龔偉杰，劉 洪，黃 萍，王 慧，周 倩

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院,植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

番茄匍柄霉()是一類世界性分布的重要植物病原物，可引起多種蔬菜病害，降低蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)，給菜農(nóng)造成巨大經(jīng)濟損失。為深入研究番茄匍柄霉的致病機制與功能基因組學(xué)，需建立高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化是最常用的轉(zhuǎn)化方法，其前提是制備大量可再生的原生質(zhì)體。目前很多病原真菌均已建立了成熟的PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化體系，包括稻瘟病菌、枯萎病菌、紋枯病菌、黑粉病菌、蘋果腐爛病菌等，但有關(guān)番茄匍柄霉的遺傳轉(zhuǎn)化體系仍未見報道。原生質(zhì)體是通過酶裂解細胞壁獲得的裸露細胞，僅含一層質(zhì)膜為隔絕外界的唯一屏障，對外界環(huán)境的變化極為敏感。原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化體系現(xiàn)已被廣泛用于生理、生化、遺傳、分子生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)研究。由于真菌的不同種屬甚至不同?；途觊g生物學(xué)特性的不同，其制備原生質(zhì)體的方法和條件也不盡相同，因此，篩選并優(yōu)化制備原生質(zhì)體的條件，建立番茄匍柄霉有效的原生質(zhì)體制備與再生體系對研究番茄匍柄霉致病機理和功能基因組學(xué)至關(guān)重要。本研究通過探討菌齡、酶種類與濃度、酶組合、酶解溫度與時間、滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體制備的影響，以及原生質(zhì)體在不同培養(yǎng)基中的再生率，建立了高效的番茄匍柄霉原生質(zhì)體制備和再生體系，為今后番茄匍柄霉的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

番茄匍柄霉菌株CS12由本實驗室分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，去離子水定容至1 L；不加瓊脂為液體培養(yǎng)基。TB3培養(yǎng)基：酪蛋白水解物3 g，酵母提取物3 g，蔗糖200 g，瓊脂15 g，去離子水定容至1 L；不加瓊脂為液體培養(yǎng)基。YEPG培養(yǎng)基：酵母提取物3 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，加水至1 L；YEPS培養(yǎng)基：酵母提取物3.5 g，蛋白胨5.0 g，蔗糖200.0 g，瓊脂粉15.0 g，加水至1 L。

1.1.3 試劑

裂解酶(Kitalase)、溶壁酶(lysing enzymes)、蝸牛酶(snailase)、崩潰酶(driselase)購自美國Sigma公司。STC溶液：含1.2 mol·L山梨醇、10 mmol·LpH值7.5的Tris-HCl、50 mmol·LCaCl。酶解液：用預(yù)冷的0.7mol·LNaCl溶液配制，輕微搖晃混勻，0.22 μm細菌過濾器過濾。

1.2 試驗方法

1.2.1 原生質(zhì)體的制備

將活化的CS12菌株接種于PDA中，于28 ℃、180 r·min搖床中培養(yǎng)，待長出菌絲后，用滅菌研缽研磨菌絲至不見明顯菌絲球，重新接種于新PDA中培養(yǎng)12～48 h，用滅菌紗布過濾，收集菌絲，用0.7 mol·LNaCl沖洗去除PDA，將菌絲置于5 mL酶解液中，28 ℃，80 r·min振蕩，每隔30 min鏡檢1次，酶解結(jié)束用無菌擦鏡紙過濾，穩(wěn)滲劑沖洗擦鏡紙15～20次，4 000×g離心濾液4～5 min，然后用移液槍吸去上清液，加入200 μL STC溶液重懸原生質(zhì)體，鏡檢。

1.2.2 穩(wěn)滲劑對原生質(zhì)體制備的影響

用0.7 mol·LMgSO、1.2 mol·LMgSO、0.7 mol·LNaCl和1.2 mol·LNaCl溶液分別作為穩(wěn)滲劑，分別配置酶解液，試驗設(shè)置3次重復(fù)，用血球計數(shù)板統(tǒng)計原生質(zhì)體數(shù)量。

1.2.3 酶對原生質(zhì)體制備的影響

采用上述試驗篩選的最佳穩(wěn)滲劑，選擇菌齡為12 h的幼嫩菌絲，28 ℃酶解3 h，Kitalase裂解酶、溶壁酶、蝸牛酶、崩潰酶均配置5、10、15、20、25 mg·mL，用于酶解制備原生質(zhì)體。試驗設(shè)置3次重復(fù)，用血球計數(shù)板測量原生質(zhì)體數(shù)量。

1.2.4 不同酶組合對原生質(zhì)體制備的影響

采用酶解效率最高的濃度進行組合，其中2種酶組合、3種酶組合、4種酶組合，共11種組合處理方式。穩(wěn)滲劑采用0.7 mol·L的NaCl，試驗設(shè)置3次重復(fù)，用血球計數(shù)板統(tǒng)計原生質(zhì)體數(shù)量。

1.2.5 菌齡對原生質(zhì)體制備的影響

采用酶解效率最佳組合對12、18、24、30、36、42、48 h菌齡的菌絲進行酶解，酶解時間為3 h，穩(wěn)滲劑采用0.7 mol·L的NaCl，試驗設(shè)置3次重復(fù)，用血球計數(shù)板統(tǒng)計原生質(zhì)體數(shù)量。

1.2.6 酶解溫度對原生質(zhì)體制備的影響

采用上述試驗中篩選的最佳條件分別在24、26、28、30、32 ℃進行酶解，酶解時間為3 h，穩(wěn)滲劑采用0.7 mol·L的NaCl，試驗設(shè)置3次重復(fù)，用血球計數(shù)板測量原生質(zhì)體數(shù)量。

1.2.7 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響

采用上述試驗中最佳條件，穩(wěn)滲劑采用0.7 mol·L的NaCl，分別酶解2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h。試驗設(shè)置3次重復(fù)，用血球計數(shù)板測量原生質(zhì)體數(shù)量。

1.2.8 不同培養(yǎng)基對原生質(zhì)體再生的影響

取100 μL原生質(zhì)體懸液輕輕涂布在PDA、YEPG、YEPS、TB3培養(yǎng)基上，試驗設(shè)置3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，記錄單菌落生長數(shù)量。顯微鏡下用血球計數(shù)板統(tǒng)計原生質(zhì)體懸液中的原生質(zhì)體數(shù)量()；菌落長出后統(tǒng)計平板菌落數(shù)()。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滲透壓緩沖液對原生質(zhì)體制備的影響

原生質(zhì)體對滲透壓較為敏感，濃度適宜的穩(wěn)滲劑有助于原生質(zhì)體的釋放，以及維持原生質(zhì)體狀態(tài)的穩(wěn)定，使其不易破裂。由圖1可知，NaCl效果比MgSO好，0.7 mol·LNaCl的效果更佳。因此，番茄匍柄霉原生質(zhì)體制備推薦采用0.7 mol·LNaCl作為穩(wěn)滲劑。

圖1 穩(wěn)滲劑對原生質(zhì)體制備的影響

2.2 酶對原生質(zhì)體制備的影響

由于不同真菌的細胞壁組成成分不同，酶的種類直接影響原生質(zhì)體的釋放效率。由圖2可知，不同酶組合的酶解效率差異較大，其中，Kitalase裂解酶在濃度為10 mg·mL時產(chǎn)量最高，原生質(zhì)體數(shù)量達8.72×10mL，其效率明顯高于其他3種酶；蝸牛酶的效率最低，原生質(zhì)體數(shù)量最高為0.52×10mL。

圖2 酶種類與濃度對原生質(zhì)體制備的影響

2.3 不同酶組合對原生質(zhì)體制備的影響

為了篩選最佳的酶組合，將單個酶的最佳濃度(Kitalase裂解酶10 mg·mL，溶壁酶10 mg·mL，崩潰酶25 mg·mL，蝸牛酶10 mg·mL)進行不同的組合試驗，觀察其釋放原生質(zhì)體的情況。結(jié)果如圖3所示，4種酶組合效果最佳，其原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高可達到9.25×10mL，但酶解效率與單獨使用10 mg·mLKitalase裂解酶(8.72×10mL)沒有顯著差異。

Kit，Kitalase裂解酶；Lys，溶壁酶；Dri，崩潰酶；Sna，蝸牛酶。

從節(jié)約成本的角度考慮，推薦制備番茄匍柄霉原生質(zhì)體采用10 mg·mLKitalase裂解酶。

2.4 菌齡對原生質(zhì)體制備的影響

菌絲的菌齡對原生質(zhì)體的制備影響很大，不同菌齡的菌絲細胞壁組成不同，對酶的敏感程度也不同，幼嫩菌絲的細胞壁易被酶解，但幼嫩菌絲產(chǎn)生的原生質(zhì)體往往不穩(wěn)定，容易破裂，因此需要摸索最佳菌齡。試驗結(jié)果表明，開始隨著菌齡的增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量不斷增加，當(dāng)菌齡到36 h時，原生質(zhì)體產(chǎn)量達到最高，此后原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著菌齡的增加逐漸下降(圖4)。因此，番茄匍柄霉制備原生質(zhì)體菌絲的最佳培養(yǎng)時間為36 h。

圖4 不同菌齡對原生質(zhì)體制備的影響

2.5 酶解溫度對原生質(zhì)體制備的影響

不同酶解溫度也能顯著影響原生質(zhì)體的制備，在其他條件相同的情況下，將酶解溫度分別設(shè)為24、26、28、30、32 ℃。試驗結(jié)果(圖5)表明，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著溫度的升高而增加，28 ℃時效果最佳，之后隨著溫度的升高原生質(zhì)體的產(chǎn)量逐漸降低。

圖5 不同酶解溫度對原生質(zhì)體制備的影響

2.6 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響

在其他條件一致的情況下，將酶解時間分別設(shè)為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h。原生質(zhì)體產(chǎn)量最初隨著酶解時間的延長而增加，酶解3.0 h后增長變緩，酶解3.5 h產(chǎn)量達到最高，之后隨著時間的延長，原生質(zhì)體的產(chǎn)量開始下降(圖6)。酶解時間過短，菌絲酶解不完全，原生質(zhì)體釋放不徹底，而酶解時間過長，原生質(zhì)體失去細胞壁保護后不穩(wěn)定，長時間暴露在酶解液中，酶解液中的雜質(zhì)蛋白酶對原生質(zhì)體膜造成損害而導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂。因此，番茄匍柄霉最佳的酶解時間為3.5 h。

圖6 不同酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響

2.7 培養(yǎng)基對原生質(zhì)體再生的影響

菌株CS12的原生質(zhì)體在顯微鏡下呈透明圓球狀(圖7)。取100 μL原生質(zhì)體分別涂布在PDA、YEPG、YEPS、TB3培養(yǎng)基上，均能生長出單菌落。通過菌落計數(shù)發(fā)現(xiàn)，利用YEPS培養(yǎng)基的原生質(zhì)體再生率可達10.80%，顯著高于其他類型培養(yǎng)基(圖8)。

圖7 番茄匍柄霉CS12的原生質(zhì)體形態(tài)

圖8 不同培養(yǎng)基上的原生質(zhì)體再生率

3 討論

原生質(zhì)體制備與再生體系的建立是進行分子遺傳學(xué)操作的基礎(chǔ)和前提，關(guān)于真菌原生質(zhì)體制備與再生的研究報道較多，但由于真菌種類繁多，其細胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，組成成分多樣，原生質(zhì)體制備條件不盡相同；因此，優(yōu)化原生質(zhì)體制備與再生條件尤為重要。在嘗試利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化研究番茄匍柄霉基因功能時，首先參照了王琪制備蔥葉匍柄霉原生質(zhì)體的條件，發(fā)現(xiàn)15 mg·mL溶壁酶、10 mg·mLLywallzyme裂解酶、10 mg·mL蝸牛酶和5 mg·mL纖維素酶(cellulase)組合，30 ℃酶解培養(yǎng)菌齡36 h的菌絲3.5 h，番茄匍柄霉原生質(zhì)體的釋放效率不高。說明同屬不同種的匍柄霉菌株之間，細胞壁成分存在較大差別，因此，需要探索適合番茄匍柄霉的酶解條件。Kitalase裂解酶對鏈格孢屬酶解效率顯著高于其他常規(guī)裂解酶，而匍柄霉屬和鏈格孢屬親緣關(guān)系較近。本試驗在摸索酶解條件時加入了Kitalase裂解酶，發(fā)現(xiàn)在單酶酶解試驗中，10 mg·mLKitalase裂解酶酶解效果最好，釋放的原生質(zhì)體數(shù)量最多，增加溶壁酶、蝸牛酶和崩潰酶不能顯著提高酶解效率；因此，推薦用10 mg·mLKitalase裂解酶酶解番茄匍柄霉制備原生質(zhì)體。Kitalase裂解酶最早報道來源于，是一種內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶。真菌細胞壁中廣泛存在葡聚糖，其中1，3-β-D-葡聚糖占真菌細胞壁成分50%以上，Kitalase裂解酶可催化1，3-β-D-葡聚糖水解。推測番茄匍柄霉細胞壁中1，3-β-D-葡聚糖含量高，因此Kitalase酶解效果好。

穩(wěn)滲劑可維持原生質(zhì)體細胞膜內(nèi)外滲透壓平衡，也會影響酶的活性。制備絲狀真菌原生質(zhì)體時，選擇的穩(wěn)滲劑一般為無機鹽類，如NaCl、MgSO等。酶解過程中釋放的原生質(zhì)體失去細胞壁的保護后容易破裂，而合適的穩(wěn)滲劑會對原生質(zhì)體產(chǎn)生保護作用，因此，穩(wěn)滲劑的選擇至關(guān)重要。本試驗對不同濃度的NaCl和MgSO進行篩選，最終發(fā)現(xiàn)0.7 mol·LNaCl溶液作為穩(wěn)滲劑時效果最好。

用于原生質(zhì)體再生的培養(yǎng)基種類很多，本試驗比較PDA、YEPG、YEPS、TB3培養(yǎng)基的再生效果，發(fā)現(xiàn)YEPS培養(yǎng)基再生效果最好，可能是因為YEPS培養(yǎng)基富含碳源、氮源，利于番茄匍柄霉的再生。

本研究通過單因素試驗優(yōu)化了菌齡、酶種類與濃度、酶組合、酶解溫度和時間、滲透壓穩(wěn)定劑，并比較了不同再生培養(yǎng)基的再生效率，成功建立了番茄匍柄霉的高效原生質(zhì)體制備與再生體系，為探索番茄匍柄霉基因功能提供了技術(shù)保障。

4 結(jié)論

本研究從菌齡、酶種類與濃度、酶組合、酶解溫度與時間、不同滲透壓穩(wěn)定劑等方面對番茄匍柄霉原生質(zhì)體制備條件進行優(yōu)化，明確原生質(zhì)體制備的最佳條件如下：菌齡為36 h，穩(wěn)滲劑為0.7 mol·LNaCl溶液，酶解液10 mg·mLKitalase裂解酶，28 ℃酶解3.5 h，制備原生質(zhì)體效果最佳；番茄匍柄霉原生質(zhì)體在YEPS培養(yǎng)基上再生效率最高。