孫玥，吳華星，王榮春，段雪梅，李琳，趙廣生，馬鶯，李啟明

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工與化學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150090；2.新希望乳業(yè)股份有限公司，成都 610063；3.乳品營養(yǎng)與功能四川省重點實驗室，成都 610000；4.杭州新希望雙峰乳業(yè)有限公司，杭州 310000）

0 引言

超高溫瞬時殺菌（ultra-high temperature，UHT）是牛乳在135～150℃下加熱3～5 s，然后無菌包裝于微量透氣的容器中，生產(chǎn)出來的產(chǎn)品稱UHT乳[1]。UHT可殺死細(xì)菌、體細(xì)胞、酶、多數(shù)芽孢，但不能殺死全部的耐熱芽孢菌。UHT乳在室溫下的保質(zhì)期是6個月[2]。耐熱性內(nèi)源酶和耐熱芽孢產(chǎn)生的酶，微生物及體細(xì)胞自溶所釋放的胞內(nèi)酶在UHT乳貯藏期間保持活性嚴(yán)重地影響了UHT乳的質(zhì)量[2]。離心除菌技術(shù)（bactofugation）是通過超速離心除去原料乳中所有的體細(xì)胞和90%以上的細(xì)菌，降低原料乳的微生物和體細(xì)胞來改善UHT乳的質(zhì)量[3]。

在同一乳品廠按照相同的工藝生產(chǎn)常規(guī)UHT乳（N-UHT）和離心預(yù)除菌UHT乳（C-UHT），研究熱處理和貯藏期N-UHT乳和C-UHT乳的蛋白質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)的變化，探討離心預(yù)除菌工藝對改善UHT乳貯藏期質(zhì)量品質(zhì)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

牛乳來源于新希望自有牧場，原乳細(xì)菌總數(shù)小于2×105cfu/mL，體細(xì)胞小于5×105個。K9840凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；L8800全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；LC-16高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

1.2 方法

在同一乳品廠按照相同的工藝分別生產(chǎn)了兩批常 規(guī)UHT（N-UHT）乳 和 離 心 除 菌UHT乳（CUHT），每一批的原料乳相同。N-UHT乳殺菌工業(yè)參數(shù)為135℃/4 s；C-UHT工藝參數(shù)為：55～60℃原料乳在7 200 g下離心，回流速率為300～400 kg/h，經(jīng)檢測可去除所有的體細(xì)胞和91%的細(xì)菌，離心后的原料乳經(jīng)過135℃/4 s殺菌。UHT乳在常溫下貯藏6個月，每間隔1個月取樣。參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T5009.5-2016）凱氏定氮法測定樣品的總蛋白（TN）質(zhì)量濃度；參照IDF020-4-2001測定非蛋白氮（NPN）質(zhì)量濃度。參照IDF20B：1993凱氏定氮法，采用醋酸沉淀樣品中的酪蛋白，測定非酪蛋白（NCN）質(zhì)量濃度。乳中每種蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度在測得的NPN和NCN最終乘上系數(shù)6.38，根據(jù)乳清蛋白氮（WPN）=NCN-NPN；酪蛋白氮（CN-N）=TN-NCN計算氮質(zhì)量濃度。采用反向高效液相色譜法測定樣品中αs1-酪蛋白（αs1-CN）、β-酪蛋白（β-CN）、κ-酪蛋白（κ-CN）、α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg）質(zhì)量濃度[4]。采用氨基酸分析儀測定乳樣品中游離氨基酸組成和質(zhì)量濃度[5]。

2 結(jié)果與討論

2.1 熱處理和貯藏過程中氮分布的變化

乳中蛋白是由真蛋白和非蛋白氮（NPN）構(gòu)成，真蛋白是由酪蛋白和乳清蛋白組成，NPN主要是由游離氨基酸、短肽、尿素、肌酐、生物胺等含氮化合物組成[6]。NPN是牛乳代謝產(chǎn)生的，占總氮的約5%，熱處理、貯藏等環(huán)境因素的改變，乳蛋白氧化、分解能夠產(chǎn)生一些游離氨基酸和含氮的小分子化合物，體現(xiàn)在NPN的增加和真蛋白的減少。普通的UHT乳（NUHT）和原料乳離心除菌后的UHT乳（C-UHT）在熱處理前后（D0）及貯藏期（M1-M6）內(nèi)酪蛋白氮（CNN）、乳清蛋白氮（WP-N）和非蛋白氮（NPN）之間的比例發(fā)生了改變，如圖1所示。

圖1 兩種UHT乳熱處理和貯藏過程中氮分布

加熱和貯藏過程中發(fā)生了乳蛋白的變性和分解，NPN增加，但是總氮（TN）不會變化。與原乳（RM）比較，熱處理后N-UHT-D0中WP-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)由28.1%減少到21.5%，NPN由4.2%增加到5.3%，CNN由67.8%增加到73.3%；C-UHT-D0中WP-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)由28.1%減少到22.8%，NPN由4.2%增加到4.6%，CN-N由67.8%增加到72.7%。乳清蛋白是具有4級結(jié)構(gòu)的球狀蛋白，熱處理破壞其結(jié)構(gòu)，分子展開，游離巰基暴露出來，通過分子間或分子內(nèi)二硫鍵相互作用形成凝聚物，進(jìn)入膠束相[7]。β-Lg和α-La是乳清蛋白的主要成分，變性β-Lg和α-La與膠束表面的κ-CN通過分子間二硫鍵作用形成乳清蛋白/κ-CN復(fù)合物聚集到酪蛋白膠束表面[8]。熱誘導(dǎo)的蛋白降解以及美拉德反應(yīng)和脫酰胺作用的發(fā)生，產(chǎn)生了游離氨基酸、肽、以及一些蛋白降解產(chǎn)物，這些產(chǎn)物以非蛋白氮形式存在[9]。因此，WP-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，NPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。

N-UHT乳和C-UHT乳在貯藏過程中CN-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不顯著，兩者之間差異不顯著（P＜0.05）。隨著貯藏時間的增加WP-N質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低，NUHT中WP-N由N-UHT-D0的21.5%降低到17.6%（N-UHT-M6），C-UHT的WP-N由CUHT-D0的22.8%降低到17.2%（C-UHT-M6），兩者之間的變化差異不顯著；NPN隨著貯藏時間的增加而顯著增加，從N-UHT-D0的5.3%增加到N-UHTM6的8.7%，C-UHT的NPN從C-UHT-D0的4.6%增加到7.9%（C-UHT-M6），如圖1所示。結(jié)果表明，在貯藏過程中NPN的增加主要與WP-N有關(guān)。熱誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化及蛋白質(zhì)之間的相互作用在貯藏過程中持續(xù)發(fā)生，蛋白水解、蛋白的氧化降解、美拉德反應(yīng)等是引起貯藏期間蛋白質(zhì)量濃度改變的主要原因[10]。原料乳中嗜冷菌分泌的耐熱性蛋白酶和內(nèi)源性纖溶蛋白酶在UHT貯藏過程中持續(xù)水解蛋白，造成UHT乳苦味和凝膠形成已經(jīng)被大量研究所證實[2,11]。C-UHT乳由于原料經(jīng)過預(yù)除菌處理，源于原料中嗜冷菌產(chǎn)生的蛋白酶的量低于N-UHT乳，所以其貯藏過程中NPN增加的程度低于N-UHT乳。非酶脫酰胺是將蛋白質(zhì)的天冬酰胺和谷氨酰胺殘基中的酰胺基水解為天冬氨酸和谷氨酸以及氨水，UHT熱處理引起的非酶脫酰胺程度較小，但在貯藏過程中能夠發(fā)生明顯的脫酰胺作用[12]，并且是隨著貯藏時間的延長而增加[13]。UHT殺菌強度引發(fā)美拉德反應(yīng)，貯藏過程中美拉德反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行生成糠氨酸及褐色色素[14]，體現(xiàn)在UHT長期貯藏顏色變褐色。蛋白水解產(chǎn)物在乳中最直觀的體現(xiàn)是NPN的增加。

2.2 熱處理和貯藏過程中乳蛋白在膠束相和乳清相的分布

天然乳中酪蛋白（αs1-CN、αs2-CN、β-CN、κ-CN）是以膠束形式存在于膠體相中，乳清蛋白（α-La、β-Lg、BSA）以可溶性形式存在于乳清相中，熱處理導(dǎo)致乳清蛋白變性，變性乳清蛋白與膠束表面的κ-CN結(jié)合形成乳清蛋白/κ-CN復(fù)合物進(jìn)入膠束相，復(fù)合物的形成降低了酪蛋白膠束的穩(wěn)定性，部分酪蛋白解聚進(jìn)入乳清相[15]；貯藏過程中這種聚合/解聚作用持續(xù)發(fā)生[16]。天然（RM）牛乳中，αs-CN、β-CN、κ-CN全部分布在膠束相，如圖2(a)所示，α-La、β-Lg、BSA主要分布在乳清相中，如圖2(b)所示。熱處理后N-UHTD0和C-UHT-D0乳其膠束相中的κ-CN由4.61 g/L分別降低到2.54 g/L和2.31 g/L，αs-CN由17.48 g/L分別降低到16.93 g/L和17.31 g/L，β-CN由12.12 g/L分別降低到9.40 g/L和8.75 g/L，少量的α-La和β-Lg進(jìn)入膠束相如圖2(a)所示；N-UHT和C-UHT乳其乳清相中的α-La由2.48 g/L分別降低到2.07 g/L和2.10 g/L，β-Lg由5.56 g/L分別降低到4.57 g/L和4.45 g/L，較高質(zhì)量濃度的αs-CN、β-CN、κ-CN進(jìn)入乳清相，乳清相中蛋白濃度顯著增加，如圖2(b)所示。隨著貯藏時間的增加，αs-CN、β-CN、κ-CN在膠束相的分布量降低，在乳清相的分布量增加，乳清蛋白在乳清相和膠束相的分布量變化不顯著；貯藏6個月后，N-UHTM6和C-UHT-M6其膠束相中的κ-CN質(zhì)量濃度分別降低到2.92 g/L和2.57 g/L，αs-CN質(zhì)量濃度分別降低到10.77 g/L和11.94 g/L，β-CN質(zhì)量濃度分別降低到4.59 g/L和5.39 g/L，如圖2(a)所示；NUHT-M6和C-UHT-M6其乳清相中的κ-CN質(zhì)量濃度分別增加到1.10 g/L和1.37 g/L，αs-CN質(zhì)量濃度分別增加到3.76 g/L和3.65 g/L，β-CN質(zhì)量濃度分別增加到1.28 g/L和1.54 g/L如圖2(b)所示。α-La和β-Lg在乳清相分布量減少，膠束相分布量增加，但是變化幅度顯著低于酪蛋白。綜合分析，貯藏過程中NUHT乳的變化程度顯著高于C-UHT乳。

圖2 熱處理和貯藏期乳蛋白組分在膠束相和乳清相中分布

酪蛋白膠束中心部分是磷酸鈣，內(nèi)部的酪蛋白被纏繞在一起形成一種微團(tuán)簇的無定型狀態(tài)，也就是無規(guī)則卷曲狀態(tài)[17]。αs1-CN和αs2-CN是天然展開的蛋白質(zhì)，具有擴展的卷曲構(gòu)象，而β-CN和κ-CN具有熔融球蛋白狀態(tài)的性質(zhì)，具有結(jié)構(gòu)致密、水化程度高、側(cè)鏈柔性的特點，因缺乏固定的三維立體構(gòu)象，對環(huán)境變化反應(yīng)非常迅速[18]。當(dāng)乳的溫度升高至80℃時，酪蛋白組分均發(fā)生解離，其中熱誘導(dǎo)的κ-CN從膠束相解聚量最大，αs-CN解聚最低[19]。κ-CN缺少磷酸絲氨酸殘基，并且其親水性C-末端的糖基化阻止了與其他蛋白質(zhì)的強靜電相互作用可能性[20]。κ-CN的N端區(qū)域疏水鍵連接到酪蛋白膠束并覆蓋膠束表面，當(dāng)酪蛋白解離后，覆蓋在酪蛋白膠束表面的κ-CN會進(jìn)一步與變性的乳清蛋白之間發(fā)生反應(yīng)，同時αs-CN和β-CN從酪蛋白膠束上解聚下來的過程受到抑制[21]。κ-CN的解離隨著溫度的升高上呈線性增加，導(dǎo)致其在膠束相的解離逐漸增多[22]。酪蛋白的解離或者水解以及乳清蛋白與膠束表面酪蛋白結(jié)合，引起酪蛋白和乳清蛋白相分配行為的改變，這些變化與蛋白質(zhì)交聯(lián)、蛋白質(zhì)分子共價和非共價相互作用、美拉德反應(yīng)、蛋白質(zhì)水解、去磷酸化等化學(xué)反應(yīng)引起的蛋白質(zhì)疏水性改變有關(guān)[16,23]。酪蛋白持續(xù)從膠束相解聚進(jìn)入乳清相，增加了膠束聚集的可能性[24-25]。這些因素造成UHT乳的貯藏不穩(wěn)定性。因此，UHT乳在貯藏期間均發(fā)生了酪蛋白從膠束相解聚進(jìn)入乳清相，乳清蛋白與酪蛋白聚合從乳清相進(jìn)入了膠束相，這種變化與貯藏期間蛋白質(zhì)的和水解和貯藏時間呈正相關(guān)。

2.3 熱處理和貯藏對UHT乳中游離氨基酸的影響

熱處理能使N-UHT中游離氨基酸質(zhì)量濃度由原乳的31.4 mg/L增加到35.1 mg/L，C-UHT由原乳的31.4 mg/L增加35.7 mg/L，兩者差異不顯著；貯藏過程中數(shù)據(jù)波動較大，但總量變化不顯著；C-UHT中游離氨基酸質(zhì)量濃度略低于N-UHT如圖3(c)所示。

在貯藏過程中游離氨基酸質(zhì)量濃度變化不顯著（P＜0.05），說明貯藏過程沒有發(fā)生顯著的蛋白質(zhì)水解。貯藏過程中乳蛋白水解主要與乳中耐熱性內(nèi)原酶纖溶蛋白酶和細(xì)菌蛋白酶的活力有關(guān)，隨著貯藏時間的增加，UHT乳中纖溶蛋白酶的活力逐漸增加[26]，但是游離氨基酸質(zhì)量濃度并沒有顯著增加。因為，纖溶蛋白酶和細(xì)菌蛋白酶并不能將乳蛋白直接水解成氨基酸，纖溶蛋白酶主要水解酪蛋白，釋放出疏水性肽，導(dǎo)致乳蛋白發(fā)生凝聚作用；細(xì)菌蛋白酶主要水解κ-CN，類似于凝乳酶的作用，導(dǎo)致乳蛋白形成凝膠[10]。加熱導(dǎo)致的游離氨基酸質(zhì)量濃度增加與熱誘導(dǎo)的乳蛋白氧化有關(guān)，如美拉德反應(yīng)的Strecker降解過程形成游離態(tài)氨基酸[10]。

木其爾等人研究證明UHT處理使乳中游離氨基酸質(zhì)量濃度降低了1.9%[27]，與本研究得到的結(jié)論相反。可能與原乳的差異及分析方法有關(guān)，乳中游離氨基酸質(zhì)量濃度較低，分析結(jié)果的相對誤差也較大。在18種氨基酸中只有賴氨酸（Lys）隨著貯藏時間的增加其質(zhì)量濃度顯著降低如圖3(b)所示。貯藏過程中賴氨酸質(zhì)量濃度的減少與美拉德反應(yīng)有關(guān)。熱誘導(dǎo)的美拉德反應(yīng)使氨基酸等小分子營養(yǎng)物質(zhì)的損失，隨貯藏時間的延長，乳中蛋白質(zhì)與乳糖會持續(xù)緩慢地發(fā)生美拉德反應(yīng)[28]。美拉德反應(yīng)是還原性羰基糖（主要是乳糖）與蛋白中的賴氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)，尤其是酪蛋白中的賴氨酸殘基，乳糖也與精氨酸，蛋氨酸，色氨酸和組氨酸反應(yīng)，但以與賴氨酸的反應(yīng)為主。乳糖與賴氨酸殘基的ε-氨基反應(yīng)形成席夫堿（乳糖基賴氨酸），熱處理強度越大，乳糖和賴氨酸ε-氨基的結(jié)合越強烈，造成了賴氨酸的損失[29]。

圖3 UHT乳貯藏期間游離氨基酸質(zhì)量濃度變化

2.4 熱處理和貯藏過程中乳蛋白的降解

乳蛋白主要成分有αs1-CN、αs2-CN、β-CN、κ-CN、β-Lg、α-La、BSA，天然牛乳中這幾種蛋白的比例和質(zhì)量濃度基本上是固定的。熱處理和貯藏過程乳蛋白發(fā)生了氧化、水解、降解等作用，乳蛋白組成的質(zhì)量濃度發(fā)生了改變，影響了乳膠體的穩(wěn)定性和牛乳的營養(yǎng)性。熱處理導(dǎo)致所有的乳蛋白成分發(fā)生了降解，熱處理后N-UHT和C-UHT中κ-CN質(zhì)量濃度由原乳的4.61 g/L分別減少到4.45 g/L和4.27 g/L，αs1-CN質(zhì)量濃度由17.48 g/L分別減少到16.93 g/L和17.31 g/L，β-CN質(zhì)量濃度由12.12 g/L分別減少到10.98 g/L和10.51 g/L，α-La質(zhì)量濃度由1.68 g/L分別減少到1.61 g/L和1.61 g/L，β-Lg質(zhì)量濃度由3.92 g/L分別減少到3.74 g/L和3.64 g/L，如圖4(a)所示。隨著貯藏時間的增加，C-UHT和N-UHT中乳蛋白質(zhì)量濃度逐漸降低，在貯藏2個月內(nèi)，C-UHT和N-UHT之間變化不顯著，貯藏時間超過2個月后，N-UHT中各種乳蛋白組分的降解程度顯著高于C-UHT（P＜0.05）。貯藏6個月后，N-UHT中總蛋白質(zhì)量濃度由N-UHT-D0的37.71 g/L減少到N-UHT-6m的29.57 g/L；C-UHT中總蛋白質(zhì)量濃度由C-UHTD0的37.34 g/L減少到C-UHT-6m的31.42 g/L，如圖4(b)所示。

圖4 熱處理和貯藏過程中乳蛋白質(zhì)量濃度變化

熱誘導(dǎo)非酶脫酰胺反應(yīng)、美拉德反應(yīng)是引起乳蛋白降解的主要原因[9]，貯藏過程中持續(xù)發(fā)生的蛋白氧化和蛋白水解加劇了乳蛋白的降解[10]。細(xì)菌蛋白酶優(yōu)先水解酪蛋白，順序為：κ-CN＞β-CN＞αs-CN[10]；纖溶蛋白酶作為主要的內(nèi)源性酶，其不水解乳清蛋白，其首選的底物是β-CN，對αs1-CN和αs2-CN也能水解，但對κ-CN有抑制作用[10]。蛋白水解釋放的疏水性肽段參與了老化凝膠和苦味形成，造成UHT乳貯藏過程物理穩(wěn)定性下降[30]。微生物源的蛋白酶和源于體細(xì)胞自溶所釋放的酶會加劇UHT乳貯藏期內(nèi)蛋白水解，體細(xì)胞中含有纖溶蛋白酶原激活劑，可增強非活性纖溶蛋白酶原向纖溶蛋白酶的轉(zhuǎn)化，提高纖溶蛋白酶活力[31]。CUHT乳是原料乳采用離心除菌技術(shù)，有效地除去了原料乳中微生物與體細(xì)胞，所以在貯藏期C-UHT中蛋白水解程度低于N-UHT，體現(xiàn)在C-UHT中蛋白降解程度低于NUHT，能夠在貯藏期內(nèi)較好地保持乳蛋白營養(yǎng)價值。

3 結(jié) 論

熱處理貯藏過程中酪蛋白質(zhì)量濃度變化不顯著，乳清蛋白質(zhì)量濃度逐漸降低，NPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加；貯藏6個月后，N-UHT和C-UHT的NPN從4.2%分別增加到8.7%和7.9%。熱處理后酪蛋白解聚進(jìn)入了乳清相，貯藏過程中酪蛋白繼續(xù)從膠束上解聚；貯藏6個月后，N-UHT和C-UHT中酪蛋白在膠束相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由100%分別降低到53.4%和58.2%；N-UHT和C-UHT中乳清蛋白在乳清相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由95.5%分別降低到56.6%和54.8%，乳清蛋白的降解率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于酪蛋白。熱處理導(dǎo)致所有的乳蛋白組分發(fā)生了降解，貯藏過程中乳蛋白繼續(xù)降解，貯藏6個月后，N-UHT和C-UHT中總蛋白質(zhì)量濃度由39.81 g/L分別降解到29.57 g/L和31.42 g/L；熱處理使游離氨基酸總量由原乳的31.4 mg/L增加到35.1～35.7 mg/L，貯藏過程中游離氨基酸總量變化不顯著。C-UHT乳的乳蛋白降解和乳蛋白相轉(zhuǎn)移程度顯著低于NUHT乳，因此，離心預(yù)除菌工藝通過改善原料乳的質(zhì)量可以顯著地改善UHT乳貯藏期內(nèi)乳蛋白的質(zhì)量，對保證貯藏期內(nèi)UHT乳的品質(zhì)和質(zhì)量具有重要的作用。