腫。

在本研究中，與空白對照組相比，LPS靜脈注射可引起大鼠肺泡間隔水腫、肺泡結構破壞、肺出血、炎性細胞浸潤、W/D比值增高，血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS水平下降等病理表現(xiàn)；臨床表現(xiàn)也出現(xiàn)Lac上升、PaO2進行性下降。與模型組相比，參附組血清TNF-α、MMP-1、Syndecan-1、HS、CS水平下降，反映了參附注射液可減輕膿毒癥誘導的炎癥反應及內(nèi)皮多糖包被降解，維持多糖包被的完整性。參附組PaO2升高，表明參附組換氣功能得到改善，間接證明了參附組的肺血管通透性降低、肺內(nèi)滲出減少。參附組的W/D比明顯降低，表明參附注射液可改善肺水腫并降低肺毛細血管通透性。實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠ALI病理學形態(tài)主要表現(xiàn)為肺泡間隔水腫、肺泡隔毛細血管明顯淤血、大量中性粒細胞浸潤；模型組大鼠給予參附注射液后，肺泡及肺部充血、水腫及炎癥情況相對于模型組明顯改善，ALI的病理改變顯著減輕，說明參附注射液對膿毒癥大鼠肺組織有保護作用，為參附注射液改善膿毒癥所致肺損傷提供了依據(jù)。

綜上所述，參附注射液對改善膿毒性肺損傷有一定作用。其機制可能是：1）通過降低炎癥水平，抑制MMP-1的過量表達，減少內(nèi)皮多糖包被的降解，從而降低肺毛細血管的通透性，改善氧合，保護肺組織并減輕肺部及全身的炎癥反應；2）參附注射液通過調節(jié)免疫系統(tǒng)，增強機體免疫細胞的功能，抑制炎癥反應，減輕器官損傷；3）參附注射液通過加強肝臟解毒代謝功能，而減輕LPS對肺組織的損傷；4）改善微循環(huán)，增強對組織對缺氧的耐受，促進氧的與應用。但是，該實驗仍然存在幾個問題：首先，大鼠膿毒癥模型不能完全反映人類膿毒癥；其次，本研究評估了參附注射液對膿毒癥大鼠的短期效果，但未評估其長期效果。因此還需要進一步長期研究參附注射液對膿毒癥肺損傷的保護作用；另外，參附注射液存在個體差異的過敏現(xiàn)象，臨床使用應詳細詢問有無過敏史，并對高敏者做過敏試驗。