王靜鴿，吉小鳳，吳 靜，楊 華，唐 標(biāo)，*，丁保安

(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

自2020年7月起，我國全面禁止向飼料中添加抗生素。在此之前，我國每年有數(shù)萬噸的抗生素在畜禽養(yǎng)殖中被當(dāng)作動物促生長劑使用。畜禽使用抗生素后，30%～90%的藥物會連同這些抗生素的初級代謝物一起隨糞、尿被排出動物體外。同時，在抗生素的選擇壓力下，細(xì)菌的耐藥性日益增強(qiáng)，導(dǎo)致動物疾病的預(yù)防和治療難度大幅提高，且嚴(yán)重影響食品安全和公共衛(wèi)生安全。目前，抗生素在畜禽養(yǎng)殖過程中的不合理使用已成為環(huán)境中抗生素污染的重要來源之一。

抗生素在畜禽飼養(yǎng)過程中的濫用，可破壞動物腸道菌群平衡，并導(dǎo)致機(jī)體耐藥性上升。王亞楠采集多省家禽市場的新鮮雞糞樣品進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)雞腸道微生物中90.7%以上是細(xì)菌，其中抗生素抗性基因(ARGs)分布廣泛，共檢測到235種耐藥基因型，且多黏菌素耐藥基因-1檢出率高達(dá)54.62%。這一結(jié)果與抗生素在家禽養(yǎng)殖中的濫用，以及家禽體內(nèi)的代謝機(jī)制密切相關(guān)。

磺胺類藥物(SAs)具有廣譜、高效、低成本等特點(diǎn)，已成為繼四環(huán)素類藥物之后歐盟最常用的獸用抗生素，常作為飼料添加劑用于預(yù)防和治療動物胃腸道疾病和呼吸道疾病。SAs的分子結(jié)構(gòu)中含有1個苯環(huán)、1個甲氧嘧啶磺酰胺基和1個對位氨基，在肉雞和蛋雞飼養(yǎng)中多通過口服方式給藥，是養(yǎng)殖廢水中最常見的抗生素之一。磺胺間甲氧嘧啶(SMM)是SAs中抗菌作用最強(qiáng)的藥物之一。研究表明，黃羽肉雞連續(xù)飼喂SMM(每1 kg飼料中添加50 mg)7 d，停藥30 d之后，體內(nèi)仍有藥物殘留。食用這些有SAs殘留的動物食品，可致人體發(fā)生過敏反應(yīng)，且具有致癌風(fēng)險。Willmann等報道，病人使用SAs進(jìn)行治療后，腸道微生物中與SAs有關(guān)的ARGs的相對豐度增加148.1%，且攜帶ARGs質(zhì)粒的豐度也顯著增加，說明SAs可促進(jìn)細(xì)菌耐藥性的傳播。目前，關(guān)于畜禽飼用SMM的研究多集中在藥動學(xué)和藥物殘留等方面，關(guān)于其對畜禽腸道菌群影響的研究尚不充足。為此，本試驗(yàn)在蛋雞飲用水中添加SMM，探究蛋雞糞便樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，以期揭示養(yǎng)殖過程中飼用SMM對蛋雞腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在杭州市余杭區(qū)某養(yǎng)殖場選取遺傳背景相近、日齡相同(32周)、體型均一(1.4～1.6 kg)的健康海蘭褐蛋雞260只，隨機(jī)將其分為2組，每組130只(13個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞)。A1組(對照組)，飲用水中不添加SMM；B1組(用藥組)，飲用水中添加SMM(配制濃度為530 mg·L)。所有蛋雞在試驗(yàn)期間自由采食飲水，飼喂5 d后每組每個重復(fù)隨機(jī)抽取一只蛋雞作為樣本，使用無菌棉簽在蛋雞泄殖腔采集新鮮糞便樣品。樣品采集后，B1組的飲用水中停止添加SMM，重新編號為B2組；A1組重新編號為A2組，作為B2組的對照組。兩組繼續(xù)飼養(yǎng)7 d后，從每組每個重復(fù)中隨機(jī)挑選一只蛋雞采集新鮮糞便。每次采集完新鮮糞便樣品后，在干冰保護(hù)下將糞便樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，并置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組總DNA提取

每份糞便樣品稱取180～220 mg，使用DNA提取試劑盒(QIAampFast DNA Stool Mini Kit)，按照說明書中的操作方法提取樣品基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的完整性，使用Nano Drop 2000分光光度計(jì)(美國Thermo)檢測所提DNA的濃度與純度。

1.2.2 16S rDNA擴(kuò)增與Illumina MiSeq測序

采用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次；72 ℃延伸5 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，對符合要求的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化?；厥债a(chǎn)物采用建庫試劑盒(TruSeqDNA Sample Prep Kit)進(jìn)行文庫構(gòu)建，利用Illumina Mi-Seq平臺(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)測序。

1.2.3 高通量測序數(shù)據(jù)分析

對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估，開展質(zhì)控，并過濾區(qū)分樣本，利用Mothur軟件計(jì)算樣品的操作分類單元(OTU)。使用美吉生物云線上平臺(www.majorbio.com)對測序結(jié)果進(jìn)行多樣性分析、菌群結(jié)構(gòu)分析和組間差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對采集的52份糞便樣品16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行高通量測序，結(jié)果顯示，共獲得有效序列1 952 306條，有效堿基數(shù)862 404 860 bp，單序列平均長度為441.75 bp。對糞便樣本中的菌群進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，結(jié)果共涉及22門75目，共1 726個OTU。

用OTU數(shù)量代表樣品中物種的豐度，由樣品OTU韋恩圖(圖1)可知，A1、B1、A2、B2組OTU的數(shù)量分別為1 419、1 463、1 327、1 401，各組獨(dú)有的OTU數(shù)分別為85、55、5和17。A1組與B1組共有和獨(dú)有(即僅被A1組和B1組共同占有，以下依次類推)的OTU數(shù)分別是1 220和105；B1與B2組、A2與B2組、A1與A2組共有的OTU數(shù)分別是1 239、1 247、1 128，獨(dú)有的OTU數(shù)分別是36、42和11。

圖1 樣品OTU韋恩圖

2.2 多樣性指數(shù)分析

在OTU水平進(jìn)行α多樣性指數(shù)分析(表1)，所有樣本的coverage指數(shù)均大于0.99，說明測序結(jié)果可信。B1組樣品的Ace指數(shù)低于A1組和B2組，而B2組樣品的Ace指數(shù)與A2組相近，說明SMM的使用降低了蛋雞糞便樣品中的菌群物種總數(shù)，但停止用藥后，蛋雞糞便中的菌群物種總數(shù)明顯增加，且基本恢復(fù)至對照水平。Simpson指數(shù)與菌群的多樣性負(fù)相關(guān)，B1組的Simpson指數(shù)高于A1組和B2組，說明SMM的使用降低了蛋雞糞便樣品中的菌群多樣性，停止用藥后，蛋雞糞便樣品中的菌群多樣性得到恢復(fù)。Sobs指數(shù)可反映物種豐富度，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，B1組的Sobs指數(shù)顯著(<0.05)低于A1、A2、B2組，但B2組的Sobs指數(shù)與A2組無顯著差異，說明SMM的使用降低了蛋雞糞便樣品中菌群的物種豐富度，停止用藥后，兩組蛋雞糞便樣品中菌群的物種豐富度接近，菌群多樣性得到恢復(fù)。

表1 多樣性分析統(tǒng)計(jì)

2.3 菌群結(jié)構(gòu)分析

在門水平上對樣本的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖2)，結(jié)果所示，在所有樣品中，優(yōu)勢菌群主要包括厚壁菌門(Firmicutes，59.59%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，20.99%)、變形菌門(Proteobacteria，6.81%)和梭桿菌門(Fusobacteria，4.36%)。與A1組相比，B1組樣本中的擬桿菌門、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)和熱袍菌門(Thermotogae)的相對豐度分別從25.26%、6.50%、1.45%降低至12.36%、1.05%、0.67，但厚壁菌門(60.44%)和變形菌門(12.15%)的相對豐度分別從52.77%、5.68%上升至60.44%、12.15%，梭桿菌門(6.81%)、軟壁菌門(Tenericutes，2.64%)和放線菌門(Actinobacteria，2.84%)的相對豐度也分別從2.82%、0.36%、2.61%上升至6.81%、2.64%、2.84%。整體來看，B1組蛋雞糞便樣品的物種多樣性下降，但厚壁菌門、變形菌門、梭桿菌門、軟壁菌門和放線菌門的相對豐度增加。停止用藥后，蛋雞糞便樣品中菌群的物種多樣性增加，與對照組差異減小，擬桿菌門的相對豐度上升11.75百分點(diǎn)至24.11%，與A2組(24.22%)接近，藍(lán)藻門的相對豐度上升0.24百分點(diǎn)至1.29%，但與A2組(2.54%)仍有差異。

圖2 不同樣品在門水平上的菌群組成Circos圖

分析不同樣品在屬水平上的菌群組成(圖3)，在所有樣品中，優(yōu)勢菌屬依次為乳桿菌屬(，24.11%)、擬桿菌屬(，9.80%)、腸球菌屬(，6.37%)和(5.53%)。與A1組相比，B1組樣品中的副擬桿菌屬()、普雷沃氏菌科_UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)、的相對豐度分別從1.11%、0.80%、1.23%下降至0.53%、0.17%、0.17%；停止用藥后，副擬桿菌屬、普雷沃氏菌科_UCG-001、的相對豐度有所上升，分別達(dá)到0.69%、0.79%、0.55%，但與A2組(0.81%、1.13%、1.12%)相比依然較低，表明還未得到完全恢復(fù)。由此可見，上述3個屬的菌群對SMM敏感，用藥后其相對豐度若要恢復(fù)至與對照組相同的水平，需要一定的時間。與A1組相比，B1組樣品中乳桿菌屬的相對豐度增加15.92百分點(diǎn)(A1組、B1組的相對豐度分別為15.06%、30.98%)，停止用藥后，B2組樣品中乳桿菌屬的相對豐度下降7.54百分點(diǎn)至23.44%，與A2組的水平(24.69%)相近。

圖3 不同樣品在屬水平上的菌群組成熱圖

在屬水平上對樣本進(jìn)行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)(圖4)，結(jié)果顯示：B1組和A1組的樣品結(jié)果分離，說明SMM的使用對蛋雞糞便樣品的菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響；B2組與B1組的樣品結(jié)果分離，說明停止用藥后，蛋雞糞便樣品的菌群結(jié)構(gòu)再次發(fā)生變化；A2組和B2組樣品的空間距離接近，表明停止用藥一段時間后，兩組蛋雞糞便樣品中的菌群結(jié)構(gòu)重新趨于一致。

圖4 樣品間屬水平上的菌群差異分析

在屬水平上對組間樣本的物種組成進(jìn)行分析(圖5)：B1組乳桿菌屬和不動桿菌屬()的豐度顯著(<0.05)高于A1組，而擬桿菌屬和理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)的豐度顯著(<0.05)低于A1組，扭鏈瘤胃球菌群([]__group)的豐度極顯著(<0.01)低于A1組。

圓點(diǎn)對應(yīng)的數(shù)值表示物種在兩組中平均相對豐度的差值，圓點(diǎn)顏色顯示為物種豐度占比較大的分組顏色，圓點(diǎn)上的I型區(qū)間為差值的上下限值，最右邊為P值。*，0.01

B1組與B2組相比：B2組和理研菌科RC9腸道群的豐度顯著(<0.05)高于B1組，unclassified_o_Bacteroidales、norank_f_Prevotellaceae的豐度極顯著(<0.01)高于B1組，而不動桿菌屬的豐度顯著(<0.05)低于B1組。這說明，停止用藥后，B2組蛋雞糞便中的微生物菌群結(jié)構(gòu)會發(fā)生很大變化，尤以norank_f Prevotellaceae的變化最為明顯。停止用藥后，除不動桿菌屬的豐度顯著下降外，其他4個屬的豐度皆顯著上升。其中，不動桿菌屬正是SMM飼喂后豐度顯著上升的菌屬之一，而理研菌科RC9腸道群是SMM飼喂后豐度顯著降低的菌屬，說明蛋雞糞便菌群中對SMM敏感的菌屬，在停止用藥后明顯得到恢復(fù)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群參與了腸道和大腦之間的雙向交流，甚至扮演著“第二大腦”的角色，可導(dǎo)致阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病。健康的腸道菌群結(jié)構(gòu)在雞的整個生命周期中都起著重要的作用。動物腸道微生物處于動態(tài)平衡中，菌群種類及其在腸道中的分布與機(jī)體的健康密切相關(guān)。

本研究對蛋雞糞便樣品中的微生物群落組成進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，樣品中的優(yōu)勢菌群在門水平上依次是厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，在屬水平上依次為乳桿菌屬、擬桿菌屬和腸球菌屬。這與周妍等報道的不同生長階段無特定病原體雞糞便菌群中厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門相對豐度占整體豐度95%以上，以及乳桿菌屬、擬桿菌屬和腸球菌屬為優(yōu)勢菌屬的研究結(jié)果相似；與Schreuder等發(fā)現(xiàn)的蛋雞糞便中優(yōu)勢菌門是厚壁菌門和擬桿菌門的結(jié)果一致。譚諾研發(fā)現(xiàn)，對1日齡嶺南黃雞連續(xù)飼喂硫酸新霉素(50 mg·kg)42 d后，腸道乳桿菌屬占比49.46%，比未飼喂抗生素組顯著增加。這與本試驗(yàn)飼喂SMM后乳桿菌屬菌群豐度增加的結(jié)果一致，但比例上有一定的差異，可能與雞的品種、年齡、生長環(huán)境、飼料組成，以及飼喂抗生素的種類、含量和時間有關(guān)。乳桿菌屬菌株可以產(chǎn)生乳酸，降低腸道pH值，從而影響其他細(xì)菌菌群的生長。本試驗(yàn)中，添加SMM后，蛋雞糞便中菌群的物種豐度顯著下降，可能與乳桿菌屬細(xì)菌的豐度增加有關(guān)。

向蛋雞飲用水中添加SMM后，蛋雞糞便樣品中的菌群豐度顯著下降，與Willmann等報道的磺胺類抗生素導(dǎo)致腸道菌群多樣性顯著降低的結(jié)果相似，與Hill等使用氨芐西林、慶大霉素、甲硝唑、新霉素和萬古霉素等抗生素藥物導(dǎo)致大腸中細(xì)菌數(shù)量減少10%的報道一致，說明不同種類的抗生素均可使腸道菌群的豐度下降，但對各個菌屬的具體影響程度不同。本研究中，使用SMM后蛋雞糞便樣本中的物種豐度和多樣性下降，其中，擬桿菌門的豐度降低明顯。除抗生素種類外，杜海洋等報道，同一種抗生素的使用時間不同也會造成鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的明顯差異。

停止飼喂SMM后，B2組菌群的豐度上升，與對照組(A2組)趨于一致，但菌群結(jié)構(gòu)仍有差異。朱姍姍研究發(fā)現(xiàn)，飼喂恩諾沙星、地克珠利可以改變30日齡京紅雞的腸道菌群組成，停藥后，腸道菌群向正常菌群組成恢復(fù)，并在這一趨勢中形成新的菌群結(jié)構(gòu)。朱燕娜等報道，抗生素使用后7 d，受抑制的菌群豐度逐漸升高，可能是這些菌群中部分對抗生素較為敏感的菌株被抑制或殺死后，沒有被抑制的不敏感菌株快速繁殖引起的。本試驗(yàn)在停止用藥后，蛋雞糞便樣本中菌群的物種多樣性和豐度增加，可能是敏感菌群逐漸恢復(fù)，連同耐藥菌株快速繁殖共同作用的結(jié)果。本研究中，使用SMM后，蛋雞糞便樣品中的不動桿菌屬豐度顯著升高。不動桿菌作為條件致病的非發(fā)酵菌，是引起感染的重要機(jī)會致病菌之一，具有快速獲得抗生素抗性的能力。Ubeda等發(fā)現(xiàn)，停止萬古霉素干預(yù)2周后，小鼠腸道腸球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬()和腸桿菌屬()等條件致病菌的含量升高。Tanaka等報道，口服廣譜抗生素頭孢氨芐后，腸球菌屬和腸桿菌屬的豐度增加。Zhang等發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期小鼠口服SMM后，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑和-甲基--天冬氨酸受體2B(NR2B)基因表達(dá)受到影響，神經(jīng)內(nèi)分泌功能被擾亂，幼崽表現(xiàn)焦慮、脂肪累積和認(rèn)知障礙等不良現(xiàn)象。綜上所述，不同種類抗生素對不同動物的腸道菌群結(jié)構(gòu)均會產(chǎn)生影響，并會增加腸道病原菌的含量。腸道病原菌的含量上升，破壞了動物腸道正常的菌群結(jié)構(gòu)，影響機(jī)體消化代謝，致其生產(chǎn)性能下降，甚至產(chǎn)生疾病。腸道菌群復(fù)雜多樣，在宿主的生長、代謝和免疫中起著重要作用；因此，在動物養(yǎng)殖過程中，應(yīng)減少抗生素的干預(yù)。本研究發(fā)現(xiàn)，SMM可以降低雞腸道菌群的豐富性和多樣性，增加致病菌的豐度，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

綜上，本試驗(yàn)利用16S rDNA擴(kuò)增子高通量測序發(fā)現(xiàn)，SMM可以通過增加乳桿菌屬和不動桿菌屬的豐度改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，降低蛋雞糞便中的細(xì)菌菌群多樣性和物種豐度；停止使用SMM一周后，糞便樣品菌群的物種多樣性和豐度得到恢復(fù)。研究結(jié)果可為臨床使用SMM，及確定停藥時間等提供參考。