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荷斯坦奶牛不同群體牛舍土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異分析

2022-03-03 12:55楊思瑞張力莉李勝利徐曉鋒
關(guān)鍵詞:放線菌菌門牛舍

楊思瑞,楊 卓,火 苗,張 潔,張力莉,李勝利,徐曉鋒,*

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

土壤微生物群落由細(xì)菌、古細(xì)菌、病毒、真菌和原生動(dòng)物組成,細(xì)菌和真菌作為土壤中的主要微生物,其生物量通常是其他主要微生物類群(原生生物、古生菌和病毒)的10~10倍。研究表明,土壤優(yōu)勢菌群會(huì)受到土壤來源、地表生物活動(dòng)以及周圍環(huán)境的影響。植被下的土壤中,細(xì)菌多以變形菌門、放線菌門,以及酸桿菌門等為主。用于畜牧業(yè)生產(chǎn)的土壤,由于常受到牲畜糞便的污染,其菌群結(jié)構(gòu)有別與常規(guī)土壤。張雯通過采集銀川周邊四家奶牛場的奶牛糞便、土壤、污水樣本并進(jìn)行16S rDNA V4區(qū)測序,結(jié)果表明,奶牛場土壤的優(yōu)勢菌門為變形菌門、擬桿菌門與放線菌門,與堆積糞便的優(yōu)勢菌門(厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門)基本一致,與新鮮糞便的優(yōu)勢菌門(厚壁菌門、擬桿菌門)差異較大。將蛋雞養(yǎng)殖區(qū)所采集到的新鮮雞糞和土壤樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn),與雞糞細(xì)菌優(yōu)勢菌門種類(厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門)相比,土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌門(變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、酸桿菌門、Planctomycetes、Gemmatimonadetes、厚壁菌門)種類更豐富,施用雞糞后的土壤厚壁菌門與Gemmatimonadetes豐度略有上升,放線菌門豐度下降。別佳等將林蛙人工養(yǎng)殖圈舍與自然棲息地(半人工養(yǎng)殖)的土壤菌群進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn),林蛙養(yǎng)殖密度的增大會(huì)降低土壤中厚壁菌門以及放線菌門的豐度,使藍(lán)細(xì)菌門的豐度升高。

奶牛養(yǎng)殖中產(chǎn)生的糞便中含有大量的細(xì)菌,其中包括很多人畜共患病的致病菌,如奈瑟菌屬()、梭桿菌屬()、嗜血桿菌屬()以及牛布魯氏桿菌等。這些細(xì)菌通過奶牛糞便堆積晾曬后作為臥床墊料或直接排泄至牛舍地面等形式進(jìn)入牛舍土壤,對(duì)人畜健康以及奶牛場環(huán)境的衛(wèi)生安全造成危害。目前對(duì)奶牛場土壤微生物的相關(guān)研究較少,并且其中大部分研究未將不同群體奶牛牛舍的土壤進(jìn)行區(qū)分。基于荷斯坦奶牛不同群體牛舍土壤之間具有不同的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)這一假設(shè),本試驗(yàn)通過采集寧夏某規(guī)模化奶牛場不同群體奶牛牛舍土壤,利用16S rDNA測序,研究不同群體奶牛牛舍土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu),為人畜健康與奶牛場環(huán)境衛(wèi)生安全問題的解決提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2 樣本的采集與處理

鏟除表層土壤,垂直取距離地表5~10 cm深度的土壤100 g,將同類牛舍中不同位置采集到的土樣中隨機(jī)選取5 g進(jìn)行混合。土樣封裝于滅菌袋中,立即帶回試驗(yàn)室進(jìn)行-20 ℃凍存。共18個(gè)樣品,其中干奶牛舍土壤3個(gè)(dcA1、dcA2、dcA3),高產(chǎn)泌乳牛舍土壤3個(gè)(hcA1、hcA2、hcA3),哺乳犢牛島土壤3個(gè)(ncA1、ncA2、ncA3),斷奶犢牛舍土壤3個(gè)(wcA1、wcA2、wcA3),育成牛舍土壤3個(gè)(rcA1、rcA2、rcA3),低產(chǎn)泌乳牛舍土壤3個(gè)(lcA1、lcA2、lcA3)。將樣品送至諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增子測序。

1.3 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

采用磁珠法對(duì)樣本的基因組 DNA 進(jìn)行提取,之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度,取適量的樣本DNA于離心管中,使用無菌水稀釋樣本至1 ng·μL。

以稀釋后的基因組 DNA 為模板,根據(jù)測序區(qū)域的選擇,使用帶 Barcode 的特異引物,New England Biolabs 公司的 Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer,和高效高保真酶進(jìn)行PCR,確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

細(xì)菌16S rDNA序列的V3+V4區(qū)引物序列:上游引物 341F,5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′; 下游引物 806R,5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。

1.4 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠(2%質(zhì)量分?jǐn)?shù))進(jìn)行電泳檢測;根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,充分混勻后使用瓊脂糖凝膠(2%質(zhì)量分?jǐn)?shù))進(jìn)行電泳檢測PCR產(chǎn)物,對(duì)目的條帶使用QIAGEN公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.5 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

使用TruSeqDNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量,文庫合格后,基于Illumina NovaSeq 測序平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測序。

1.6 測序數(shù)據(jù)的處理和物種注釋

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù),截去Barcode和引物序列后使用FLASH對(duì)每個(gè)樣本的reads進(jìn)行拼接,得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags);拼接得到的Raw Tags,需要經(jīng)過嚴(yán)格的過濾處理得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags),之后進(jìn)行如下操作:a)Tags截?。簩aw Tags從連續(xù)低質(zhì)量值(默認(rèn)質(zhì)量閾值為≤19)堿基數(shù)達(dá)到設(shè)定長度(默認(rèn)長度值為3)的第一個(gè)低質(zhì)量堿基位點(diǎn)截?cái)啵籦)Tags長度過濾:Tags經(jīng)過截取后得到的Tags數(shù)據(jù)集,進(jìn)一步過濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags長度75%的Tags。經(jīng)過以上處理后得到的Tags序列通過與物種注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)檢測嵌合體序列,并最終去除其中的嵌合體序列,得到最終的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。

根據(jù)薪酬數(shù)據(jù)公司Equilar曾做過的一項(xiàng)調(diào)查分析,從外部挖來的CEO候選人的平均薪酬比內(nèi)部提拔的高管薪酬遠(yuǎn)高得多,但他們的表現(xiàn)往往卻不盡如人意。外部聘用的風(fēng)險(xiǎn)總是大于內(nèi)部晉升?;诖?,越來越多公司更傾向于從內(nèi)部物色接班人。那么內(nèi)部接班人又要從哪來?《哈佛商業(yè)評(píng)論》的文章中就有提到:研究表明,大多數(shù)公司現(xiàn)任領(lǐng)導(dǎo)者的候選人都虛懸以待,但每年大約有10%—15%的公司都不得不面臨任命新CEO的問題。人選不佳、倉促更替是企業(yè)權(quán)杖交接不得不跨過的檻。

利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001,http://www.drive5.com/uparse/)對(duì)所有樣本的全部 Effective Tags進(jìn)行聚類,默認(rèn)以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units),用Mothur方法與SILVA132(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋分析,設(shè)定比對(duì)閾值為80%。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU分析

基于Illumina Nova 測序平臺(tái)測序,對(duì)所有樣本的 Effective Tags 以 97%的一致性(identity)進(jìn)行OTUs聚類,共得到4 110個(gè)OTU。試驗(yàn)各牛舍土壤的OTU數(shù)目之間差異均不顯著(>0.05),如圖1所示,各牛舍土壤共有的OTU數(shù)目為857,干奶牛舍土壤、高產(chǎn)泌乳牛舍土壤、哺乳犢牛島土壤、斷奶犢牛舍土壤、育成牛舍土壤、低產(chǎn)泌乳牛舍土壤特有的OTU數(shù)目分別為174、80、137、196、77、225。

dcA,干奶牛舍;hcA,高產(chǎn)泌乳牛舍;ncA,哺乳犢牛島;wcA,斷奶犢牛舍;rcA,育成牛舍;lcA,低產(chǎn)泌乳牛舍。下同。

2.2 Alpha多樣性

2.2.1 稀釋曲線

由圖2可知,隨著測序深度的增加,最終所有曲線都達(dá)到了平緩期,說明當(dāng)前測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中的所有物種,足夠進(jìn)行樣品菌群多樣性分析。

圖2 稀釋曲線

2.2.2 Alpha多樣性指數(shù)

Alpha多樣性指數(shù)中,Ace指數(shù)、Observed_species指數(shù)和Chao 1指數(shù)反映樣品中群落的豐富度,而不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況。Shannon指數(shù)以及 Simpson指數(shù)反映群落的多樣性,受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響,Goods_coverage為樣品的物種覆蓋率。如表1所示,各牛舍土壤細(xì)菌菌群的物種覆蓋率均達(dá)到99%以上,說明測序結(jié)果足以反映各牛舍土壤細(xì)菌菌群的細(xì)菌菌群情況,各牛舍土壤細(xì)菌菌群之間Alpha多樣性指數(shù)均不顯著(>0.05),說明各牛舍土壤細(xì)菌菌群的物種多樣性沒有差異。

表1 牛舍土壤細(xì)菌菌群Alpha多樣性指數(shù)

2.3 Beta多樣性分析

基于Weighted Unifrac距離來進(jìn)行PCoA分析,并選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖展示,如果樣品距離越接近,表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似。

從圖3中可以看出,Weighted Unifrac距離的第1主坐標(biāo)(PC1)和第2主坐標(biāo)(PC2)的貢獻(xiàn)率分別為32.4%與28.57%。各試驗(yàn)牛舍土壤樣品的組內(nèi)距離普遍小于組間距離,相較于其他各牛舍土壤之間的距離,高產(chǎn)泌乳牛舍土壤與低產(chǎn)泌乳牛舍土壤兩組之間的距離較近。說明當(dāng)同時(shí)考慮物種有無和物種豐度時(shí),各牛舍土壤樣品的組內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)相似度普遍高于組間菌群結(jié)構(gòu)相似度,高產(chǎn)泌乳牛舍土壤與低產(chǎn)泌乳牛舍土壤兩組之間的菌群結(jié)構(gòu)較接近。

圖3 牛舍土壤細(xì)菌菌群基于Weighted Unifrac距離的PCoA

2.4 荷斯坦奶牛不同群體牛舍土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異變化分析

本次測序中,各牛舍土壤于細(xì)菌界中共測出37個(gè)門、55個(gè)綱、126個(gè)目、256個(gè)科、671個(gè)屬。

2.4.1 門水平

表2共列出豐度較高的11個(gè)菌門,如表2所示,各牛舍土壤共有的優(yōu)勢菌門(豐度>10%)為變形菌門與擬桿菌門,干奶牛舍土壤與哺乳犢牛島土壤特有的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、放線菌門;泌乳牛舍土壤(高產(chǎn)泌乳牛舍土壤、低產(chǎn)泌乳牛舍土壤)與育成牛舍土壤特有的優(yōu)勢菌門為放線菌門;斷奶犢牛舍土壤特有的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門。

表2 牛舍土壤細(xì)菌門水平豐度

放線菌門豐度比較,泌乳牛舍土壤顯著高于其他牛舍土壤(<0.05)。綠彎菌門豐度比較,育成牛舍土壤極顯著高于干奶牛舍土壤、高產(chǎn)泌乳牛舍土壤、哺乳犢牛島土壤(<0.01)。Gemmatimonadates菌門與軟壁菌門豐度比較,斷奶犢牛舍土壤極顯著高于其他牛舍土壤(<0.01)。unidentified_Bacteria豐度比較,哺乳犢牛島土壤(1.917%)極顯著高于其他牛舍土壤(<0.01)。

2.4.2 屬水平

表3共列出豐度較高的20個(gè)菌屬,如表3所示,干奶牛舍土壤的優(yōu)勢菌屬(豐度>3%)為、、、脫硫桿菌屬、鹽單胞菌屬,共占24.20%,其中脫硫桿菌屬的豐度極顯著高于其他牛舍土壤(<0.01)。哺乳犢牛島土壤的優(yōu)勢菌屬為嗜冷桿菌屬、鳥桿菌屬、、不動(dòng)桿菌屬、,共占29.57%,其中嗜冷桿菌屬的豐度極顯著高于其他牛舍土壤(<0.01)。斷奶犢牛舍土壤的優(yōu)勢菌屬為硫堿螺旋菌屬、、、,共占26.37%,其中硫堿螺旋菌屬的豐度極顯著高于其他牛舍土壤(<0.01)。育成牛舍土壤的優(yōu)勢菌屬為、、、甲基桿菌屬,共占19.80%,其中、的豐度極顯著高于其他牛舍土壤(<0.01)。豐度比較,斷奶犢牛舍土壤顯著高于干奶牛舍土壤、育成牛舍土壤(<0.05),極顯著高于哺乳犢牛島土壤與泌乳牛舍土壤(<0.01),干奶牛舍土壤與育成牛舍土壤極顯著高于泌乳牛舍土壤(<0.01),顯著高于哺乳犢牛島土壤(<0.05)。

表3 牛舍土壤細(xì)菌屬水平豐度

高產(chǎn)泌乳牛舍土壤的優(yōu)勢菌屬為不動(dòng)桿菌屬、、鞘脂桿菌屬,共占15.54%。低產(chǎn)泌乳牛舍土壤的優(yōu)勢菌屬為、藤黃色單胞菌屬、,共占13.66%,其中藤黃色單胞菌屬的豐度極顯著高于其他牛舍土壤(<0.01)。泌乳牛舍土壤中,鞘脂桿菌屬、的豐度顯著高于其他牛舍土壤(<0.05),極顯著高于其他牛舍土壤(<0.01)。

3 討論

本試驗(yàn)中,各牛舍土壤細(xì)菌菌群的Alpha多樣性指數(shù)雖然無顯著差異,但是Beta多樣性結(jié)果表明各牛舍土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異,與Liu等的結(jié)果一致,證明假設(shè)成立,牛舍土壤的細(xì)菌會(huì)受到奶牛群體的影響,呈現(xiàn)不同的群落結(jié)構(gòu)。主坐標(biāo)分析(PCoA)結(jié)果表明,高產(chǎn)泌乳牛舍土壤與低產(chǎn)泌乳牛舍土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)更加接近。

各牛舍土壤的優(yōu)勢菌門基本為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門,與豬糞堆肥、奶牛堆積糞便以及奶牛場土壤的優(yōu)勢菌門相似,但與奶牛新鮮糞便、新鮮雞糞存在一定差異。生產(chǎn)中常常將牛糞堆肥作為泌乳牛臥床的墊料以改善泌乳牛舒適度,而完成腐熟的牛糞堆肥中放線菌門的豐度較高。Sun等的研究結(jié)果同樣表明未進(jìn)行充氣處理的臥床墊料中放線菌門的豐度高達(dá)30.3%。本試驗(yàn)結(jié)果中,泌乳牛舍土壤中放線菌門的豐度顯著高于其他牛舍土壤,原因可能是泌乳牛臥床墊料中的菌群影響了泌乳牛舍土壤的細(xì)菌結(jié)構(gòu)。

各牛舍土壤的優(yōu)勢菌屬差異較大,但也存在一些規(guī)律。、、以及嗜冷桿菌屬等可以對(duì)碳水化合物、蛋白質(zhì)進(jìn)行降解,主要分布在干奶牛舍土壤(、、)、哺乳犢牛島土壤(、、嗜冷桿菌屬)以及斷奶犢牛舍土壤(、、)與育成牛舍土壤(),其中具有一定的嗜鹽堿性。嗜鹽堿的菌屬有脫硫桿菌屬、鹽單胞菌屬、硫堿螺旋菌屬,主要分布在干奶牛舍土壤(脫硫桿菌屬、鹽單胞菌屬)以及斷奶犢牛舍土壤(硫堿螺旋菌屬),其中脫硫桿菌屬可以利用氫對(duì)硫酸鹽進(jìn)行還原,硫堿螺旋菌屬可以將硫化物氧化。不動(dòng)桿菌屬與鞘脂桿菌屬可引起人類呼吸道疾病并且存在較強(qiáng)的耐藥性,主要分布在高產(chǎn)泌乳牛舍土壤,其中鞘脂桿菌屬還可以降解多環(huán)芳烴類有機(jī)物以及緩解土壤的重金屬污染。在育成牛舍土壤的優(yōu)勢菌屬中,與的豐度顯著高于其他牛舍土壤,二者均為革蘭氏陰性好氧菌、嚴(yán)格異養(yǎng)、氧化酶陰性、過氧化氫酶陽性,其中還可以對(duì)部分脂類與蛋白質(zhì)進(jìn)行降解。

4 小結(jié)

各牛舍土壤菌群Alpha多樣性無差異,菌群結(jié)構(gòu)差異明顯。各牛舍土壤的優(yōu)勢菌門差異不明顯,基本為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門與厚壁菌門。各牛舍土壤的優(yōu)勢菌屬差異明顯,、、等蛋白質(zhì)降解菌在非泌乳階段牛舍土壤中的豐度較高;脫硫桿菌屬、鹽單胞菌屬、硫堿螺旋菌屬等嗜鹽堿的菌屬在干奶牛舍土壤與斷奶犢牛舍土壤中的豐度較高;不動(dòng)桿菌屬與鞘脂桿菌屬等致病菌在高產(chǎn)泌乳牛舍土壤中的豐度較高。

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