李 芮，劉曉宇，劉 樂，隗正陽，賈亞濤，關(guān)露露，吳洪啟，李春蓮，汪 勇，王中華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)重點實驗室, 陜西 楊凌 712100)

植物表皮蠟質(zhì)即植物積累在植物細胞壁外側(cè)的脂溶性結(jié)構(gòu)，其廣泛存在于植物與空氣直接接觸的表面，并在植物表面形成一道天然薄膜，具有保護植物免受物理損傷、病蟲害入侵、紫外線灼傷等作用，同時也防止植物非氣孔性水分散失、提高植物光合效率[1-5]。因此探究植物表皮蠟質(zhì)的組成變化對了解植物抗逆性具有重要意義。在植物生長發(fā)育過程中，蠟質(zhì)的含量、組分和晶體結(jié)構(gòu)與環(huán)境條件密切相關(guān)，干旱及陽光充足的情況下蠟質(zhì)含量會顯著增加，同時也會造成蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的改變[6]。表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)也會因不同植物或同種植物不同器官而存在不同的形狀，如片狀、圓柱狀、管狀等[7-9]。蠟質(zhì)組成中含有大量的伯醇和萜類化合物，會呈現(xiàn)片狀的晶體結(jié)構(gòu)，而含有大量的二酮、仲醇和二醇等化合物則會呈現(xiàn)柱狀晶體[6]。植物表皮蠟質(zhì)通常由多種化合物組成，已有研究證實，脂肪醇、烷烴、醛、酮、酯、脂肪酸、萜類、酚類、固醇等化合物在水稻、小麥、玉米、高粱等作物中普遍存在[10-13]。

糜子(PanicummiliaceumL.)在我國干旱半干旱地區(qū)廣泛種植，同時也是重要的糧食作物，其葉片上、下表面均有較厚的角質(zhì)膜且分布有大量蠟質(zhì)，氣孔分布于葉表面且下陷[14]。糜子的生理代謝、生長發(fā)育、產(chǎn)量及品質(zhì)均受干旱的影響。目前關(guān)于糜子抗旱方面的研究多集中于糜子對干旱逆境的生理生態(tài)響應(yīng)[15]、抗旱遺傳資源[16-17]及抗旱基因[18]等方面，而有關(guān)糜子表皮蠟質(zhì)的研究鮮有報道。糜子、水稻等作物不同的器官表皮蠟質(zhì)性狀也影響著作物的抗旱性。因此，研究糜子表皮蠟質(zhì)組成及晶體結(jié)構(gòu)，將為糜子抗旱性研究和品種選育提供一條新的思路和途徑。本研究選取5種糜子品種作為試驗材料，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對不同品種及不同時期糜子葉片表皮蠟質(zhì)組成成分、含量進行測定與分析，并利用掃描電子顯微鏡觀察葉片表皮蠟質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)，以了解糜子蠟質(zhì)的組成及晶體形態(tài)，為進一步探究糜子蠟質(zhì)組成與抗旱性的關(guān)系及其蠟質(zhì)合成途徑的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為普通糜子品種榆黍1號、雁黍7號、隴糜8號、晉黍9號和寧糜10號，種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)科研試驗田。為了檢測不同品種糜子葉片表皮蠟質(zhì)含量，分別提取開花期的榆黍1號、雁黍7號、隴糜8號、晉黍9號和寧糜10號旗葉葉片表皮蠟質(zhì)進行氣相色譜分析，并利用掃描電子顯微鏡觀察不同品種糜子旗葉葉片的晶體結(jié)構(gòu)。為了分析不同生長發(fā)育時期糜子葉片表皮蠟質(zhì)含量的變化情況，取榆黍1號在出苗生長15 d(三葉期)、20 d、25 d、30 d、35 d(開花期)和40 d(灌漿期)的植株上部發(fā)育完好的葉片，分別提取表皮蠟質(zhì)并進行氣相色譜分析。所有進行氣相色譜分析的樣品均取4個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 糜子葉片表皮蠟質(zhì)的提取

將糜子樣品小心剪成小段置于50 mL燒杯中，在通風(fēng)櫥內(nèi)向燒杯中倒入氯仿直至將樣品完全浸沒。鑷子輕翻葉片后將葉片取出，以保證蠟質(zhì)完全溶解。在燒杯中用玻璃注射器加入10 μL濃度為1 mg·mL-1的C24烷烴作為內(nèi)標(biāo)，放置于通風(fēng)櫥中以使氯仿自然揮發(fā)。待氯仿?lián)]發(fā)至10 ml左右，用玻璃漏斗將其過濾至15 mL樣品瓶中，同時使用氯仿漂洗燒杯3次，并將漂洗液全部過濾至樣品瓶。將其置于通風(fēng)櫥中自然揮發(fā)，待揮發(fā)至1 mL時用膠頭滴管轉(zhuǎn)入GC樣品瓶中，同時漂洗過濾液樣品瓶并全部轉(zhuǎn)入GC樣品瓶。在通風(fēng)櫥中使用氮氣恒溫吹干儀將樣品吹干后，用玻璃注射器加入30 μL吡啶和30 μL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，立刻蓋好瓶蓋。在70℃反應(yīng)50 min后使用氮氣將反應(yīng)液吹干，再加入1 mL氯仿回溶，以供GC-MS分析。

1.3 蠟質(zhì)成分色譜分析

對于蠟質(zhì)組成成分的檢測與分析使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS-QP2010，日本島津)。將檢測出的離子峰通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行搜索和比對，對蠟質(zhì)各組分進行定性分析并得到標(biāo)準(zhǔn)樣品圖。利用Lab Solution軟件對蠟質(zhì)各組分離子峰進行積分，計算峰面積，根據(jù)C24內(nèi)標(biāo)的含量定量分析蠟質(zhì)各組分化合物。同時糜子葉片樣品采用掃描儀進行葉片表面掃描，并用Image J軟件計算表面積。蠟質(zhì)含量的計算公式為：表皮蠟質(zhì)絕對含量=各蠟質(zhì)組分化合物離子峰面積/內(nèi)標(biāo)離子峰面積×內(nèi)標(biāo)加入量/樣品表面積；蠟質(zhì)相對含量=蠟質(zhì)絕對含量/蠟質(zhì)總含量×100%。

1.4 掃描電子顯微鏡觀察

選取表面未被破壞且平整的不同品種糜子葉片，用鑷子輕放于白紙上并用回形針固定。將固定好的葉片放置于烘箱中干燥，待水分完全散失后進行掃描電子顯微鏡觀察并拍照。掃描電子顯微鏡使用方法：在掃描電子顯微鏡樣品盤上粘貼適量導(dǎo)電膠，將水分完全散失的葉片樣品取出，刀片切取2 mm×2 mm樣品并粘貼至導(dǎo)電膠上。將樣品盤抽真空并噴金鍍膜，即可進行掃描觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 糜子葉片表皮蠟質(zhì)組成成分分析

由圖1可見，氣相色譜離子峰圖顯示不同離子峰均獨立分布，表明糜子葉片表皮蠟質(zhì)中各類化合物均被很好分離，而且不同品種間葉片表皮蠟質(zhì)組成比較相似。經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，共鑒別出20種化合物，主要分為烷烴、初級醇和萜類。其中，烷烴類化合物有11種，碳鏈長度為C25-C35；初級醇類化合物有7種，均為偶數(shù)碳原子(C22-C34)；萜類物質(zhì)有2種，分別為β-Amyrin和α-Amyrin。

注：1：內(nèi)參；2：C25烷烴；3：C22醇；4：C26烷烴；5：C27烷烴；6：C24醇；7：C28烷烴；8：C29烷烴；9：C26醇；10：C30烷烴；11：C31烷烴；12：C28醇；13：C32烷烴；14：C33烷烴；15：β-Amyrin；16：α-Amyrin；17：C34烷烴；18：C35烷烴；19：C32醇；20：C34醇。Note: 1: Internal standard; 2: C25H52; 3: Docosanol; 4:C26H54; 5: C27H56; 6: Tetracosanol; 7: C28H58; 8: C29H60; 9: Hexacosanol; 10: C30H62; 11: C31H64; 12: Octacosanol; 13: C32H66; 14:C33H68; 15: β-Amyrin; 16: α-Amyrin; 17:C34H70; 18: C35H72; 19: Dotriacontanol; 20: Tetratriacontanol.

2.2 糜子葉片表皮蠟質(zhì)各組分含量分析

通過定量分析發(fā)現(xiàn)，初級醇含量在各糜子品種葉片表皮蠟質(zhì)的各組分含量中占比最高，其次是烷烴，并含有少量的萜類(表1)。品種間葉片總蠟質(zhì)含量存在明顯差異，其中榆黍1號蠟質(zhì)總含量最高，為25.87 μg·cm-2，寧糜10號蠟質(zhì)總含量最低，為17.99 μg·cm-2(表1)。初級醇含量也有顯著差異，其中榆黍1號初級醇含量顯著高于其他各品種。初級醇平均約占蠟質(zhì)總量的67.46%，其中隴糜8號最低為65.41%，榆黍1號最高為71.09%；烷烴平均約占總量的29.01%，其中榆黍1號最低為26.05%，隴糜8號最高為31.03%。

對初級醇不同長度碳鏈化合物分析表明，C32醇含量最高，約占初級醇總量的82.73%；其次是C30和C34醇，分別占總量的7.70%和6.18%。此外，C28醇含量較低，占總量的1.83%，而C22醇、C24和C26醇含量極低，均小于1%(圖2)。對烷烴不同長度碳鏈化合物分析表明，C33烷烴含量最高，約占烷烴總量的36.92%；其次是C31烷烴和C34烷烴，分別占總量的30.49%和18.17%。而C27、C29、C30、C32、C35烷烴含量相對較少，約小于5%。此外，糜子葉片表皮蠟質(zhì)中C25、C26和C28烷烴含量極低，均小于1%(圖3)。

注：不同字母代表同一物質(zhì)不同品種間差異，小寫字母表示在P<0.05水平顯著差異，大寫字母表示在P<0.01水平顯著差異。下同。Note：Different letters in the same substance represent different varieties, lowercase letters mean significant difference at P<0.05 level，uppercase letters mean significant difference at P<0.01 leveL. The same below.

圖3 糜子生長發(fā)育35 d葉片中不同鏈長烷烴的絕對含量

2.3 不同糜子品種旗葉葉片表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)觀察

掃描電鏡觀察結(jié)果表明，糜子旗葉葉片表面覆蓋有大量的蠟質(zhì)晶體，晶體類型主要呈片狀。葉片上、下表面的蠟質(zhì)晶體密集度具有明顯的差異，呈片狀的蠟質(zhì)晶體緊密而均勻地分布于整個葉片的上表面，葉片下表面的片狀蠟質(zhì)晶體很少，整個表面相對比較平滑。不同糜子品種間葉片表皮蠟質(zhì)晶體密集程度存在顯著差異，其中榆黍1號和晉黍9號葉片上表面蠟質(zhì)晶體分布最為緊密，寧糜10號則相對稀疏。并且榆黍1號葉片下表面含有少量顆粒狀蠟質(zhì)晶體而其他品種則相對比較平滑(圖4)。

注: A和B: 晉黍9號葉片; C和D: 隴糜8號葉片; E和F: 寧糜10號葉片; G和H: 雁黍7號葉片; I和J: 榆黍1號葉片。Note: A and B:Leaves of Jinshu 9; C and D: Leaves of Longmi 8; E and F: Leaves of Ningmi 10; G and H: Leaves of Yanshu 7; I and J: Leaves of Yushu 1.

2.4 糜子不同生長發(fā)育時期葉片表皮蠟質(zhì)組分分析

以榆黍1號為例，從表2可知，糜子葉片不同生長發(fā)育時期蠟質(zhì)組成比較相似，均含有初級醇、烷烴及萜類物質(zhì)；并且各發(fā)育時期均以初級醇含量最高，其次為烷烴含量，而萜類物質(zhì)含量最低(表2)。不同的是，各發(fā)育時期糜子葉片總蠟質(zhì)含量以及各組分含量均有顯著差異。在生長發(fā)育15 d時，由于糜子處于生長發(fā)育初期階段，蠟質(zhì)合成活動進行得緩慢，造成蠟質(zhì)總量積累較少。隨著糜子的生長發(fā)育，蠟質(zhì)合成活動逐漸活躍，葉片蠟質(zhì)不斷積累，在20、25、30、35 d和40 d時的蠟質(zhì)總含量分別是15 d時的1.5、1.7、1.9、2.4和2.6倍(表2)。各蠟質(zhì)組分含量總體也表現(xiàn)出隨著糜子的生長發(fā)育而不斷增加的趨勢。其中初級醇的含量在發(fā)育15～25 d期間穩(wěn)定升高，在25 d時達到13.79 μg·cm-2，占總蠟質(zhì)含量的74.46%；25～30 d期間稍有降低，在30天時降至12.95 μg·cm-2，占總含量的64.91%；30～35 d期間出現(xiàn)初級醇絕對含量快速增加的過程，在35 d含量最高為18.39 μg·cm-2，占總含量的71.09%；而在發(fā)育后期即35 d之后逐漸降低(表2)。烷烴含量的變化也表現(xiàn)出相似的模式，在發(fā)育15～20 d期間，烷烴含量穩(wěn)定升高，在20 d時達到5.71 μg·cm-2，占總含量的36.60%；在20～25 d期間稍有降低，25 d時降至4.06 μg·cm-2，占總含量的21.92%；而在25 d之后穩(wěn)定增加，烷烴絕對含量快速增加過程出現(xiàn)在35～40 d，在40 d時含量最高為11.31 μg·cm-2，占總蠟質(zhì)含量的40.52%(表2)。萜類物質(zhì)絕對含量同蠟質(zhì)總量變化相同，即隨著生長發(fā)育不斷增加，在40 d時含量最高，為0.77 μg·cm-2(表2)，但相對含量隨生長發(fā)育不斷降低。

表2 榆黍1號不同時期葉片表皮各組分含量/(μg·cm-2±SD)

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，糜子葉片的表皮蠟質(zhì)主要由20種有機化合物組成，包括11種烷烴、7種初級醇、以及2種三萜類物質(zhì)。所選用材料為黃土高原區(qū)種植的普通糜子品種榆黍1號、雁黍7號、隴糜8號、晉黍9號和寧糜10號，不同品種糜子間蠟質(zhì)成分及各化合物所占比例比較相似，說明糜子葉片表皮蠟質(zhì)組成成分在不同糜子品種間是相對穩(wěn)定的。但不同品種的蠟質(zhì)總含量卻存在著明顯的差異，使這些品種呈現(xiàn)出高蠟和低蠟的特征，比如高蠟品種榆黍1號蠟質(zhì)總含量是低蠟品種寧糜10號的1.4倍。

在禾本科主要糧食作物中，玉米葉片蠟質(zhì)成分為烷烴、醇、醛、酯類和脂肪酸，其中醇、脂肪酸和酯為最主要成分，蠟質(zhì)組分的碳鏈分布主要集中在C25-C48[11]；小麥葉片蠟質(zhì)中初級醇、烷烴和二酮為主要成分，蠟質(zhì)組分的碳鏈分布主要集中在C25-C31[9,12]；高粱葉片蠟質(zhì)成分為醛、烷烴、初級醇、脂肪酸和酮類物質(zhì)[13]。而本研究表明，糜子不同品種及不同生長發(fā)育時期葉片表皮蠟質(zhì)均以初級脂肪醇為主，C32醇含量最高；其次是烷烴，C33及C31烷烴含量相對較高；萜類含量最低。這與水稻、玉米及高粱等作物的蠟質(zhì)組成有一定的差別，暗示糜子蠟質(zhì)合成與調(diào)控途徑與水稻、玉米及高粱等作物不同[19-22]。糜子蠟質(zhì)組成相對簡單，初級醇和烷烴是其主要的蠟質(zhì)成分，約占總蠟質(zhì)含量的95%以上(表1)，說明糜子蠟質(zhì)的生物合成主要集中在初級醇和烷烴的合成，具體的合成機制值得進一步討論和探究。

觀察掃描電子顯微鏡的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)不同糜子品種旗葉葉片的上、下表面蠟質(zhì)晶體的疏密及結(jié)構(gòu)均有顯著差異，上表面呈比較密集的片狀，下表面呈稀疏的顆粒狀或平滑表面。不同糜子品種之間蠟質(zhì)晶體疏密程度有明顯的差別，榆黍1號和晉黍9號葉片表皮蠟質(zhì)分布最為緊密，寧糜10號則相對稀疏。同時，Barthlott等[23]研究證明，蠟質(zhì)組成中含有大量的伯醇和萜類化合物會呈現(xiàn)片狀的晶體結(jié)構(gòu)，而含有大量的二酮、仲醇和二醇等化合物則會呈現(xiàn)柱狀晶體。本研究發(fā)現(xiàn)，糜子葉片表面的蠟質(zhì)呈片狀結(jié)構(gòu)，這與葉片蠟質(zhì)成分中初級醇的含量最高相對應(yīng)。

環(huán)境的變化很大程度影響著植物表皮蠟質(zhì)的合成及蠟質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)。植物表皮蠟質(zhì)含量在受環(huán)境脅迫如干旱等條件下會顯著增多，且蠟質(zhì)晶體分布更為密集[24]。本研究中，糜子不同品種及不同發(fā)育時期葉片表皮均覆蓋有豐富的蠟質(zhì)并且在葉片表面形成片狀晶體結(jié)構(gòu)，說明這些蠟質(zhì)對于糜子應(yīng)對干旱等逆境脅迫起著重要的作用。

不同生長發(fā)育時期糜子葉片表皮蠟質(zhì)含量也存在差異，糜子從三葉期(15 d)到灌漿期(40 d)葉片表皮蠟質(zhì)含量逐漸增加(表2)。其他作物中也有相似的研究結(jié)果，如汪勇等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在小麥葉片發(fā)育早期，初級醇的含量最高，發(fā)育中后期，烷烴和二酮含量快速增加，總蠟質(zhì)含量從苗期到開花灌漿期呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢。王聰?shù)萚25]研究發(fā)現(xiàn)，大麥葉片蠟質(zhì)也隨生長發(fā)育進程而呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。前人的研究表明，糜子葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、水分的蒸騰速率等會因為其在苗期、拔節(jié)期和孕穗期受到干旱脅迫而較大程度地降低，但在灌漿期，蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度等的降低幅度明顯減小，并且凈光合速率基本不變[26-27]。本研究中檢測到的葉片表皮蠟質(zhì)逐漸增加的現(xiàn)象與這些光合生理檢測結(jié)果有很好的對應(yīng)性，可能就是糜子在生長發(fā)育過程中對干旱脅迫做出的適應(yīng)性反應(yīng)以及產(chǎn)生的生理效應(yīng)，這些生理指標(biāo)與蠟質(zhì)合成的關(guān)系值得進行更深入的研究，這對于提高糜子的抗旱性進而提高糜子的產(chǎn)量具有重要的研究價值。

本研究表明，不同糜子品種葉片表皮蠟質(zhì)含量有顯著差異，但不同糜子品種蠟質(zhì)組成成分相同，均以碳鏈長度分布范圍為C22-C35的烷烴、初級醇、萜類物質(zhì)等20種化合物為主。初級醇是糜子葉片表皮蠟質(zhì)的主要組成成分，其中C32醇含量最高。同時，糜子不同生長發(fā)育時期蠟質(zhì)組分含量也有顯著差異，即蠟質(zhì)總量隨生長發(fā)育時間不斷增加，但蠟質(zhì)組成相同，以初級醇為主。掃描電鏡觀察表明，葉片表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)為片狀和少量球狀，并且蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的密集程度與葉片表皮蠟質(zhì)含量多少相對應(yīng)。本研究首次對糜子葉片蠟質(zhì)的發(fā)育進行了研究，分析了糜子不同生長發(fā)育時期的蠟質(zhì)成分變化，為今后研究糜子蠟質(zhì)組分的合成機理奠定了基礎(chǔ)。