張賽， 宋正陽， 王淑遠， 田云娜， 王肖婷， 林青青， 王萬鐵

三七總皂苷通過Notch3/Hes-1/p27Kip1信號通路抑制低氧性肺動脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)*

張賽， 宋正陽， 王淑遠， 田云娜， 王肖婷， 林青青， 王萬鐵△

（溫州醫(yī)科大學生理學與病理生理學系，浙江 溫州 325035）

探討Notch3/Hes-1/p27Kip1信號通路與低氧性肺動脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)的關系及三七總皂苷（PNS）的干預作用。將SPF級雄性SD大鼠采用隨機編號分為3組：正常組（C組），低氧組（H組）和PNS組（P組），檢測肺動脈壓，稱量右心室重量，HE染色和Masson染色觀察肺血管重構(gòu)情況，RT-qPCR檢測大鼠肺組織中Notch3、Hes-1和p27Kip1的mRNA表達水平，Western blot檢測大鼠肺組織中Notch3、Hes-1、p27Kip1，增殖細胞核抗原（PCNA）和caspase-3的蛋白水平。與C組相比，H組大鼠的肺動脈壓和右心室肥厚指數(shù)明顯增加；肺血管重構(gòu)現(xiàn)象明顯；Notch3、Hes-1和PCNA的蛋白水平增加，p27Kip1和caspase-3的蛋白水平降低；Notch3和Hes-1的mRNA表達增加，p27Kip1的mRNA表達降低（<0.05）。經(jīng)PNS干預后，與H組相比，P組大鼠的肺動脈壓和右心室肥厚指數(shù)降低；肺血管重構(gòu)現(xiàn)象改善；Notch3、Hes-1和PCNA的蛋白水平降低，p27Kip1和caspase-3的蛋白水平增加；Notch3和Hes-1的mRNA表達降低，p27Kip1的mRNA表達增加（<0.05）。PNS可通過抑制Notch3/Hes-1/p27Kip1信號通路，減少低氧誘導的肺動脈高壓大鼠肺血管重構(gòu)。

肺動脈高壓；低氧；三七總皂苷；Notch3/Hes-1/p27Kip1信號通路；血管重構(gòu)

低氧性肺動脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是一種預后差、病死率高的疾?。?-2］。HPH的主要特征為低氧引起血管損傷后，肺血管各層膜發(fā)生病理生理變化，釋放多種血管舒縮因子，導致血管異常收縮和不可逆重塑，進而引起肺血管阻力及肺動脈壓力漸進性升高，最終導致右心衰竭而死亡［3-4］。HPH并不是一個單一的疾病，而是一組多因素參與的復雜綜合征，這就決定了其臨床治療困難且療效差，更加突出研究其機制的重要性。

三七是五加科人參屬植物三七［（Burk.） F. H. Chen］的干燥根及根莖，具有化瘀止血和消腫止痛等功效，在傳統(tǒng)中藥中作為一種活血化瘀類藥品而被廣泛應用［5］，其中三七總皂苷（saponins，PNS）可減輕肺動脈高壓［6］，改善微循環(huán)，降低血壓［7］，降低機體的耗氧量、提高機體對缺氧的耐受力［8］。然而PNS干預低氧性肺動脈高壓的具體發(fā)病機制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)［9］，Notch信號通路參與調(diào)控血管平滑肌細胞的分化和凋亡，參與肺動脈血管重構(gòu)的過程，對維持血管穩(wěn)態(tài)具有重要作用。那么，PNS對低氧性肺動脈高壓的干預作用是否通過Notch3信號通路來發(fā)揮作用呢？目前尚不清楚，本研究通過構(gòu)建在體大鼠低氧性肺動脈高壓模型，探討PNS的干預作用及其與Notch3通路的關系。

材料和方法

1　試劑與設備

PNS（血塞通注射液）購自昆藥集團；抗Notch3抗體、抗Hes-1抗體、抗p27Kip1抗體、抗增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體和抗caspase-3抗體均購自Cell Signaling Technology。PowerLab（BL-420F）和生理壓力傳感器（BL-Newcentmry）購自成都泰盟科技有限公司。

2　實驗動物分組與處理

3　實驗方法

3.1肺動脈動力學測量給藥28 d后，采用肺動脈導管術檢測大鼠肺動脈壓。大鼠稱重，剃毛，剪開右側(cè)頸部皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉，游離頸外靜脈，使靜脈清晰暴露。血管剪一小口，將連接壓力傳感器的PE導管慢慢推入右側(cè)頸外靜脈，經(jīng)右心室插入肺動脈，記錄肺動脈壓力波形變化。

3.2右心室肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RVHI）測量測壓完成后開胸取出心臟和肺。分離心臟，迅速置于生理鹽水中清洗，剪去多余組織，分離右心室和左心室加室間隔，沿房室溝剪去心房及大血管根部，沿室間隔分離右心室、左心室加室間隔，濾紙吸干水分后分別稱重，計算RVHI［右心室重量/（左心室加室間隔重量）］，以判斷右心室肥厚程度。

3.3肺血管結(jié)構(gòu)和形態(tài)的組織病理學觀察取大鼠肺組織置于4%甲醛溶液中，固定48 h。常規(guī)脫水、石蠟包埋、制備組織切片，厚度約為4 μm，進行HE染色和Masson染色，中性樹脂封片。WA%=管壁面積/血管總面積×100%，WT%=肺小動脈管壁厚度/動脈外徑×100%。自然晾干后，于光鏡下觀察肺血管病理學變化并拍照。

3.4RT-qPCR檢測肺組織Notch3、Hes-1和p27Kip1的mRNA水平將50 mg肺組織加入1 mL Trizol中，研磨機研磨，加入200 μL氯仿后，劇烈顛倒混勻，漩渦儀15 s，靜置，4 ℃、12 000 r/min離心，取上層水相于另一EP管，加入異丙醇，顛倒混勻，靜置，4 ℃、12 000 r/min離心，棄上清，加入75%乙醇，4 ℃、12 000 r/min離心，重復2次后，棄上清，空氣干燥，溶于DEPC水，測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于PCR擴增的引物序列如下：Notch3的上游引物序列為5'-GCTGGCGTCTCTTCAACAACA-3'，下游引物序列為5'-TGGTCGGCGCAGTACTTCTTAT-3'；Hes-1的上游引物序列為5'-AAGATAGCTCCCGGCATT-3'，下游引物序列為5'-GCGGTACTTCCCCAACA-3'；p27Kip1的上游引物序列為5'-TTTCGGTGAGAACTGATCC-3'，下游引物序列為5'-TCGGAACTCCC-AAATGAG-3'；β-actin的上游引物序列為5'-GAGAGGGAAATCGTGCGT-3'，下游引物序列為5'-GGAGGAAGAGGATGCGG-3'。

3.5Western blot檢測肺組織Notch3、Hes-1、p27Kip1、PCNA和caspase-3蛋白水平100 mg肺組織經(jīng)研磨機研磨后，加入1 mL細胞裂解混合液（PMSF∶RIPA=1∶100），冰上靜置1 h，超聲裂解，離心后收集上清于新的1.5 mL EP管。用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測所收集的上清液的蛋白總濃度，酶標儀測量吸光度。將測量好的蛋白樣品與Loading Buffer混合后，于100 ℃煮沸10 min于冰上備用。以每孔80 μg的蛋白上樣量進行電泳，并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后將其置于10%脫脂牛奶或5% BSA中室溫下?lián)u床封閉2 h。加Ⅰ抗（抗Notch3、Hes-1、p27Kip1、PCNA和caspase-3抗體，稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。第2天取出PVDF膜，TBST漂洗5 min×4次后，加Ⅱ抗（用TBST稀釋辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ⅱ抗，比例為1∶10 000），于室溫下孵育1 h后，TBST漂洗5 min×3次。配制化學發(fā)光液，將漂洗后的PVDF膜置于曝光儀中，滴加發(fā)光液，曝光處理并保存結(jié)果。

4　統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件對各組實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。所有實驗數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組樣本的均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。若方差齊，則采用SNK-檢驗進行兩兩組間比較；若方差不齊，則采用Dunnett's T3檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1　平均肺動脈壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）及RVHI的變化

與C組相比較，低氧造模28 d后，H組mPAP增高明顯，提示造模成功；給予PNS干預后，與H組相比mPAP顯著降低（<0.05），C組與H組RVHI分別為（0.28±0.03）和（0.42± 0.02），存在統(tǒng)計學差異（<0.05），給予PNS干預后，其RVHI為（0.34±0.03），與H組比較顯著降低（<0.05），見表1。

表1　三七總皂苷對低氧大鼠mPAP和RVHI的影響

*<0.05C group；#<0.05H group.

2　大鼠肺組織病理學的變化

通過HE染色分析，與C組相比，H組大鼠肺血管壁明顯增厚，WT%和WA%顯著升高（<0.05）；給予PNS干預后，與H組相比，血管壁增厚程度被改善，WT%和WA%均明顯降低（<0.05），說明PNS可減輕低氧誘導的大鼠肺動脈壁增厚，抑制肺血管重構(gòu)，見圖1、表2。通過Masson染色分析，與C組相比，H組大鼠肺血管周圍纖維化明顯加重；給予PNS干預后，與H組相比，纖維化程度被明顯改善，見圖2。

Figure 1.Histopathological changes of small pulmonary vessels in rats （HE staining，scale bar=50 μm）.

表2　各組WT%和WA%的比較

*<0.05C group；#<0.05H group.

Figure 2.Masson staining of small pulmonary vessels in rats （×400）. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs C group； ##P<0.01 vs H group.

3　PNS對大鼠肺組織Notch3、Hes-1和p27Kip1蛋白水平的影響

與C組相比，H組大鼠肺組織Notch3和Hes-1的蛋白水平顯著升高，p27Kip1的蛋白水平顯著降低（<0.05）；與H組相比，給予PNS干預后，Notch3和Hes-1的蛋白水平顯著降低，p27Kip1的蛋白水平顯著升高（<0.05），見圖3。

Figure 3.The protein expression of Notch3，Hes-1 and p27Kip1 in each group. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs C group； #P<0.05 vs H group.

4　PNS對大鼠肺組織PCNA和caspase-3蛋白水平的影響

與C組相比，H組大鼠肺組織PCNA的蛋白水平顯著升高，caspase-3的蛋白水平顯著降低（<0.05）；與H組相比，給予PNS干預后，PCNA的蛋白水平顯著降低，caspase-3的蛋白水平顯著升高（<0.05），見圖4。

Figure 4.The protein expression of caspase-3 and PCNA in each group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs C group； #P<0.05 vs H group.

5　PNS對大鼠肺組織Notch3、Hes-1和p27Kip1 mRNA表達的影響

與C組相比，H組Notch3和Hes-1的mRNA水平顯著升高，p27Kip1的mRNA水平顯著降低（<0.05）；與H組相比，給予PNS干預后，Notch3和Hes-1的mRNA水平顯著降低，p27Kip1的mRNA水平顯著升高（<0.05），見圖5。

Figure 5.Relative mRNA expression levels of Notch3，Hes-1 and p27Kip1 in each group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs C group； #P<0.05 vs H group.

討論

低氧能導致肺動脈內(nèi)皮細胞功能發(fā)生紊亂，誘發(fā)產(chǎn)生炎癥反應［10］，從而導致肺血管重構(gòu)和平滑肌細胞增殖，促進低氧性肺動脈高壓的形成［11-12］。肺動脈高壓的特征是肺血管重構(gòu)和肺血管阻力增加，進而導致右心室后負荷持續(xù)增加，從而導致心力衰竭和死亡［4］。PNS作為三七的有效提取成分，其在心血管系統(tǒng)疾病的治療中具有廣泛的應用，具有擴張血管，抑制血小板凝集，延長凝血時間，降血脂，清除自由基、抗炎和抗氧化的作用［7］。有研究表明，PNS可能通過介導MAPK通路延緩低氧高二氧化碳導致的肺動脈高壓。PNS對于很多器官均有保護作用［13］，對于肝臟來說它有明顯的降脂功能［14］，對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護作用［8］。本實驗發(fā)現(xiàn)，低氧誘導肺動脈高壓大鼠發(fā)生的肺血管重構(gòu)和右心室肥厚，通過PNS可能改善這些癥狀，從而緩解大鼠心肺功能。

肺血管不可逆性重塑是肺動脈高壓最明顯的特性，因此改善肺血管重構(gòu)是治療肺動脈高壓的關鍵。本次研究通過觀察肺動脈血管壁厚度水平來評估肺血管重構(gòu)的程度。HE染色發(fā)現(xiàn)，H組大鼠的肺血管壁厚度顯著增厚，經(jīng)PNS治療后，血管壁增厚得到明顯改善，WT%和WA%明顯降低，證實PNS可減輕肺動脈管壁的增厚，抑制肺血管重構(gòu)。

雖然目前導致肺動脈高壓的發(fā)生機制仍不明確，但有學者認為Notch信號通路參與肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展［9］。Notch信號通路是進化中高度保守的信號轉(zhuǎn)導通路，其調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡的功能幾乎涉及所有組織和器官，哺乳動物擁有4個基因，編碼4種Notch受體（Notch1，2，3，4）［15］，而Notch3受體目前被驗證主要存在于平滑肌細胞，通過研究證明［16］，Notch3可以影響肺血管重構(gòu)，而不影響肺功能。同時，Notch3是嚙齒動物缺氧性肺動脈高壓形成的必要條件，而且其也證明了嚙齒動物的肺動脈高壓可以通過阻斷Notch3信號來有效治療。而Notch3信號通路在心血管系統(tǒng)的表現(xiàn)也與平滑肌細胞的增殖有著密切的關系［9］。本實驗結(jié)果表明，H組大鼠肺組織的Notch信號通路（Notch3和Hes-1）的蛋白和mRNA表達水平增強，p27Kip1的蛋白和mRNA水平降低，由p27Kip1引發(fā)的PCNA蛋白表達增高，caspase-3蛋白表達降低，而PNS明顯抑制了低氧導致的Notch信號通路的激活，提示PNS可能通過抑制Notch信號通路發(fā)揮其抗增殖和促凋亡的作用，從而抑制肺動脈重構(gòu)，緩解低氧性肺動脈高壓。

綜上所述，PNS可能通過抑制Notch3/Hes-1/p27Kip1通路，顯著降低肺血管重構(gòu)，逆轉(zhuǎn)低氧引起的肺動脈高壓和右心室肥厚。本研究可為PNS治療低氧性肺動脈高壓的臨床應用提供實驗依據(jù)。

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saponins inhibit pulmonary vascular remodeling in hypoxic pulmonary hypertensive rats via Notch3/Hes-1/p27Kip1signaling pathway

ZHANG Sai，SONG Zheng-yang，WANG Shu-yuan，TIAN Yun-na，WANG Xiao-ting，LIN Qing-qing，WANG Wan-tie△

（，，325035，）

To explore the effects ofsaponin （PNS） on hypoxia pulmonary hypertension （HPH）-induced pulmonary vascular remodeling in rats.Male SD rats were randomly divided into 3 groups： normoxic control group （C group），hypoxia group （H group） and PNS group （P group）. Mean pulmonary artery pressure，right ventricular hypertrophy index and pulmonary vascular remodeling were detected. The protein levels of Notch3，Hes1，p27Kip1，proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and caspase-3 were measured by Western blot. The mRNA expression levels of Notch3，Hes-1 and p27Kip1were measured by RT-qPCR.Pulmonary hypertension，right rentricular hypertrophy and pulmonary vascular remodeling were observed in HPH model rats，with increased expression of Notch3，Hes-1 and PCNA，and decreased expression of p27Kip1and caspase-3 （<0.05）. Furthermore，PNS treatment alleviated pulmonary hypertension and right rentricular hypertrophy，and inhibited hypoxia-induced pulmonary vascular remodeling. Treatment with PNS also inhibited the expresion of Notch3，Hes-1 and PCNA，and stimulated the expresion of p27Kip1and caspase-3 （<0.05）.Treatment with PNS attenuates HPH pulmonary vascular remodeling in rats by inhibition of Notch3/Hes-1/p27Kip1signaling pathway.

Pulmonary hypertension； Hypoxia；saponins； Notch3/Hes-1/p27Kip1signaling pathway； Vascular remodeling

R543.2； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.003

1000-4718（2022）02-0209-06

2021-10-11

2021-11-25

［基金項目］浙江省介入肺臟病重點實驗室建設項目（No. 2019E10014）

Tel： 13587688106； E-mail： wwt@wmu.edu.cn

（責任編輯：余小慧，宋延君）