常 振，鄧昌蓉,2，張彥君，劉 敏，邵登魁,2*

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016;2.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

結(jié)球甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)簡稱甘藍(lán)，是由不結(jié)球野生甘藍(lán)進(jìn)化而來的兩年生十字花科蕓薹屬作物，十六世紀(jì)開始由地中海沿岸傳入我國。因其抗逆性強(qiáng)、易栽培、耐運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)，迅速在全國范圍廣泛種植，是我國僅次于白菜的主栽蔬菜[1]。野生結(jié)球甘藍(lán)的葉片表面有一層灰綠色的蠟質(zhì)覆蓋，結(jié)球甘藍(lán)蠟質(zhì)缺失突變體葉片表現(xiàn)為無蠟或少蠟，葉片光亮油綠，具有較好的商品性。研究發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)是植物排出細(xì)胞外的長鏈脂肪酸、烷烴、烯烴、醇類和醛類等多種化合物的集合，也是表皮細(xì)胞與外界環(huán)境直接接觸的主要構(gòu)成物質(zhì)，是植物表皮細(xì)胞外層最主要的保護(hù)性屏障[2]。

研究表明十字花科植物在低溫脅迫[3]、水分脅迫[4]、紫外線脅迫[5]、干旱脅迫[6]等環(huán)境下，植物葉片表皮蠟質(zhì)化程度均會提升，來抵御逆境。青海省屬大陸性高原半干旱氣候，適宜露地蔬菜生長的區(qū)域年平均氣溫3.4℃-9.6℃，葉類蔬菜的種植周期短，早春低溫環(huán)境嚴(yán)重制約結(jié)球甘藍(lán)種植面積的擴(kuò)大，低溫脅迫會導(dǎo)致甘藍(lán)生長緩慢、生活力降低。植物內(nèi)部會啟動一系列響應(yīng)機(jī)制來響應(yīng)低溫環(huán)境，前人研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下羽衣甘藍(lán)[7]、小白菜[8]、甜菜[9]等葉片內(nèi)相對含水量、可溶性蛋白、丙二醛(MDA)、脯氨酸、抗氧化酶活性等均顯著增加，葛君等[10]研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫對小麥葉片光合色素含量有顯著影響。前人研究還發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)與植物對溫度的適應(yīng)相關(guān)，有蠟質(zhì)覆蓋的柑橘、葡萄均比無蠟質(zhì)覆蓋的柑橘、葡萄有更強(qiáng)的耐低溫性[11-12]。目前關(guān)于結(jié)球甘藍(lán)葉面蠟質(zhì)與低溫耐性的關(guān)系尚不明確，本研究以2份不同葉面蠟質(zhì)覆蓋度的結(jié)球甘藍(lán)為試驗(yàn)材料，旨在探討低溫對不同葉面蠟質(zhì)覆蓋度的結(jié)球甘藍(lán)的影響，有助于進(jìn)一步解析結(jié)球甘藍(lán)葉面蠟質(zhì)與低溫互作機(jī)制，從而對后續(xù)結(jié)球甘藍(lán)的抗低溫性機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及低溫處理

本試驗(yàn)選取的厚蠟質(zhì)材料HQ2-1與蠟質(zhì)缺失突變體Y2-1兩份材料均來源于青海省農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所。待2份材料幼苗長至兩葉一心時(shí)，選取長勢一致的幼苗移至人工氣候箱中進(jìn)行低溫處理，低溫環(huán)境為晝溫10℃，夜溫5℃，光照時(shí)間14h/d，光照強(qiáng)度12000Lx，空氣相對濕度 70%；對照處理溫度為晝溫20℃，夜溫10℃，其它條件均一致。以第3片真葉完全展開、第4片真葉剛長出時(shí)為標(biāo)準(zhǔn)，取長勢整齊的幼苗第3片真葉進(jìn)行各生理生化指標(biāo)測定。

1.2 測定指標(biāo)與方法

每處理隨機(jī)選取3株結(jié)球甘藍(lán)幼苗，以結(jié)球甘藍(lán)幼苗最外層的第3片真葉為試材，測葉長、葉寬、葉柄長、葉柄重、葉全鮮重、葉全干重，求平均值。相對水含量參照王玉賢[13]的方法測定，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量參照李合生[14]的方法測定，丙二醛(MDA)含量參照王學(xué)奎[15]的方法測定，游離脯氨酸含量參照孔祥生[16]的方法測定，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等抗氧化物酶活性參照王學(xué)奎[17]的方法測定，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素、類胡蘿卜素等光合色素含量測定參照葛君[10]的方法測定。每個(gè)測定指標(biāo)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)采用軟件SPSS 20.0和 Microsoft Excel 2010 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，數(shù)據(jù)差異的顯著性采用 Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行估算。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對不同葉面蠟質(zhì)覆蓋度的結(jié)球甘藍(lán)幼苗生長特性的影響

試驗(yàn)結(jié)果(圖1、圖2)顯示，低溫脅迫下HQ2-1和Y2-1的葉片生長相比于各自對照明顯受到抑制，葉片偏??；由表1可知，低溫脅迫下HQ2-1與Y2-1葉長分別比對照減少26.65%、39.58%，葉寬分別比對照減少16.83%、35.03%，均差異顯著；低溫脅迫下HQ2-1葉柄長降低23.18%，降幅低于Y2-1的26.67%，葉柄重均無顯著差異；低溫脅迫下HQ2-1葉片相對含水量顯著下降3.57%，低于Y2-1的4.19%降幅。結(jié)果表明低溫脅迫下2份材料葉片生長均受到明顯抑制，其中HQ2-1的葉片生長的受抑制程度及相對含水量的下降幅度均小于Y2-1。

注：圖中CK表示常溫對照，LT表示低溫脅迫；下圖同。Note:In the figue,CK is normal temperature control,LT is low temperature stress;The following figue with.圖1 HQ2-1葉表面與Y2-1葉表面Figue.1 Leaf surfaces of HQ2-1 and Y2-1

圖2 HQ2-1葉背面，Y2-1葉背面Figue.2 HQ2-1 leaf abaxial，Y2-1 leaf abaxial

表1 低溫脅迫對不同葉面蠟質(zhì)覆蓋度的結(jié)球甘藍(lán)幼苗葉片生長指標(biāo)的影響Table.1 Effects of low temperature stress on leaf growth indexes of Cabbage seedlings with different wax coverage

2.2 低溫脅迫對不同葉面蠟質(zhì)覆蓋度的結(jié)球甘藍(lán)幼苗可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

從圖3可知，受低溫脅迫后HQ2-1與Y2-1的可溶性糖含量分別比對照上升173.58%、148.64%，均差異顯著，且HQ2-1增幅顯著高于Y2-1?？扇苄缘鞍缀渴侵参锬偷蜏匦缘闹匾笜?biāo)，耐低溫能力越強(qiáng)可溶性蛋白含量越高，低溫脅迫下HQ2-1與Y2-1的可溶性蛋白含量較各自對照均顯著增加，HQ2-1增加20.27%，顯著高于Y2-1的14.49%的增幅。結(jié)果表明低溫脅迫下HQ2-1葉片的可溶性糖及可溶性蛋白的增加量均顯著高于Y2-1。

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下圖同。Note:Different lowercase letters in the figure indicate significant difference (P<0.05)，same as below.圖3 低溫脅迫對不同蠟質(zhì)覆蓋度的結(jié)球甘藍(lán)幼苗可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響Figure.3 Effects of low temperature stress on soluble sugar and soluble protein contents of Cabbage seedlings with different wax coverage

2.3 低溫脅迫對不同葉面蠟質(zhì)覆蓋度的結(jié)球甘藍(lán)幼苗MDA含量和游離脯氨酸含量的影響

從圖4可知，對照處理下HQ2-1與Y2-1葉片中MDA含量和游離脯氨酸含量均無明顯差異。經(jīng)低溫脅迫處理后，HQ2-1與Y2-1葉片中MDA 含量較各自對照均顯著升高，方差分析結(jié)果顯示，低溫處理的兩個(gè)材料間MDA 含量水平接近，無顯著差異；游離脯氨酸可進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)來提高植物耐低溫性，低溫脅迫下2份材料中游離脯氨酸含量均顯著增加，HQ2-1增幅顯著高于Y2-1。結(jié)果表明低溫脅迫下HQ2-1比Y2-1的葉片細(xì)胞膜透性受到的損傷較輕。

圖4 低溫脅迫對不同葉面蠟質(zhì)覆蓋度的結(jié)球甘藍(lán)幼苗MDA 含量、游離脯氨酸含量的影響Figue.4 Effects of low temperature stress on MDA content and free proline content of Cabbage seedlings with different wax coverage

2.4 低溫脅迫對不同葉面蠟質(zhì)覆蓋度結(jié)球甘藍(lán)幼苗抗氧化物酶活性的影響

從圖5可知，低溫脅迫下2份不同蠟質(zhì)覆蓋度的材料幼苗的SOD、POD、CAT及APX等抗氧化酶活性較各自對照均明顯上升。其中，HQ2-1的 POD、CAT及APX等抗氧化酶活性分別比對照增加了81.43%、127.16%及20.68%，均高于Y2-1的54.61%、42.27%及20.57%；HQ2-1的SOD活性增幅為70.51%，低于Y2-1的82.38%。結(jié)果表明低溫脅迫下HQ2-1葉片中POD、CAT及APX等抗氧化酶活性均高于Y2-1。

圖5 低溫脅迫對不同蠟質(zhì)覆蓋度的結(jié)球甘藍(lán)幼苗抗氧化酶活性的影響Figue.5 Effects of low temperature stress on antioxidant enzyme activities in Cabbage seedlings with different wax coverage

2.5 低溫脅迫對不同葉面蠟質(zhì)覆蓋度的結(jié)球甘藍(lán)幼苗光合色素的影響

葉綠體作為植物細(xì)胞能量代謝的場所，光合色素參與吸收、傳遞光能等環(huán)節(jié)。本研究通過測定低溫處理下結(jié)球甘藍(lán)幼苗葉綠素a、葉綠素b、葉綠素、類胡蘿卜素等光合色素來說明低溫對光合系統(tǒng)的影響。從圖6可知，無論常溫對照還是低溫脅迫，蠟質(zhì)缺失突變體Y2-1各光合色素含量高于厚蠟質(zhì)材料HQ2-1，但低溫脅迫下HQ2-1與Y2-1葉片的各光合色素含量均被降解，其中Y2-1葉片中葉綠素a、葉綠素及類胡蘿卜素光合色素含量較對照分別下降34.53%、14.63%及28.54%，均高于HQ2-1的22.10%、14.48%、25.41%，而Y2-1中葉綠素b含量下降13.11%，低于HQ2-1的35.40%。結(jié)果表明Y2-1葉片中的光合色素含量高于HQ2-1，但低溫脅迫下Y2-1葉片中除葉綠素b外，葉綠素a、葉綠素及類胡蘿卜素等光合色素的含量下降幅度均高于HQ2-1，說明低溫脅迫對Y2-1葉片中光合色素降解的影響高于HQ2-1。

圖6 低溫脅迫對不同葉面蠟質(zhì)覆蓋度的結(jié)球甘藍(lán)幼苗光合色素含量影響Figue.6 Effects of low temperature stress on photosynthetic pigment content of Cabbage seedlings with different foliar wax coverage

3 討論與結(jié)論

低溫是影響植物生長發(fā)育的重要非生物脅迫因素，本試驗(yàn)對低溫脅迫下2份不同葉面蠟質(zhì)覆蓋度的結(jié)球甘藍(lán)幼葉期生長特性及生理生化指標(biāo)差異進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明低溫脅迫下HQ2-1和Y2-1的葉片生長均受到抑制，這與秦文斌在甘藍(lán)幼苗研究結(jié)果一致[18]；Y2-1相對含水量下降幅度高于HQ2-1，這可能是由于厚蠟質(zhì)材料HQ2-1 的表層蠟質(zhì)屏障可減少水分的散失造成，在后續(xù)試驗(yàn)中測定葉片蒸騰速率等指標(biāo)來驗(yàn)證。前人研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)可溶性糖含量及可溶性蛋白含量均與植物耐低溫性成正比，其中可溶性糖一方面維持細(xì)胞滲透勢，另一方面作為植物呼吸作用的底物，從而增強(qiáng)作物抗凍性；可溶性蛋白多為低溫脅迫下參與催化反應(yīng)的酶，功能上起到調(diào)節(jié)耐低溫基因表達(dá)的作用，本試驗(yàn)中低溫脅迫下2份材料的可溶性糖及可溶性蛋白含量均顯著增加，這與前人研究結(jié)果一致[19]，其中HQ2-1可溶性糖及可溶性蛋白含量增幅顯著高于Y2-1，說明低溫脅迫會引起HQ2-1更多耐低溫基因的表達(dá)。低溫脅迫下2份材料丙二醛(MDA)含量均增加，說明低溫脅迫對2份結(jié)球甘藍(lán)幼苗的細(xì)胞膜均造成了不同程度的損傷，這與朱惠霞等在冬油菜中研究低溫脅迫對其的影響一致[20]。游離脯氨酸因含有亞氨基，利于蛋白質(zhì)水合作用，因此作為滲透調(diào)節(jié)劑在植物抗逆境環(huán)境中起重要作用，游離脯氨酸含量的增加有助于提高作物的耐低溫性[21]。本研究中2份材料在低溫環(huán)境中游離脯氨酸含量均顯著積累，HQ2-1累積量明顯高于Y2-1，說明低溫脅迫下HQ2-1通過積累更多的游離脯氨酸來提高自身耐低溫性。

低溫脅迫使植物葉片中碳同化和電子傳遞鏈?zhǔn)艿揭种?，?dǎo)致細(xì)胞膜過氧化損傷及丙二醛外滲，細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基迅速累積后得不到清除，而 SOD、POD 、CAT及APX 是植物抵抗逆境脅迫時(shí)在其抗氧化系統(tǒng)中起重要作用的酶，起到清除活性氧自由基的作用，因此植物抗寒性與抗氧化酶的活性呈顯著正相關(guān)[13]。本研究表明，在低溫脅迫下2份材料的抗氧化酶促反應(yīng)均被激活，APX雖有增加，但差異不顯著，HQ2-1的SOD活性增幅低于Y2-1，這與秦文斌等的研究結(jié)果相反[18]，可能是由于HQ2-1表皮蠟質(zhì)層有一定的保溫作用，對低溫靈敏性較低，影響到SOD活性的變化，后續(xù)試驗(yàn)將進(jìn)一步驗(yàn)證。HQ2-1中POD和CAT等抗氧化酶活性上升幅度均顯著高于Y2-1，這與Lee等的研究結(jié)果一致[22]，表明HQ2-1的 POD和CAT 等酶活性顯著上升對于結(jié)球甘藍(lán)耐低溫性的增強(qiáng)起重要作用。

植物葉片光合色素含量會影響葉綠素對光能的吸收、電子傳遞之間的分配，從而影響光合作用，低溫脅迫一方面會降低葉綠素合成相關(guān)酶的活性，影響葉綠素合成；另一方面會減弱呼吸作用，致使過多的氧自由基破壞葉綠體膜，迫使葉綠素分解，最終影響光合速率[23]。本試驗(yàn)表明Y2-1葉綠素等光合色素含量均高于HQ2-1，這與觀察到的Y2-1葉片光亮油綠特點(diǎn)相一致，低溫脅迫下2份不同蠟質(zhì)覆蓋度的結(jié)球甘藍(lán)材料中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素、類胡蘿卜素等光合色素含量均下降，試驗(yàn)結(jié)果與葛君研究結(jié)論一致[10]，HQ2-1中除葉綠素b含量降幅高于Y2-1外，HQ2-1中葉綠素、葉綠素a和類胡蘿卜素等光合色素降幅均低于Y2-1。低溫脅迫降低了酶活，進(jìn)而降低光合色素生物合成速率，導(dǎo)致光合色素含量下降，蠟質(zhì)缺失突變體Y2-1光合色素降解幅度大于厚蠟質(zhì)材料HQ2-1，可能是由于低溫脅迫導(dǎo)致HQ2-1葉表皮蠟質(zhì)增厚，一定程度起到保溫效果，減緩葉綠素等光合色素降解幅度。

與蠟質(zhì)缺失突變體Y2-1相比，厚蠟質(zhì)材料HQ2-1更有效響應(yīng)低溫脅迫，低溫脅迫下HQ2-1葉片生長受到抑制程度、相對含水量及光合色素等的降低幅度均小于Y2-1，HQ2-1可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸及抗氧化物酶活性的增幅均高于 Y2-1。綜上所述，HQ2-1 在低溫環(huán)境中通過提高滲透調(diào)節(jié)能力、減少細(xì)胞膜損傷等防止內(nèi)含物流出；通過增強(qiáng)抗氧化酶活性促進(jìn)耐低溫基因的表達(dá)，從而提高低溫適應(yīng)性，進(jìn)而減緩光合色素的降解。所以，厚蠟質(zhì)材料HQ2-1比蠟質(zhì)缺失突變體Y2-1有更強(qiáng)低溫適應(yīng)性。