李倩儀， 張欣宗△， 朱偉杰

抗凍蛋白對哺乳動物配子和胚胎的效應*

李倩儀1，2，3， 張欣宗1，2，3△， 朱偉杰4△

（1國家衛(wèi)生健康委員會男性生殖與遺傳重點實驗室，廣東 廣州 510600；2廣東省生殖科學研究所男科，廣東 廣州 510600；3廣東省生殖醫(yī)院人類精子庫，廣東 廣州 510600；4暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632）

抗凍蛋白；胚胎；卵母細胞；精子

細胞在冷凍-解凍過程不可避免遭受損傷，包括冷凍保護劑（cryoprotective agent，CPA）毒性、胞內外冰晶形成和重結晶產生的機械損傷、滲透壓休克等負效應，導致細胞結構和功能損傷，甚至活力喪失［1-2］。故此，減少細胞冷凍損傷的相關研究一直備受重視，其中CPA是減少細胞損傷的重要因素，改良CPA配方是一項重要內容。

抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）是一類有利于生物在低溫條件下維持存活的特異性蛋白質，魚類、植物、昆蟲、細菌、真菌等多種生物體內均存在天然AFPs。由于AFPs有熱滯現象（thermal hysteresis）、修飾冰晶形態(tài)、抑制冰重結晶（ice recrystallization inhibition）及保護細胞膜等抗凍特性，近年來天然提取和生物工程制備的AFPs已被廣泛應用于器官移植、低溫醫(yī)學和生殖醫(yī)學等領域［3］，其中哺乳動物配子和胚胎的冷凍保存過程中添加AFPs顯著減輕了細胞的冷凍損傷。本文綜述AFPs的類型、分子特征、抗凍機制及其對哺乳動物配子和胚胎的效應，為AFPs應用于配子和胚胎的冷凍保存提供參考資料。

1 AFPs的類型與分子特征

AFPs來源廣泛，可從生物體中提取天然的AFPs，也可通過基因工程或固相合成得到AFPs。根據氨基酸序列和結構，一般將AFPs分為5類：抗凍糖蛋白（antifreeze glycoprotein，AFGP）、I型AFP（AFP type I，AFPI）、II型AFP（AFP type II，AFPII）、III型AFP（AFP type III，AFPIII）及IV型AFP（AFP type IV，AFPIV），見表1。

表1　抗凍蛋白的分類與特征

MW： molecular weight； AFGP： antifreeze glycoprotein； AFPI： antifreeze protein type I； AFPII： antifreeze protein type II； AFPIII： antifreeze protein type III； AFPIV： antifreeze protein type IV.

1.1AFGPAFGP來源于南極魚（Antarctic notothenioids）和北極鱈魚（Northern cod），主要由三肽單位（-Ala-Ala-Thr-）以不同重復程度串聯而成，含有8種異構體，分子量為2.6～33.7 kD，分子量越大，抗凍活性越高，產生抗凍活性的主要基團是糖基。在冷凍-解凍過程中細胞膜的脂質相變期，AFGP可保護細胞膜的脂質成分，維持細胞的完整性［4］。

1.2AFPIAFPI主要來源于美洲擬鰈（winter flounder），是富含丙氨酸（超過60%）的雙嗜性α-螺旋（>99%）蛋白，包含11個以蘇氨酸開始的氨基酸殘基重復序列組成的多肽單元，分子量為3.3～4.5 kD。AFPI具有明顯的疏水面，與冰晶表面結合并產生抗凍功能是依賴于蘇氨酸羥基的作用［5- 6］。

1.3AFPIIAFPII來源于美絨杜父魚（），是與C型凝集素同源的AFP，富含半胱氨酸，由具有5個二硫鍵的α螺旋和β鏈組成球狀蛋白，分子量為1.1～2.4 kD。AFPII表面通過水合作用使其容易與冰晶結合，從而抑制冰晶生長［7］。

1.4AFPIIIAFPIII來源于南極鰻鱺（Antarctic eel pout）的致密球狀蛋白，分子量為6.5～7.1 kD，其二級結構主要由9個β折疊組成，具有多個親水和疏水結構域［8］。

1.5AFPIVAFPIV來源于多棘床杜父魚（），含有108個氨基酸，富含谷氨酸和谷氨酰胺（17%），分子量為12.3 kD，有較高的α螺旋結構，其中4個α螺旋反向平行排列，親水基團在外圍，疏水基團包裹在內［9］。

2 AFPs的抗凍機制

AFPs有顯著的多樣性，盡管不同類型的AFPs一級、二級結構不同，經過盤繞、折疊形成的三級或四級結構卻有類似的功能區(qū)域和冰結合位點，可與冰的表面相互作用，產生抗凍效果。目前認為AFPs主要具有以下抗凍機制：

2.1熱滯現象溶液體系在溫度降低至冰晶開始生長的溫度為冰點，溫度升高至冰晶開始熔化的溫度為熔點，不含AFPs的溶液一般冰點等于熔點，含有AFPs的溶液，冰點顯著降低，而熔點基本不變，冰點與熔點之間的差異為熱滯現象。AFPs能夠降低冰晶冰點，是由于AFPs不可逆地吸附在冰晶表面，通過Kelvin效應使冰在吸附的相鄰AFPs之間表面張力增加并改變冰晶表面曲率，從而降低冰晶生長速度，直到溫度降低到非平衡冰點，見圖1。在一定溫度范圍內，熱滯現象使形成的冰晶非常小，甚至不形成冰晶［10-11］。小冰晶或不形成冰晶在一定程度減少了細胞的冷凍損傷。

Figure 1.Schematic diagram of thermal hysteresis activity of AFPs. A： without AFPs，the freezing point is the same as the melting point，and ice crystals （light blue hexagon） grow beyond this equilibrium temperature； B： AFPs （red balls） lower the freezing point and keep the melting point by surface adsorption to ice till nonequilibrium freezing point.

2.2修飾冰晶形態(tài)細胞冷凍-解凍過程中產生的冰晶會對細胞膜和細胞器造成機械損傷，冰晶體積越大，造成的細胞損傷越嚴重。AFPs能與冰晶表面結合，降低冰的生長速度，改變冰的生長習性，影響晶體結構。該作用因冰晶的生長方向而異：在不含AFPs的溶液中，晶體通常沿軸生長；在含有AFPs的溶液中，晶體通常沿軸生長，或沿其他與軸不同的方向生長，使晶格結構發(fā)生改變，冰晶總體積變小，不易引起細胞損傷［5，12］，見圖2。

Figure 2.Schematic diagram of modification of ice crystal morphology of AFPs. A： without AFPs，ice crystals usually grow fastest in the direction perpendicular to the c-axis （along the a-axis）； B： AFPs （red balls） preferentially adsorb on the crystal surface parallel to the c-axis，cause the change of ice crystal surface curvature，inhibit the growth of ice crystal in the a-axis direction，and modify the ice crystal morphology.

2.3抑制冰重結晶溶液在稍低于冰點的過冷狀態(tài)或解凍升溫的過程中，容易出現冰晶體積變大，數量減少的重結晶現象。在這個過程中，小冰粒和小冰晶聚合成為大冰晶，這些大冰晶會破壞細胞間隙連接和細胞結構，從而對細胞造成冷凍損傷。添加的AFPs分布在小冰粒間隙處，通過與冰粒表面結合使其能量分布發(fā)生改變，抑制其聚合和生長，見圖3。極低濃度的AFPs也可有效抑制重結晶，但該濃度遠無法引起溶液體系的冰點下降［13-15］。

Figure 3.Schematic diagram of ice recrystallization inhibition of AFPs. A： larger ice particles are formed by the fusion and growth of smaller ice particles with a high internal energy； B： AFPs （red balls） inhibit grain boundary migration processes by stopping ice from growing and melting at the boundaries.

2.4保護細胞膜細胞膜是分隔細胞與胞外環(huán)境的結構。動物細胞膜外側與外界環(huán)境直接接觸，發(fā)揮著屏障、選擇性物質運輸等生理作用。細胞膜是冷凍過程中最易受損的結構，一旦細胞膜發(fā)生冷凍損傷，胞內的細胞器則受到破壞，同時導致胞質或離子滲漏，無法維持胞內正常生理活動，造成細胞活力喪失。AFPs可與膜脂質和膜蛋白（如鉀和鈣離子通道等）相互作用，穩(wěn)定細胞膜，減少冷凍損傷，從而保護細胞結構和功能［16-17］，見圖4。然而，當膜帶有負電荷的極性基團時，添加AFPs易使細胞在冷凍過程中發(fā)生胞質或離子滲漏。因此，AFPs對冷凍損傷的保護取決于膜的成分及AFPs在溶液體系內的濃度［18］。

Figure 4.Schematic diagram of interaction with biofilm of AFPs. A： in the procedures of freeze-thawing，the formation，growth and recrystallization of intracellular and extracellular ice crystals usually lead to cells sustaining mechanical ice damage； B： AFPs （red balls） bind to ice crystals to inhibit ice growth and recrystallization，and interact with cellular membranes to maintain the membrane construction，which are crucial to protecting membranes against freezing injuries.

3 AFPs對配子的效應

3.1AFPs對精子的保護作用精子冷凍是雄（男）性生育力保存的主要方式。在冷凍保存過程中，細胞外水凍結成冰會使胞外滲透壓升高，引起細胞脫水，進一步使細胞內環(huán)境發(fā)生改變，導致蛋白質變性，酶系統(tǒng)失活，細胞受損，這種冷凍損傷稱為“溶質效應”（solution effect）。精子在冷凍-解凍的過程中受到溶質效應、冰晶形成和滲透壓改變等不良作用，會造成精子不同程度的結構改變和功能損傷，體現在精子質膜破裂，頂體膜腫脹、破損、通透性增加，精子內容物丟失和線粒體功能障礙等。不同物種的精子由于大小、形態(tài)、膜和頂體組成等存在差異，對冷凍損傷的耐受性不同，因此，精子的冷凍保存方案也各有不同［19］。CPA包括滲透性保護劑，如甘油和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）等，容易透過細胞膜進入細胞內，減輕溶質效應；非滲透性保護劑如卵黃和蔗糖等，可降低細胞外液的冰點并使細胞內的水快速滲出，從而減少精子內冰晶的形成。常用的CPA有不同程度的細胞毒性和局限性［20］，需要尋找安全可靠的成分進行替代以減少這些負性影響，應用AFPs是一種有效的哺乳動物精子冷凍保存改良方案。

往CPA中加入不同濃度（0.1～100 mg/L），不同類型AFPs對哺乳動物的精子有不同的抗凍效果。AFPIII對冷凍解凍后的兔精子活力產生積極影響，特別是濃度為1 mg/L可獲得較高的精子復蘇率［21］。山羊精子也有類似的結果［22］。AFPI和AFPIII會與牛精子質膜結合，AFPI可增加凍融過程中精子抗?jié)B透壓變化的能力，且當濃度為0.1、1和10 mg/L時，AFPI修飾晶格結構，使冰晶之間呈平行狀，減少了冰晶對精子膜的機械損害［23］。食蟹猴精子冷凍-解凍過程中添加0.1 mg/L AFPIII可保護精子線粒體中與活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生和谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成相關的蛋白質組成，減少細胞色素C釋放，抑制線粒體中ROS的產生，增強抗過氧化能力，從而減少精子凋亡［24］。AFPs可減少精子質膜的脂質成分和蛋白質譜的變化，穩(wěn)定質膜結構，防止冷凍過程中由精子膜功能紊亂引起的亞致死損傷［25］。

AFPs對細胞的冷凍保存是一把“雙刃劍”，它除了有積極的保護作用，也存在損傷細胞的負效應。小鼠精子添加濃度為1～100 mg/L的AFPI、AFPIII和AFGP并不能有效保護凍融精子，相反地，凍融精子的存活率與AFPs濃度會成正比例的下降，這是由于小鼠精子本身對凍融過程中的物理或機械損傷非常敏感，AFPs濃度過高，會導致冰晶生長為尖銳的六邊形雙錐體，對精子質膜產生嚴重的機械損傷［26］。在黑猩猩精子的冷凍試驗，添加相對低濃度AFPs后，冷凍精子活力、質膜和頂體完整性得到顯著改善，但在高濃度AFPs作用下緩慢冷凍（1 ℃/min）時，精子質膜、頂體等結構會受到廣泛的損傷［27］。從目前顯示的研究結果來看，AFPs誘導的細胞保護效能增強與細胞損傷加劇，兩者之間存在某種特定的關系，AFPs的效果取決于冰重結晶抑制和細胞周圍冰的優(yōu)先生長的程度。故此，AFPs濃度必須仔細優(yōu)化，避免對細胞存活產生負效應。

人類精子現有的冷凍保存方法雖然能獲得較好的復蘇率，但目前復蘇率尚未達理想狀態(tài)，多個環(huán)節(jié)仍需改善，其中包括CPA的配伍成分。目前AFPs與人類精子冷凍存活的相互關系研究尚少，向甘油-卵黃-檸檬酸鈉型冷凍保護劑添加0.01 mg/L、0.1 mg/L和1 mg/L AFPIII可改善人類精子的存活率、質膜完整性、活力和總抗氧化能力，并降低冷凍保存人類精液的ROS和DNA碎片指數（DNA fragmentation index，DFI），但更高濃度效果不明顯［28］。精子凍干保存技術將會是新一代的保存方法，其凍干保護劑的成分仍處于試驗探索階段［29-30］，可結合AFPs的抗凍能力對其進行改良。應充分評估AFPs對人類精子抗冷凍損傷的效果及使用方式，優(yōu)化人類精子冷凍保存方案。

3.2AFPs對卵子的保護作用卵子的細胞體積大，含大量胞質和水分，表面積與體積比率低，不利于細胞表面與內部均勻降溫或升溫。卵子在冷凍-解凍過程中會受到溶質效應、細胞內結冰、脫水、CPA毒性、滲透壓變化等影響，卵透明帶、卵膜、減數分裂紡錘體、微絲等卵子特有的細胞結構和細胞器對這些影響極其敏感，易產生不可逆的冷凍損傷，使卵子喪失正常生理功能，難以獲得較好的凍后效果［31］。為了避免冷凍損傷，卵子冷凍保存必須用大量的小分子作為CPA成分，例如DMSO和乙二醇，滲透到細胞中防止內部結冰。然而，這些成分對卵子具有化學和表觀遺傳毒性，需要改善冷凍方案以減少這些成分的毒性影響。已知在CPA中添加蛋白質補充劑可減少卵子凍融過程所產生的如皮質顆粒丟失、卵透明帶硬化和空泡形成等冷凍損傷［32］，AFPs作為具有抗凍功能的蛋白質，可使卵子外環(huán)境的冰晶生長減慢，防止大冰晶生成直接損傷卵透明帶及卵膜。優(yōu)化CPA是改善卵子冷凍保存方案的重要環(huán)節(jié)，可考慮在冷凍過程中添加適量AFPs。

AFPs從以下幾個方面對哺乳動物卵子產生冷凍保護效應：卵膜的結構、紡錘體的功能和染色體的正常排列、線粒體的分布、微絲損傷的減少等。在小鼠、豬、牛等哺乳動物的試驗中，添加AFPs使卵子存活率、單精受精率和優(yōu)質胚胎率顯著增高。AFPs通過吸附結合保護了卵膜結構的完整性，抑制低溫狀態(tài)下穿過卵膜的離子泄漏，增加了卵膜的穩(wěn)定性。此外，添加了AFPs的卵子解凍后DNA雙鏈斷裂較少，組織蛋白酶B和半胱天冬酶活性較低，紡錘體功能和染色體排列較正常、線粒體分布的比率更高、微絲完整性更好，卵子內活性氧水平則顯著降低［25，33-36］。

AFPs還可調控與卵子功能和發(fā)育相關的基因表達從而產生抗凍效果：在小鼠GV期卵子玻璃化冷凍過程中應用AFPIII，囊胚形成率增高，凋亡的卵裂球數量降低，具有完整紡錘體、染色體和穩(wěn)定的膜結構的卵子比例也增高，和表達增加，和表達降低。由此可見，AFPs可以在GV階段保持卵子紡錘體形成能力和膜完整性，并通過調節(jié)和的表達來改善卵子的受精和發(fā)育能力［37-38］。

AFPs除了直接作用于卵子，在玻璃化冷凍和復溫過程中對小鼠卵巢組織也有冷凍保護作用，尤其是高濃度（10 g/L）的LeIBP［39-40］。很多因癌癥治療而失去生育能力的癌癥患者可選擇冷凍卵巢組織來保留生育能力，但目前鮮有AFPs對人類卵子或卵巢組織冷凍影響的報道。AFPs是否能優(yōu)化人類卵子或卵巢組織冷凍保存方案，需要進一步的研究。

4 AFPs對胚胎的效應

胚胎是正在發(fā)育的多細胞體，體積大，水分占80％以上，以島團狀方式生長，細胞之間存在間隙連接，緊密的細胞連接和細胞旁分泌因子對維持其體外未分化生長至關重要。冷凍過程造成的損傷，會影響胚胎結構：胚胎透明帶表面微孔數量減少，線粒體膨脹，胞質進一步收縮，破壞微絨毛，產生細胞碎片，胚胎膜的脂蛋白復合物和胞質內的功能蛋白變性，破壞細胞骨架，造成胚胎不可逆轉的損傷；還會破壞細胞間隙連接，影響細胞與CPA的接觸，不利于胚胎生長。CPA可對胚胎起冷凍保護作用，但其毒性又會使微絲和微管解聚，破壞胚胎的細胞結構和功能。因此，CPA的成分對于冷凍保存方案的設計非常重要。

AFPs具有與細胞膜相互作用和抑制冰晶生長的能力，可以減輕胚胎在冷凍保存遭受的損傷［41］。在牛胚胎、羊胚胎、兔胚胎、小鼠胚胎和馬胚胎的冷凍過程中添加AFPs作為抗凍成分，其抗凍效果不盡相同［42］。含AFPIII（10 g/L）的培養(yǎng)液可使低溫（4 °C）儲存的牛胚胎活力維持時間從24～48 h延長至10 d，AFPs溶液37 ℃預熱60 min的胚胎保持高活力，能維持胚胎活力至10 d，而沒有預熱的胚胎存活不超過7 d，由此可見AFPs的抗冷凍作用還受試驗溫度的影響［43］。玻璃化冷凍主要選用高濃度保護劑作為玻璃化液增加細胞內溶質的濃度，使快速冷凍過程不發(fā)生結晶，玻璃化冷凍損傷主要來源于玻璃化液的毒性。玻璃化冷凍過程中添加AFGP8有助于保護牛囊胚免受的冷凍損傷［44］，可應用AFPs降低玻璃化液內保護劑濃度。

除了不同物種的胚胎之間AFPs的抗凍效果存在差異，即使是同種細胞的不同狀態(tài)添加AFPs也有不同效果。添加ApAFP914 （5～30 mg/L）處理羊胚胎不會增加囊胚的存活率，補充10 mg/L則可顯著提高冷凍保存后生長緩慢的羊胚胎孵化率［45］。AFPs并不是對每種胚胎冷凍都起積極作用，如補充AFPIII（1 mg/L）對低溫保存的豬桑葚期胚胎發(fā)育沒有明顯的抗凍效果［46］。另外，目前尚未見文獻報道AFPs對人胚胎冷凍保存的影響。AFPs對胚胎的抗凍效應是否能用于改良人胚胎冷凍保存方案仍有待研究。

5 結語與展望

AFPs有熱滯現象、冰晶形態(tài)修飾、冰重結晶抑制及對細胞膜的保護作用等抗凍特性，能有效保護細胞結構從而維持其正常生理功能，改善了配子和胚胎冷凍復蘇后的存活率和活力。但高濃度AFPs可能改變晶體形態(tài)導致細胞損傷，是否起抗凍作用取決于物種、細胞類型或胚胎發(fā)育階段、AFPs的類型、濃度以及冷凍保存方案等因素。目前使用的CPA仍存在多方面的不足，AFPs對哺乳動物配子和胚胎冷凍保存的適用性和條件有明顯差異，如何配伍以減輕CPA毒性，以及AFPs的遠期效應尚未闡明，應加強這些方面的研究，盡快利用AFPs改進CPA成分，使其更安全、高效和實用。

AFPs在生殖領域特別是配子和胚胎的冷凍保存有獨特優(yōu)勢，目前AFPs應用于人類配子和胚胎的冷凍保存報道尚少，需要進一步了解AFPs在冷凍過程中對不同細胞成分的作用、最佳使用條件、長期風險和安全性，例如配子和胚胎超微形態(tài)的改變；ROS的變化；不同AFPs類型之間的組合、抗凍劑及抗氧化劑的配伍；細胞毒性；對配子和胚胎表觀遺傳的影響以及子代的健康狀況等。AFPs應用和推廣還存在很多挑戰(zhàn)，為了獲得大量具有優(yōu)異抗凍性能的低成本CPA，開發(fā)與天然AFPs相同或相似的肽類抗凍材料是近年的研究熱點［47-48］。解決這些問題將有助于增加對AFPs的認識，改良CPA配方，優(yōu)化配子和胚胎的冷凍程序，從而達到更合適的冷凍復蘇效果。

［1］ Elliott GD，Wang S，Fuller BJ. Cryoprotectants： a review of the actions and applications of cryoprotective solutes that modulate cell recovery from ultra-low temperatures［J］. Cryobiology，2017，76：74-91.

［2］ Asghar W，El Assal R，Shafiee H，et al. Preserving human cells for regenerative，reproductive，and transfusion medicine［J］. Biotechnol J，2014，9（7）：895-903.

［3］ Eskandari A，Leow TC，Rahman MBA，et al. Antifreeze proteins and their practical utilization in industry，medicine，and agriculture［J］. Biomolecules，2020，10（12）：1649-1666.

［4］ Sun Y，Giubertoni G，Bakker HJ，et al. Disaccharide residues are required for native antifreeze glycoprotein activity［J］. Biomacromolecules，2021，22（6）：2595-2603.

［5］ Flores A，Quon JC，Perez AF，et al. Mechanisms of antifreeze proteins investigated via the site-directed spin labeling technique［J］. Eur Biophys J，2018，47（6）：611-630.

［6］ Hobbs RS，Shears MA，Graham LA. et al. Isolation and characterization of type I antifreeze proteins from cunner，，order Perciformes［J］. FEBS J，2011，278（19）：3699-3710.

［7］ Arai T，Nishimiya Y，Ohyama Y，et al. Calcium-Binding generates the semi-clathrate waters on a type II antifreeze protein to adsorb onto an ice crystal surface［J］. Biomolecules，2019，9（5）：162-175.

［8］ Choi SR，Lee J，Seo YJ，et al. Molecular basis of ice-binding and cryopreservation activities of type III antifreeze proteins［J］. Comput Struct Biotechnol J，2021，19：897-909.

［9］ Gauthier SY，Scotter AJ，Lin FH，et al. A re-evaluation of the role of type IV antifreeze protein［J］. Cryobiology，2008，57（3）：292-296.

［10］ Celik Y，Drori R，Pertaya-Braun N，et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（4）：1309-1314.

［11］ Meister K，Moll CJ，Chakraborty S，et al. Molecular structure of a hyperactive antifreeze protein adsorbed to ice［J］. J Chem Phys，2019，150（13）：131101.

［12］ Knight CA，Driggers E，DeVries AL. Adsorption to ice of fish antifreeze glycopeptides 7 and 8［J］. Biophys J，1993，64（1）：252-259.

［13］ Raymond JA，Fritsen CH. Semipurification and ice recrystallization inhibition activity of ice-active substances associated with Antarctic photosynthetic organisms［J］. Cryobiology，2001，43（1）：63-70.

［14］ Raymond JA，Knight CA. Ice binding，recrystallization inhibition，and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms［J］. Cryobiology，2003，46（2）：174-181.

［15］ Olijve LLC，Meister K，DeVries AL，et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2016，113（14）：3740-3745.

［16］ Negulescu PA，Rubinsky B，Fletcher GL，et al. Fish antifreeze proteins block Ca entry into rabbit parietal cells［J］. Am J Physiol，1992，263 （6 Pt 1）：C1310-C1313.

［17］ Rubinsky B，Mattioli M，Arav A，et al. Inhibition of Ca2+and K+currents by "antifreeze" proteins［J］. Am J Physiol，1992，262（3）：R542-R545.

［18］ Wu Y，Fletcher GL. Efficacy of antifreeze protein types in protecting liposome membrane integrity depends on phospholipid class［J］. Biochim Biophys Acta，2001，1524（1）：11-16.

［19］ Kumar A，Prasad JK，Srivastava N，et al. Strategies to minimize various stress-related freeze-thaw damages during conventional cryopreservation of mammalian spermatozoa［J］. Biopreserv Biobank，2019，17（6）：603-612.

［20］ 朱偉杰，梁蔚波，姚康壽. 圓頭精子的冷凍保存［J］. 中國病理生理雜志，2001，17（6）： 553-555.

Zhu WJ，Liang WB，Yao KS. Cryopreservation of round-headed human sperm［J］. Chin J Pathophysiol，2001，17（6）：553-555.

［21］ Nishijima K，Tanaka M，Sakai Y，et al. Effects of type III antifreeze protein on sperm and embryo cryopreservation in rabbit［J］. Cryobiology，2014，69（1）：22-25.

［22］ Lv C，Larbi A，Memon S，et al. The effects of antifreeze protein III supplementation on the cryosurvival of goat spermatozoa during cryopreservation［J］. Biopreserv Biobank，2021，19（4）：298-305.

［23］ Prathalingam NS，Holt WV，Revell SG，et al. Impact of antifreeze proteins and antifreeze glycoproteins on bovine sperm during freeze-thaw［J］. Theriogenology，2006，66（8）：1894-1900.

［24］ Chen B，Wang S，Inglis BM，et al. Improving sperm cryopreservation with type III antifreeze protein： proteomic profiling of cynomolgus macaque （） sperm［J］. Front Physiol，2021，12：719346.

［25］ Robles V，Valcarce DG，Riesco MF. The use of antifreeze proteins in the cryopreservation of gametes and embryos［J］. Biomolecules，2019，9（5）：181-192.

［26］ Koshimoto C，Mazur P. Effects of warming rate，temperature，and antifreeze proteins on the survival of mouse spermatozoa frozen at an optimal rate［J］. Cryobiology，2002，45（1）：49-59.

［27］ Younis AI，Rooks B，Khan S，et al. The effects of antifreeze peptide III （AFP） and insulin transferrin selenium （ITS） on cryopreservation of chimpanzee （） spermatozoa［J］. J Androl，1998，19（2）：207-214.

［28］ Zandiyeh S，Shahverdi A，Ebrahimi B，et al. A novel approach for human sperm cryopreservation with AFPIII［J］. Reprod Biol，2020，20（2）：169-174.

［29］ Wang YY，Zhu WJ. Effects of rosmarinic acid on DNA integrity anddifferentially methylated region methylation levels in human sperm preserved by freeze-drying［J］. Reprod Dev Med，2021，5（1）：9-14.

［30］ 朱偉杰. 加強人類精子凍干保存的研究［J］. 中華生殖與避孕雜志，2018，38（7）：527-530.

Zhu WJ. Strengthening investigations on freeze-drying preservation of human sperm［J］. Chin J Reprod Contracept，2018，38（7）：527-530.

［31］ 朱偉杰，李菁. 冷凍保存對人類卵子結構與功能的影響［J］. 生殖與避孕，2005，25（7）：418-420.

Zhu WJ，Li J. Effects of cryopreservation on the structure and function of human oocyte［J］. Reprod Contracept，2005，25（7）：418-420.

［32］ De Santis L，Nottola SA，Coticchio G，et al. Type of protein supplement in cryopreservation solutions impacts on the degree of ultrastructural damage in frozen-thawed human oocytes［J］. Cryobiology，2020，95：143-150.

［33］ Liang S，Yuan B，Kwon JW，et al. Effect of antifreeze glycoprotein 8 supplementation during vitrification on the developmental competence of bovine oocytes［J］. Theriogenology，2016，86（2）：485-494.

［34］ Chaves DF，Campelo IS，Silva MMAS，et al. The use of antifreeze protein type III for vitrification of in vitro matured bovine oocytes［J］. Cryobiology，2016，73（3）：324-328.

［35］ Wen Y，Zhao S，Chao L，et al. The protective role of antifreeze protein 3 on the structure and function of mature mouse oocytes in vitrification［J］. Cryobiology，2014，69（3）：394-401.

［36］ Lee HH，Lee HJ，Kim HJ，et al. Effects of antifreeze proteins on the vitrification of mouse oocytes： comparison of three different antifreeze proteins［J］. Hum Reprod，2015，30（9）：2110-2119.

［37］ Jo JW，Jee BC，Suh CS，et al. The beneficial effects of antifreeze proteins in the vitrification of immature mouse oocytes［J］. PLoS One，2012，7（5）：e37043.

［38］ Jo JW，Jee BC，Lee JR，et al. Effect of antifreeze protein supplementation in vitrification medium on mouse oocyte developmental competence［J］. Fertil Steril，2011，96（5）：1239-1245.

［39］ Lee JR，Youm HW，Lee HJ，et al. Effect of antifreeze protein on mouse ovarian tissue cryopreservation and transplantation［J］. Yonsei Med J，2015，56（3）：778-784.

［40］ Lee J，Kim SK，Youm HW，et al. Effects of three different types of antifreeze proteins on mouse ovarian tissue cryopreservation and transplantation［J］. PLoS One，2015，10（5）：e0126252.

［41］ Makarevich AV，Kubovicová E，Popelková M，et al. Several aspects of animal embryo cryopreservation： anti-freeze protein （AFP） as a potential cryoprotectant［J］. Zygote，2010，18（2）：145-153.

［42］ Kim HJ，Lee JH，Hur YB，et al. Marine antifreeze proteins： structure，function，and application to cryopreservation as a potential cryoprotectant［J］. Mar Drugs，2017，15（2）：27-53.

［43］ Ideta A，Aoyagi Y，Tsuchiya K，et al. Prolonging hypothermic storage （4 ℃） of bovine embryos with fish antifreeze protein［J］. J Reprod Dev，2015，61（1）：1-6.

［44］ Liang S，Yuan B，Jin YX，et al. Effects of antifreeze glycoprotein 8 （AFGP8） supplementation during vitrification on the in vitro developmental capacity of expanded bovine blastocysts［J］. Reprod Fertil Dev，2017，29（11）：2140-2148.

［45］ Li X，Wang L，Yin C，et al. Antifreeze protein from（ApAFP914） improved outcome of vitrifiedsheep embryos［J］. Cryobiology，2020，93：109-114.

［46］ Nguyen TV，Tanihara F，Hirata M，et al. Effects of antifreeze protein supplementation on the development of porcine morulae stored at hypothermic temperatures［J］. Cryo Lett，2018，39（2）：131-136.

［47］ Surís-Valls R，Voets IK. Peptidic antifreeze materials： prospects and challenges［J］. Int J Mol Sci，2019，20（20）：5149-5171.

［48］ Correia LFL，Alves BRC，Batista RITP，et al. Antifreeze proteins for low-temperature preservation in reproductive medicine： a systematic review over the last three decades［J］. Theriogenology，2021，176：94-103.

Effects of antifreeze proteins on mammalian gametes and embryos

LI Qian-yi1，2，3，ZHANG Xin-zong1，2，3△，ZHU Wei-jie4△

（1，510600，；2，，510600，；3，510600，；4，，510632，）

Antifreeze proteins （AFPs） are a family of proteins containing antifreeze glycoprotein （AFGP） and type I to IV AFPs. During cryopreservation，AFPs protect the cell from cryo-injuring through multiple mechanisms including thermal hysteresis，modification of ice crystal morphology，ice recrystallization inhibition，and interaction with biofilm. The survival of gametes and embryos after freeze-thawing can be improved by AFPs. This article reviews the cryoprotective role of AFPs in the cryopreservation of mammalian gametes and embryos.

Antifreeze proteins； Embryo； Oocytes； Sperm

R318.16； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.020

1000-4718（2022）02-0350-08

2021-11-28

2022-01-25

［基金項目］廣東省自然科學基金資助項目（No. 2021A1515011544）；廣東省計劃生育科學技術研究所創(chuàng)新團隊培育計劃項目（No. C01）

張欣宗 Tel： 18588747273； E-mail： 13857170787@139.com； 朱偉杰 Tel： 020-85225718； E-mail： tzhuwj@jnu.edu.cn

（責任編輯：宋延君，羅森）