葉勁松+衛(wèi)新來+郭夢(mèng)瑤+江雅琪+戴佳秀

摘 要：該文以Ca3（PO4）2為唯一磷源，以固體平板上是否出現(xiàn)溶磷“透明圈”為指標(biāo)來初篩解磷菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)一株霉菌，平板上長(zhǎng)勢(shì)良好，未產(chǎn)生明顯“透明圈”；經(jīng)液體搖瓶培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的解磷能力，上清液中有效磷在第6天達(dá)到極值10.66mg/L，pH值從起始7.21下降到4.52。以“透明圈”作為解磷菌的初篩標(biāo)準(zhǔn)，可能會(huì)丟失部分解磷菌。

關(guān)鍵詞：不產(chǎn)透明圈；解磷菌；初篩；溶磷能力

中圖分類號(hào) S154 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）23-0038-02

解磷菌是一類能夠溶解土壤中難溶態(tài)磷素，釋放出能夠被植物吸收的有效磷的微生物[1]。和傳統(tǒng)的化學(xué)磷肥相比，它具有改善土壤質(zhì)量和結(jié)構(gòu)，提高土壤中磷的有效利用率，節(jié)肥增產(chǎn)，對(duì)保持生態(tài)環(huán)境平衡具有重要意義等優(yōu)點(diǎn)[2-4]，日益受到學(xué)者們的關(guān)注[5-8]。在初篩此類微生物時(shí)，常以磷酸鈣為唯一磷源的選擇性培養(yǎng)基，以在固體平板上是否出現(xiàn)透明的溶磷圈為指標(biāo)，來判斷其是否為解磷菌[7，9]。若有明顯的透明圈，則初步認(rèn)為是解磷菌，否則被丟棄。本研究小組在篩選過程中，發(fā)現(xiàn)有的菌株在固體平板上不產(chǎn)溶磷透明圈，但液體培養(yǎng)顯示具有一定溶磷能力，研究結(jié)果對(duì)于解磷菌初篩方法的改進(jìn)完善具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 菌種：昆明山區(qū)土壤。初篩固體培養(yǎng)基和液體搖床發(fā)酵培養(yǎng)基：見文獻(xiàn)[10]

1.2 方法 初篩方法：稀釋涂布方法，28℃培養(yǎng)，3～5d。逐日觀察，以平板上是否有溶磷圈出現(xiàn)，來初步判斷其溶磷能力。液體發(fā)酵測(cè)定解磷能力方法：1mL霉菌孢子菌懸液（108個(gè)/mL），接入100mL液體培養(yǎng)基，另取滅活的霉菌孢子菌懸液作為對(duì)照。28℃，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)10d。每48h取出，5 000r/min離心10min，取上清液測(cè)定有效磷含量和pH值。有效磷測(cè)定方法：鉬銻抗比色法[11]；pH測(cè)定方法：pH酸度計(jì)。

3 結(jié)果與分析

一般來說，“透明圈”是初步判斷一菌株是否具有溶磷能力的標(biāo)準(zhǔn)方法[12-13]。一直以來，本研究小組都是按照這個(gè)方法進(jìn)行篩選的。在初篩平板上，會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)不產(chǎn)“透明圈”的菌落，多數(shù)菌落小，但是有一株霉菌，不產(chǎn)透明圈，卻長(zhǎng)勢(shì)很旺。對(duì)于這看似奇特的現(xiàn)象，決定進(jìn)一步研究，故純化后進(jìn)行液體搖床繼續(xù)培養(yǎng)。

3.1 初篩 如圖1所示，該青綠色霉菌在平板上長(zhǎng)勢(shì)旺盛。既然在磷酸鈣為唯一磷源的培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)良好，那么該菌肯定能從外界中攝取磷源滿足自身生長(zhǎng)需要，也就是說它應(yīng)該具有溶磷能力，只是沒顯示出“透明圈”，于是繼續(xù)對(duì)其研究。

3.2 無“透明圈”解磷圈的上清液pH變化 圖2顯示，初始日，霉菌和滅活霉菌的液體培養(yǎng)基pH在7.21左右。2d后兩者pH值都開始下降，但霉菌pH值下降更快速，且接種霉菌的上清液的pH值在第6天下降到最低點(diǎn)4.52，這說明此株霉菌確實(shí)產(chǎn)酸；而與此同時(shí)滅活霉菌的上清液pH值，始終在6.8左右。

3.3 無“透明圈”溶磷圈上清液中有效磷變化 從圖3可以看出，上清液中有效磷一直在快速上升，并在第6天達(dá)到最高點(diǎn)10.66mg/L。說明此霉菌確有溶磷能力，能將難溶磷酸三鈣溶解，使得溶液中有效磷含量上升。本實(shí)驗(yàn)只是測(cè)定了上清液中的有效磷，若加上菌體內(nèi)的磷素，實(shí)際總共溶解的有效磷將更可觀[14-15]。在第6天之后有效磷含量下降，可能是隨著時(shí)間推移，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，使得其溶磷能力下降或部分溶磷菌死亡。前6d，有效磷變化趨勢(shì)和pH變化趨勢(shì)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，即pH下降，有效磷上升。似乎是由于產(chǎn)酸，導(dǎo)致不溶磷酸鈣溶解，釋放出有效磷，這也和多數(shù)學(xué)者報(bào)道的溶磷機(jī)制相同[14，16]。此株溶磷霉菌，之所以在平板上沒有明顯的“透明圈”，原因可能是因?yàn)樵摼a(chǎn)酸酸性不夠強(qiáng)，導(dǎo)致溶磷透明圈不明顯，或是由于生長(zhǎng)旺盛的氣生菌絲將很小的溶磷圈覆蓋了，也可能尚存在其他原因。

4 結(jié)論與討論

以“透明圈”判斷菌落是否為解磷菌，可能會(huì)丟失部分解磷菌。平板“透明圈”方法只是進(jìn)行溶磷微生物篩選的較為初步的方法，它并不能作為評(píng)判某微生物是否具有溶磷能力的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法，測(cè)定液體有效磷才是準(zhǔn)確測(cè)定其溶磷能力的可靠方法，因?yàn)椴划a(chǎn)“透明圈”的溶磷菌也極可能有較強(qiáng)的溶磷能力。如對(duì)平板上的所有微生物都進(jìn)行液體搖床有效磷測(cè)定，工作量太大，而“透明圈”法簡(jiǎn)單快捷，卻不完全可靠。如何解決這一對(duì)矛盾，今后仍需要作進(jìn)一步的探討研究。

參考文獻(xiàn)

[1]郝晶，洪堅(jiān)平，謝英荷，等.石灰性土壤磷細(xì)菌的分離、篩選及解磷效果[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（04）：56-59.

[2]王義，賀春萍，鄭肖蘭，等.土壤解磷微生物研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，15（9）：60-64.

[3]Sudana M，Susanta Wirya I G N A，Raka G N.Utilization of Phosphate Solubilizing Rhizobacterium Derived from Leguminosae Plants to Stimulating Plant Growth and Induce Systemic Resistance of Soybean （Glycine max l.Merrill）to Mosaic Diseases[J].International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences，2016，5（9）：600-610.

[4]Prabha A S.Potential Use of Azotobacter and Phosphate Solubilizing Bacteria as Biofertilizer[J].International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences，2016，5（10）：79-90.

[5]梁曉輝，龍小軍，趙豐，等.解磷巨大芽孢桿菌JL-1發(fā)酵條件的初步優(yōu)化[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，20（24）：27-29.

[6]祝凌云，馬忠友，唐欣昀，等.水稻根際高效解磷菌菌株的篩選[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，14（15）：43-44.

[7]王義，余賢美，鄭服叢.熱帶土壤解磷細(xì)菌PSB26的篩選鑒定及拮抗初探[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)（上半月刊），2009，15（07）：59-62.

[8]葉國(guó)平，梁錦鋒.解磷細(xì)菌（PSB）解磷機(jī)理及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，13（09）：53-54.

[9]黃敏，吳金水，黃巧云，等.土壤磷素微生物作用的研究進(jìn)展[J].生態(tài)環(huán)境，2003，12（3）：366-370.

[10]葉勁松，吳克，俞志敏.1株無機(jī)磷細(xì)菌篩選及溶磷能力的測(cè)定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：333-335.

[11]魯如坤.土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，2000.

[12]唐勇，陸玲，楊啟銀，等.解磷微生物及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（2）：1-5.

[13]金術(shù)超，杜春梅，平文祥，等.解磷微生物的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2006（2）：73-78.

[14]趙小蓉，林啟美，孫焱鑫，等.細(xì)菌解磷能力測(cè)定方法的研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，2001（01）：1-4.

[15]Beever R E，Burns D J W.Phosphorus Uptake，Storage and Utilization by Fungi[M].Advances in Botanical Research，H.W W，Academic Press，1981.8，127-219.

[16]馬春浩.解磷微生物及其應(yīng)用研究綜述[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，13（04）：34-36.

（責(zé)編：張宏民）