李春玲，賀 婧，王立元，李翠英，龍 凱，翁美芝，馮 馳，謝小梅*

淡豆豉炮制中黃曲霉毒素產(chǎn)毒株的篩選鑒定和產(chǎn)毒能力測(cè)定

李春玲1, 4，賀 婧2#，王立元1，李翠英1，龍 凱1，翁美芝1，馮 馳3*，謝小梅1*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004 2.南昌大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，江西 南昌 330031 3.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006 4.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院泌尿外科，廣東 清遠(yuǎn) 511500

對(duì)淡豆豉炮制過程中產(chǎn)黃曲霉毒素（aflatoxins，AFTs）的微生物（簡(jiǎn)稱產(chǎn)毒菌）進(jìn)行篩選鑒定、定量分析和產(chǎn)毒能力測(cè)定。運(yùn)用紫外熒光法初篩淡豆豉炮制中各樣本的產(chǎn)毒菌并菌落計(jì)數(shù)；對(duì)初篩菌株的18S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI同源性比對(duì)、MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定；應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測(cè)各產(chǎn)毒菌培養(yǎng)液中AFTs含量，確定各產(chǎn)毒菌的產(chǎn)毒能力。紫外熒光法結(jié)合分子生物學(xué)共篩選鑒定出15株產(chǎn)毒菌株，為黃曲霉和溜曲霉；“黃衣上遍”階段產(chǎn)毒菌菌落數(shù)逐漸增多，至發(fā)酵第6天時(shí)最多，為1×106.30CFU/g，進(jìn)入“再悶”階段產(chǎn)毒菌數(shù)量逐漸減少，從再悶第9天開始至第15天均未檢測(cè)到產(chǎn)毒菌；經(jīng)UPLC-MS/MS法確定15株菌中有5株不產(chǎn)毒，10株產(chǎn)毒，且產(chǎn)毒能力各不相同并均低于5 ng/mL，遠(yuǎn)低于黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)株（654.90 ng/mL）。淡豆豉炮制過程中存在產(chǎn)AFTs能力不同的黃曲霉、溜曲霉且產(chǎn)毒菌數(shù)量呈現(xiàn)先升后降，將為探討淡豆豉炮制中AFTs消長(zhǎng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并首次從安全性角度證實(shí)了淡豆豉“再悶”的重要性和“再悶”時(shí)間的合理性。

淡豆豉；炮制過程；黃曲霉毒素；產(chǎn)毒能力；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)；黃曲霉；溜曲霉

淡豆豉（SSP）為豆科大豆屬植物大豆(L.) Merr.成熟種子的發(fā)酵加工品，以黑色種皮品系大豆為主料，桑葉、青蒿為輔料經(jīng)自然發(fā)酵而成。被歷代本草和歷版《中國藥典》收錄，列入衛(wèi)生部首批藥食兩用名單，其味苦、辛，性涼，歸肺、胃經(jīng)，具有解表、除煩、宣發(fā)郁熱之功，在心血管疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松、乳腺癌及女性更年期綜合征、抑郁癥等重大疾病的預(yù)防和控制中有廣闊應(yīng)用前景[1-3]。

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFTs）是主要由黃曲霉、寄生曲霉、溜曲霉等曲霉產(chǎn)生的一類化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的次生代謝產(chǎn)物，目前發(fā)現(xiàn)AFTs有20多種，主要有黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2），其中以AFB1毒性最強(qiáng)。研究表明，人和牲畜長(zhǎng)期暴露于AFTs會(huì)導(dǎo)致其免疫抑制、營養(yǎng)代謝不良、不孕、先天畸形、內(nèi)分泌紊亂以及嚴(yán)重的肝細(xì)胞癌變等，并不是所有的黃曲霉、溜曲霉都產(chǎn)生AFTs，產(chǎn)毒黃曲霉占自然界中黃曲霉的30%～60%，非產(chǎn)毒黃曲霉常作為曲種應(yīng)用于食品、中藥等發(fā)酵工業(yè)中[4-5]。

淡豆豉炮制時(shí)間較長(zhǎng)，一般20 d左右，經(jīng)過“黃衣上遍”和“再悶”2個(gè)主要階段，在完全開放的炮制中每個(gè)過程都有可能污染黃曲霉、溜曲霉并產(chǎn)生AFTs。本課題組前期已發(fā)現(xiàn)在淡豆豉炮制中AFTs含量呈動(dòng)態(tài)變化，并存在黃曲霉和溜曲霉[6-8]，但未對(duì)它們是否產(chǎn)毒及產(chǎn)毒能力進(jìn)行研究，迄今仍無淡豆豉炮制中AFTs產(chǎn)毒菌的相關(guān)研究報(bào)道。本研究對(duì)淡豆豉炮制中7個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)樣本的產(chǎn)AFTs微生物進(jìn)行篩選鑒定、菌落計(jì)數(shù)和產(chǎn)AFTs能力測(cè)定。研究結(jié)果將為揭示淡豆豉炮制過程中AFTs消長(zhǎng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并對(duì)規(guī)范淡豆豉炮制工藝和保障其安全性有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

MJ-150Ⅰ霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；PTC-200普通PCR儀，BIO-RAD公司；Nexera X2超快速液相色譜儀，日本島津公司；AB Sciex QTRAP 4500三重四極桿線性離子肼串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB Sciex公司。

1.2 材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株 產(chǎn)毒黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)株，購于中國普通微生物菌種保藏中心，編號(hào)CGMCC3.4408。

1.2.2 試劑 曲霉素瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)20191026，青島高科技海博生物技術(shù)有限公司；AFTs混合對(duì)照品（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2），批號(hào)CRM46300，質(zhì)量濃度分別為1.0、0.3、1.0、0.3 μg/mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，Supelco公司；植物基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR master Mix，批號(hào)Cat#DP305- 02、Cat.CW0632S，北京天根生化科技有限公司；2,6-二甲基-β-環(huán)糊精（批號(hào)402G021）、瓊脂糖（批號(hào)1209B022），索萊寶生物科技有限公司；Hypersil Gold（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），賽默飛世爾科技有限公司；甲醇、乙腈，批號(hào)2003191、20022221，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 淡豆豉炮制過程中各時(shí)間點(diǎn)樣本制備和取樣

本課題組前期參照《中國藥典》2010年版已建立規(guī)范的淡豆豉炮制工藝（歷版《中國藥典》記載的淡豆豉制法相同，含2020年版）[6-9]。淡豆豉炮制過程中每3天取樣1次，“黃衣上遍”階段分別記為發(fā)酵初始、發(fā)酵3 d、發(fā)酵6 d，“再悶”階段分別記為再悶3 d、再悶6 d、再悶9 d、再悶12 d、再悶15 d和蒸后成品，編號(hào)分別為F0、F3、F6、Z3、Z6、Z9、Z12、Z15、SSP。成品性狀和各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合《中國藥典》2020年版要求。各樣品盡快置于4 ℃保存，1周內(nèi)完成檢測(cè)。

2.2 淡豆豉炮制過程中AFTs產(chǎn)毒菌的篩選、菌落計(jì)數(shù)

2.2.1 含2,6-二甲基-β-環(huán)糊精的曲霉素瓊脂培養(yǎng)基的配制 45.6 g曲霉素瓊脂培養(yǎng)基加入2,6-二甲基- β-環(huán)糊精6 g，置1000 mL蒸餾水中加熱溶解，121 ℃滅菌20 min。

2.2.2 AFTs產(chǎn)毒菌的篩選和菌落計(jì)數(shù) 整個(gè)過程無菌操作。定量稱取淡豆豉炮制過程中不同時(shí)間點(diǎn)樣本，研磨，取研磨后的各樣品1 g加9 mL無菌生理鹽水制成1∶10的稀釋液，充分振蕩30 min，取1 mL稀釋液加入另1支裝有9 mL無菌生理鹽水的離心管中，依次進(jìn)行10倍稀釋，使之分別成為0.1、0.01、0.001、1×10?4、1×10?5、1×10?6、1×10?7稀釋液，依據(jù)培養(yǎng)平板上的菌落數(shù)（肉眼可計(jì)數(shù)范圍），選擇合適的3個(gè)不同濃度稀釋液，F(xiàn)3、Z3、Z6選擇0.001、1×10?4、1×10?5稀釋液，F(xiàn)6選擇1×10?4、1×10?5、1×10?6稀釋液，Z9、Z12、Z15選擇0.1、0.01、0.001稀釋液，分別吸取100 μL稀釋液注入含2,6-二甲基-β-環(huán)糊精的曲霉素瓊脂培養(yǎng)基平皿中，用涂布棒涂布均勻，每個(gè)稀釋度重復(fù)3個(gè)平皿。于28 ℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～8 d。

將長(zhǎng)出菌落的平皿置紫外燈（波長(zhǎng)365 nm）下觀察，如菌落周圍的培養(yǎng)基中出現(xiàn)藍(lán)紫色或黃綠色熒光初步定為AFTs產(chǎn)毒菌，對(duì)產(chǎn)生藍(lán)紫色或黃綠色熒光的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，挑取產(chǎn)熒光菌落再次劃線分離、純培養(yǎng)。用液體石蠟斜面保存初篩產(chǎn)毒菌株并編號(hào)，如在“黃衣上遍”階段第3天初篩到的產(chǎn)毒菌株編號(hào)為F3-1、F3-2、F3-3等，第6天初篩到的產(chǎn)毒菌株編號(hào)為F6-1、F6-2、F6-3等；在“再悶”階段第3天初篩到的產(chǎn)毒菌株編號(hào)為Z3-1、Z3-2、Z3-3等，第6天初篩到的產(chǎn)毒菌株編號(hào)為Z6-1、Z6-2、Z6-3等。

2.2.3 淡豆豉炮制中各樣本產(chǎn)熒光菌的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果 炮制過程中產(chǎn)熒光的菌落數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，“黃衣上遍”階段的發(fā)酵第6天時(shí)（F6）菌落數(shù)最多，達(dá)1×106.30CFU/g，之后產(chǎn)熒光菌落數(shù)逐漸減少，至再悶第9天后已沒有產(chǎn)熒光菌，表明產(chǎn)毒菌數(shù)量隨炮制過程中生存環(huán)境的改變發(fā)生規(guī)律性變化；且都是藍(lán)紫色熒光的菌落，可見產(chǎn)毒菌產(chǎn)生的AFTs以AFB1或AFB2為主，各菌產(chǎn)AFTs的種類和含量還需用UPLC-MS/MS法驗(yàn)證，結(jié)果見表1和圖1。

2.3 產(chǎn)AFTs菌株的鑒定

按植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取各菌株DNA，用18S rDNA通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為ITS1：5’-CTTGGTCATTTAGAG- GAAGTAA-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATAT- GC-3’。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL（濃度10 μmol/L），2×Taq PCR master Mix 12.5 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃、1 min；94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1 min，

30個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上比對(duì)、下載同源性高的序列及模式菌株的序列在MEGA 7.0軟件上建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 淡豆豉炮制過程中不同時(shí)間點(diǎn)樣本中產(chǎn)熒光的菌落數(shù)

圖1 各樣本培養(yǎng)皿中產(chǎn)生熒光現(xiàn)象的菌落

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序、測(cè)序結(jié)果提交至NCBI的 GenBank數(shù)據(jù)中進(jìn)行Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)6-1、F6-2、F6-3、F6-4、F6-5、F6-6、F3-1、Z6-1、Z3-2、Z3-5與黃曲霉的同源性達(dá)100%，Z3-1、Z3-3、Z3-4、Z3-6、Z3-7與溜曲霉的同源性達(dá)100%。選取同源性較高的模式菌株序列，采用MEGA 7軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，F(xiàn)6-1、F6-2、F6-3、F6-4、F6-5、F6-6、F3-1、Z6-1、Z3-2、Z3-5與黃曲霉聚于一支，親緣關(guān)系最近，鑒定為黃曲霉；Z3-1、Z3-3、Z3-4、Z3-6、Z3-7與溜曲霉聚于一支，親緣關(guān)系最近，鑒定為溜曲霉?！包S衣上遍”階段中發(fā)酵第3、6天為黃曲霉，“再悶”階段為黃曲霉和溜曲霉，可見淡豆豉炮制過程中產(chǎn)AFTs菌以黃曲霉和溜曲霉為主。見表2和圖2。

2.4 UPLC-MS/MS法測(cè)定產(chǎn)毒菌的產(chǎn)AFTs能力

2.4.1 色譜條件 Hypersil Gold（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱溫25 ℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脫：0～1.0 min，35%乙腈；1.0～2.5 min，35%～50%乙腈；2.5～3.0 min，50%～80%乙腈；3.0～3.1 min，80%～35%乙腈；3.1～5.0 min，35%乙腈；體積流量0.2 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

表2 產(chǎn)熒光現(xiàn)象微生物NCBI基因序列比對(duì)結(jié)果

圖2 產(chǎn)熒光現(xiàn)象的曲霉菌系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），正離子模式；離子噴射電壓（ion spray voltage，IS）4.5 kV；離子源溫度（ion source temperature，TEM）500 ℃；霧化氣（nebulizer gas，GS1）壓力310.264 kPa（45 psi），加熱氣（heater gas，GS2）壓力344.738 kPa（50 psi），氣簾氣體（curtain gas，N2），壓力241.316 kPa（35 psi）。掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）。4種黃曲霉毒素質(zhì)譜分析參數(shù)見表3。

表3 4種AFTs的其他質(zhì)譜分析參數(shù)

2.4.3 對(duì)照品溶液的制備 精密吸取AFTs混合對(duì)照品（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2質(zhì)量濃度分別為1.0、0.3、1.0、0.3 μg/mL）溶液0.5 mL 于1 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲(chǔ)備液，于?20 ℃冰箱避光保存，備用。

2.4.4 供試品溶液的制備 將保存的產(chǎn)毒菌和黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)株分別進(jìn)行活化，28 ℃培養(yǎng)5 d，加入適量的無菌生理鹽水洗脫孢子，無菌紗布濾過以濾除菌絲球，得到孢子懸浮液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度為1×106.59CFU/mL。吸取2 mL 1×106.59CFU/mL各曲霉孢子懸浮液于25 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置28 ℃、120 r/min搖床中培養(yǎng)5 d。分別吸取1.5 mL發(fā)酵液于2 mL離心管中，10 000×離心10 min，取1 mL各發(fā)酵上清液用氮?dú)獯抵两?，加甲醇?fù)溶，12 000×離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，上機(jī)測(cè)定。

2.4.5 線性關(guān)系考察 從儲(chǔ)備液中精密吸取0.1 mL于1 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為工作液。精密量取工作液，用甲醇稀釋成建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所用系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，混勻，上機(jī)測(cè)定。將質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)（），各質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的峰面積作縱坐標(biāo)（），AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝35 783＋12 495，＝0.999 6；AFB2的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝38 106＋3 381.7，＝0.999 6；AFG1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝22 839＋7 820.1，＝0.999 5；AFG2的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝9 212.8＋1 372.9，＝0.999 6。AFB1、AFG1在0.80～25.60 ng/mL線性關(guān)系良好，AFB2、AFG2在0.24～7.68 ng/mL線性關(guān)系良好。

2.4.6 精密度考察 配制AFTs混合對(duì)照品溶液（AFB1和AFG1質(zhì)量濃度為5 ng/mL，AFB2和AFG2質(zhì)量濃度為1.5 ng/mL），按“2.4.1”“2.4.2”項(xiàng)條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積，結(jié)果AFB1、AFB2、AFG1、AFG2峰面積的RSD分別為1.58%、2.51%、1.07%、1.27%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩(wěn)定性考察 取無菌發(fā)酵液1份，加AFT混合對(duì)照品（AFB1和AFG1加入量為5 ng/mL，AFB2和AFG2加入量為1.5 ng/mL），按“2.4.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.4.1”“2.4.2”項(xiàng)條件，分別于0、4、8、12、16、20、24 h測(cè)定，以4種AFT含量來計(jì)算，RSD分別為1.64%、2.66%、1.16%、2.57%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 重復(fù)性考察 平行取無菌發(fā)酵液6份，精密加AFTs混合對(duì)照品（AFB1、AFG1為5 ng/mL，AFB2、AFG2為1.5 ng/mL）溶液，按“2.4.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.4.1”“2.4.2”項(xiàng)條件，分別進(jìn)樣2 μL進(jìn)行測(cè)定，以4種AFTs質(zhì)量分?jǐn)?shù)來計(jì)算。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的RSD分別為2.08%、3.50%、1.18%、1.66%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.9 加樣回收率考察 平行取無菌發(fā)酵液6份，分別精密加入低、高2種質(zhì)量濃度的AFTs混合對(duì)照品溶液（AFB1和AFG1分別添加2、5 ng/mL 2種質(zhì)量濃度，AFB2和AFG2分別添加0.6、1.5 ng/mL 2種質(zhì)量濃度），每種質(zhì)量濃度各3份，按“2.4.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.4.1”“2.4.2”項(xiàng)條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，4種AFTs的加樣回收率介于91.47%～94.87%，RSD在1.01%～2.47%。

2.4.10 各菌產(chǎn)AFTs能力 按“2.4.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.4.1”“2.4.2”項(xiàng)條件測(cè)定，計(jì)算各菌產(chǎn)AFTs的能力，結(jié)果表明有5株菌不產(chǎn)AFTs，其中3株為黃曲霉，2株為溜曲霉；有10株菌產(chǎn)AFTs，但它們產(chǎn)毒能力各不相同，均在5 ng/mL以下，遠(yuǎn)低于黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)株（CGMCC3.4408）的產(chǎn)毒量（654.90 ng/mL），產(chǎn)毒菌僅產(chǎn)AFB1。結(jié)果見表4和圖3，可見初篩的產(chǎn)毒菌其產(chǎn)毒能力各不相同。本實(shí)驗(yàn)初篩的15株產(chǎn)熒光菌經(jīng)UPLC-MS/MS驗(yàn)證有5株菌未檢測(cè)出AFTs。

表4 各菌產(chǎn)AFB1能力

3 討論

檢測(cè)產(chǎn)AFT微生物目前有免疫學(xué)方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法。本實(shí)驗(yàn)采用紫外熒光法初篩產(chǎn)毒菌。根據(jù)AFT在紫外光照射下可發(fā)出熒光的原理，將各樣本接種于曲霉素瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～8 d，黃曲霉等菌產(chǎn)生的AFT便浸入培養(yǎng)基中，在紫外燈光照射下會(huì)產(chǎn)生特殊的熒光，AFB1、AFB2發(fā)藍(lán)紫色熒光，AFG1、AFG2發(fā)綠色熒光。本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)基加入了可增強(qiáng)熒光強(qiáng)度的化學(xué)物質(zhì)環(huán)糊精，可提高辨識(shí)度。此法操作較簡(jiǎn)單、便捷，且成本低[4]，可快速檢測(cè)出大批量樣品中是否有產(chǎn)AFTs的菌株。

通過紫外熒光檢測(cè)法對(duì)7個(gè)不同炮制時(shí)間點(diǎn)樣本中的產(chǎn)AFTs菌進(jìn)行初篩并計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示產(chǎn)熒光現(xiàn)象的微生物數(shù)量在淡豆豉炮制過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，“黃衣上遍”階段產(chǎn)熒光菌落數(shù)逐漸增加，至發(fā)酵第6天時(shí)（F6）達(dá)到最大值，為 1×106.30CFU/g，之后開始下降，至“再悶”第9天（Z9）后未檢測(cè)到產(chǎn)熒光微生物。呈現(xiàn)這一趨勢(shì)的原因可能是淡豆豉炮制過程中有多種微生物共同參與，不同炮制時(shí)間點(diǎn)存在不同的優(yōu)勢(shì)菌[6-8,10]。已有許多文獻(xiàn)報(bào)道一些細(xì)菌和真菌具有抑制產(chǎn)AFTs菌生長(zhǎng)繁殖的作用[11-13]。

圖3 各菌產(chǎn)AFB1能力液質(zhì)色譜圖

本實(shí)驗(yàn)室前期從淡豆豉炮制過程中分離的枯草芽孢桿菌、鮭色鎖擲酵母菌、黑曲霉菌、屎腸球菌、鳥腸球菌對(duì)產(chǎn)AFTs黃曲霉的生長(zhǎng)繁殖均有抑制作用，并對(duì)AFB1有降解作用，其中屎腸球菌、鳥腸球菌和枯草芽胞桿菌對(duì)產(chǎn)毒黃曲霉菌的抑制率均達(dá)30%以上，鮭色鎖擲酵母菌對(duì)產(chǎn)毒黃曲霉菌生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)達(dá)64.29%，降解AFB1效果最好，達(dá)43.65%[10]。

紫外熒光法檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)只出現(xiàn)了產(chǎn)藍(lán)紫色熒光的菌落，未出現(xiàn)產(chǎn)綠色熒光的菌落，推測(cè)在淡豆豉炮制過程中存在的產(chǎn)毒菌以產(chǎn)生AFB1或AFB2為主，而使用UPLC-MS/MS法檢測(cè)初篩產(chǎn)毒菌的產(chǎn)毒能力的結(jié)果顯示，篩選到的產(chǎn)毒菌只產(chǎn)生AFB1，這與AFB1在自然界中產(chǎn)量最高、分布最廣泛相一致。通過紫外熒光法對(duì)產(chǎn)AFTs菌進(jìn)行初篩，共篩選出15株菌，并鑒定為黃曲霉和溜曲霉，其中黃曲霉占大多數(shù)，與自然界產(chǎn)AFTs菌中以黃曲霉為主相吻合。因此，在淡豆豉AFTs污染防控上，可以以篩選抑制黃曲霉生長(zhǎng)繁殖和降解AFB1的菌株為主。

本研究通過UPLC-MS/MS法檢測(cè)初篩產(chǎn)毒菌的產(chǎn)毒能力，結(jié)果顯示，15株初篩產(chǎn)毒菌中，有5株未檢測(cè)到產(chǎn)AFTs，表明通過紫外熒光法初篩的產(chǎn)AFTs菌可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)判，更精確的判斷和定量還需要使用更精密的儀器檢測(cè)，如液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等，紫外熒光檢測(cè)法適合于大批量篩除非AFTs產(chǎn)毒菌。另外的10株產(chǎn)毒菌的產(chǎn)毒能力各不相同，均在5 ng/mL以下，遠(yuǎn)低于黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)株CGMCC3.4408的產(chǎn)毒量654.90 ng/mL。各菌株產(chǎn)毒能力的不同，可能與它們的自身生理特性或不同的炮制環(huán)境等因素有關(guān)，這些因素會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)毒相關(guān)基因突變和表達(dá)，AFTs生物合成至少包括21步酶促反應(yīng)，有30多個(gè)基因共同參加[14]。研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉產(chǎn)毒基因簇有大片段基因缺少、重排等多種變異形式，使產(chǎn)毒能力降低或失去產(chǎn)毒能力[15-17]。本實(shí)驗(yàn)室后期將從生理生化和分子生物學(xué)等層面進(jìn)一步研究它們的產(chǎn)毒或不產(chǎn)毒機(jī)制，為淡豆豉炮制過程中AFTs的防控提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Screening, identification and toxin-producing ability analysis of aflatoxin-producing strains in processing of

LI Chun-ling1, 4, HE Jing2, WANG Li-yuan1, LI Cui-ying1, LONG Kai1, WENG Mei-zhi1, FENG Chi3, XIE Xiao-mei1

1.Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2.Institute of Translational Medicine, Nanchang University, Nanchang 330031, China 3.The Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, China 4.Department of Urology, The Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Qingyuan 511500, China

Aflatoxins (AFTs) producing strains (referred to as toxin-producing microorganism) during the processing of(SSP) were screened, identified, quantitatively analyzed, and tested for their toxin-producing ability.Preliminary screening of various toxin-producing microorganism in SSP processing by ultraviolet fluorescence method, then count the colonies; Analyse the 18S rDNA of those strains by PCR amplification and sequencing.The sequences are compared by NCBI homology, and the phylogenetic tree be constructed by MEGA 7.0 for molecular biology identification; Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) were used to detect the AFTs content in the culture solution of each strain to determine their toxin-producing ability.Fifteen toxin-producing strains were screened and identified by ultraviolet fluorescence & molecular biology analyze, which wereor; During the processing of SSP, the toxin-producing microorganism gradually increased during the ‘yellow cladding’ stage, and it became the maximum at the 6th day, which was 1×106.30CFU/g, then it gradually decreased in the ‘secondary fermentation’ stage, even no toxin-producing strains be found during day 9 to day 15; With UPLC-MS/MS, we found that five strains did not produce toxin, 10 strains produced toxin.Though they can make toxin, all the toxin the microorganism made below 5 ng/mL.It’s much lower thanstandard strain (654.90 ng/mL).In the processing of SSP, someandwith different toxin-producing ability were found, and these strains increased at first and decreased later.This study will lay the foundation for studying the law and mechanism of AFTs content changing in SSP processing.It also proved the importance of 'secondary fermentation' and the rationality of 'secondary fermentation' time, from the perspective of safety for the first time.

; processing; aflatoxins; toxin production capacity; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;;

R283.6

A

0253 - 2670(2022)05 - 1411 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.016

2021-08-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82060709）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81660664）；江西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃一般項(xiàng)目（20192BBGL70051）；江西省教育廳科技研究項(xiàng)目（GJJ190634）；江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目（20203BAAW208025）

李春玲（1994—），女，廣西桂平人，實(shí)習(xí)研究員，碩士，從事泌尿系統(tǒng)疾病防治研究。Tel: 19970044053 E-mail: 2084073573@qq.com

通信作者：謝小梅（1964—），女，江西永新人，教授，博士，研究生導(dǎo)師，從事微生物學(xué)研究。Tel: (0791)87118707 E-mail: jxxm1964@sina.com

馮 馳（1981—），男，江蘇常州人，主治醫(yī)師，碩士，從事泌尿外科臨床工作。Tel: 13970006959 E-mail: 306583866@qq.com

#并列第一作者：賀 婧（1990—），女，江西南昌人，講師，博士，從事微生物學(xué)研究。Tel: 15972204520 E-mail: 876401812@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]