蘇秀敏,張艷,陳佳,陳進(jìn),秦明倩,甘辛,李鳳琴,楊保偉

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.富平縣檢驗檢測中心（陜西省羊乳產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心），陜西富平 711700；3.石家莊學(xué)院化工學(xué)院，石家莊 050035；4.國家食品安全風(fēng)險評估中心，北京 100022）

0 引言

克羅諾桿菌（Cronobacter，原稱阪崎腸桿菌），是一種革蘭氏陰性無芽孢桿菌，廣泛分布于自然界，存在于淡水、土壤、污水、蔬菜、動物和人類的糞便中?？肆_諾桿菌為食源性條件致病菌，對大多數(shù)人而言不致病，但對于特殊人群、尤其是早產(chǎn)嬰兒和免疫力低下的嬰幼兒危害極大，往往導(dǎo)致新生兒腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和菌血癥，并可引起嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，甚至死亡[1]。研究表明，嬰幼兒配方乳粉是克羅諾桿菌感染嬰幼兒的主要源頭[2]。

克羅諾桿菌抗干燥能力極強，室溫下，在被污染的乳粉中存在兩年半以上依然保持活性[3]，不僅流行于嬰幼兒乳粉、甜點等食品之中，也存在于食品加工廠以及家庭環(huán)境[4-7]。在我國，已有在臨床、食品、學(xué)生宿舍和食堂環(huán)境中檢出克羅諾桿菌的報道[8]。自1961年由克羅諾桿菌引起的腦膜炎病例被首次報道后，在我國安徽阜陽引起“大頭娃娃”事件的劣質(zhì)嬰幼兒配方乳粉以及相關(guān)衛(wèi)生檢疫樣品中陸續(xù)檢出了該菌，并推測其主要來源于環(huán)境[9-11]。2012-2014年間，重慶、溫州、上海和四川等地也相繼報道了克羅諾桿菌污染引起的病例，對源于四川的菌株采用脈沖場凝膠電泳（Pulse field gel electrophoresis，PFGE）溯源分析后，表明污染來源于奶粉沖調(diào)環(huán)境[12-15]。因此，對克羅諾桿菌污染的全方位預(yù)防與監(jiān)控尤為重要。

本研究基于陜西省兩家嬰幼兒配方粉生產(chǎn)企業(yè)，結(jié)合其生產(chǎn)工藝，采集其嬰配粉生產(chǎn)所用原材料到成品的所有樣品及生產(chǎn)環(huán)境樣品，參考國標(biāo)GB 478940-2016對其中的克羅諾桿菌進(jìn)行分離，對分離株進(jìn)行鑒定和分型，以期追溯出克羅諾桿菌對生產(chǎn)造成污染的關(guān)鍵點，為制定有的放矢、切實有效的克羅諾桿菌污染防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

針對企業(yè)生產(chǎn)中遇到的克羅諾桿菌污染問題，2016年7月起至2017年6月，對陜西省兩個嬰幼兒配方乳粉加工廠（分別命名為YT和SF）從原料到成品及其生產(chǎn)環(huán)境每月采樣一次，共計1 246份，進(jìn)行克羅諾桿菌污染追溯。其中YT廠采樣1 051份，SF廠采樣195份。樣品分為平皿沉降樣（P）、涂抹樣（T）、粉末樣（F）、液態(tài)樣（Y）4種類型。采樣對象主要為配方粉加工用原輔料（包括：原料羊乳、濃縮乳、低聚果糖等），成品粉，車間環(huán)境（包括：潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)門把手、內(nèi)包人員鞋底、凈化系統(tǒng)與潔凈車間、排風(fēng)口等），加工車間設(shè)備（包括：流化床、成品傳送帶、混料罐罐體等）以及工廠周邊土壤等。樣品按照廠家+樣品類型+采樣地+平行號進(jìn)行編號（例：YTF01-1）。

1.1.2 主要儀器與試劑

高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；培養(yǎng)箱，北京科偉實驗儀器有限公司；基因擴(kuò)增儀，美國Bio-Rad公司；電泳儀，美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；-80℃超低溫冰箱，日本三洋公司。

緩沖蛋白胨水（BPW）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基等購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Maker、PCR buffer均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。

1.2 克羅諾桿菌分離鑒定

克羅諾桿菌分離參考GB 478940-2016《食品微生物學(xué)檢驗克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗》進(jìn)行。稱取檢樣100 g（mL）加入到900 mL BPW增菌液中，36 °C培養(yǎng)18 h；吸取1 mL增菌液轉(zhuǎn)于10 mL mLST-Vm肉湯培養(yǎng)基，44 °C培養(yǎng)24 h；取增菌培養(yǎng)物1環(huán)，劃線接種于克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基平板；挑取1～5個藍(lán)綠色可疑單菌落，劃線接種于TSA平板，25 °C培養(yǎng)48 h；以棉簽涂抹，而后將菌體懸浮于LB-甘油（50%/50%）中，-80 °C保存，備用。

對于空氣沉降樣，將取樣用TSA瓊脂平板置于25 °C培養(yǎng)48 h，挑取1～5個黃色可疑菌落，分別將其劃線于克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)，將藍(lán)綠色菌落劃線于TSA平板培養(yǎng)，保存，待鑒定。

對于環(huán)境涂抹樣，涂抹后將棉拭子頭部用無菌剪刀剪斷，保存于裝有20 mL BPW的無菌離心管中。36℃培養(yǎng)18 h后，分別使用mLST-Vm肉湯、克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基和TSA分離得到疑似菌，保存、備用。

1.3 PCR鑒定

1.3.1 基因組DNA提取

用接種環(huán)蘸取保存于LB/甘油的疑似克羅諾桿菌，劃線接種于LB平板，37 °C過夜培養(yǎng)。挑取少量菌體，使其均勻分散于無菌蒸餾水中，100°C裂解10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.3.2 PCR擴(kuò)增用引物和條件

使用克羅諾桿菌特異性基因ompA擴(kuò)增引物ompA-F（5’-GGATTTAACCGTGAACTTTTCC-3’）和ompA-R（5’-CGCCAGCGATGTTAGAAGA-3’）擴(kuò)增ompA基因[16]，對疑似克羅諾桿菌進(jìn)行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物大小為469 bp。PCR擴(kuò)增ompA鑒定時以ATCC29544作為陽性對照。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳

吸取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度為1%。電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，記錄結(jié)果。

1.4 脈沖場凝膠電泳分型

按照美國疾病預(yù)防控制中心（the Center for Disease Control and Prevention，CDC）制定的克羅諾桿菌PFGE分型標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行[17]。制膠、酶切、電泳和染色處理后使用BioNumerics軟件對DNA酶切圖譜進(jìn)行處理及聚類分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用Minitab進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 克羅諾桿菌陽性樣品檢出情況

1 246份樣品中共檢出克羅諾桿菌陽性樣品14份，檢出率為1.12%，分離得到33株克羅諾桿菌。YT廠共檢出6份陽性樣品，分離得到20株克羅諾菌株；SF廠共檢出8份陽性樣品，分離得到13株克羅諾桿菌，如表1所示。

表1 克羅諾桿菌陽性樣品檢出情況

（續(xù)表1）

2.1.1 不同廠家克羅諾桿菌陽性樣品檢出情況

SF廠采集的樣品中克羅諾桿菌陽性樣品檢出率極顯著高于YT工廠（P＜0.01），見圖1。

圖1 不同廠家克羅諾桿菌陽性樣品檢出情況

2.1.2 不同來源樣品中克羅諾桿菌檢出情況

原輔料中克羅諾桿菌陽性樣品檢出率為1.03%，環(huán)境樣品中陽性樣品檢出率為1.14%，檢出率間無顯著性差異（P＞0.05），見表2。

表2 不同來源樣品中克羅諾桿菌檢出情況

原輔料中檢出的2份克羅諾桿菌陽性樣品均為乳糖粉，均來自YT工廠。12份陽性環(huán)境樣品中，7份為工廠邊土壤，3份來源于YT工廠，4份來源于SF工廠，見表3。在工作人員鞋底、后包車間、凈化系統(tǒng)進(jìn)風(fēng)口和車間陰溝環(huán)境中均檢出克羅諾桿菌陽性樣品。其中，工作人員鞋底（100.0%）克羅諾桿菌陽性樣品的檢出率顯著高于后包車間樣品（3.03%）?？肆_諾桿菌陽性土壤、后包車間、凈化系統(tǒng)進(jìn)風(fēng)口和車間陰溝樣品檢出率間無顯著性差異，如表2所示。結(jié)果表明，乳糖粉、乳粉生產(chǎn)內(nèi)外部環(huán)境中的克羅諾桿菌可能是導(dǎo)致該菌污染成品的重要原因之一。

表3 不同廠家來源樣品中克羅諾桿菌檢出情況

2.1.3 不同狀態(tài)樣品中克羅諾桿菌檢出情況

粉末樣和平皿沉降樣中克羅諾桿菌檢出率間存在顯著差異（P＜0.05），其他狀態(tài)樣品檢出率間無顯著差異，如圖2所示。液態(tài)樣中未檢出陽性樣品，粉末樣多為乳粉加工輔料，陽性樣品檢出率最高2.26%，表明乳粉生產(chǎn)過程中使用的粉末狀原輔料可能是導(dǎo)致克羅諾桿菌污染的重要原因之一。

圖2 不同狀態(tài)樣品中克羅諾桿菌檢出情況

2.1.4 不同采樣時間克羅諾桿菌檢出情況

2016到2017年間，4個季度克羅諾桿菌陽性樣品檢出率有差異，如表1所示。2016年第3季度陽性樣品檢出率最高（2.33%），第1季度和第2季度均無克羅諾桿菌陽性樣品檢出。第2季度和第3季度克羅諾桿菌檢出率有極顯著差異（P＜0.01），其他季度間樣品檢出率無顯著差異，如圖3所示。

圖3 不同季度克羅諾桿菌檢出情況

2.2 克羅諾桿菌PFGE分子分型結(jié)果

33株克羅諾桿菌Xba I酶切、PFGE電泳、BioNumerics軟件聚類分析后，共得到14種DNA指紋圖譜，菌株間相似度為85.9%～100.0%，見圖4。按92%的相似度，33株菌的基因型可以分為2個大簇、5個小簇和1個單獨的基因型，分別為IA、IB、IC、ID、IE、IF、IG、IH。IG簇內(nèi)各菌株的同源性較高。盡管分離的克羅諾桿菌來源于不同廠家、不同時間、不同樣品，但卻有較高的同源性。表明該2個工廠的生產(chǎn)環(huán)境可能已被克羅諾桿菌污染。

圖4 33株陽性克羅諾桿菌PFGE圖譜聚類分析

3 討論

由于新生兒被克羅諾桿菌感染后死亡率很高（40%～80%）[18]，且該菌在食品加工過程中易形成生物膜，具有較強的耐熱性，因此，近年來克羅諾桿菌被廣泛關(guān)注[19-20]。對包括克羅諾桿菌在內(nèi)的致病菌進(jìn)行分子分型溯源，精確定位污染來源，切斷傳播途徑，可為有效應(yīng)對致病菌污染、保障食品安全提供技術(shù)支持。脈沖場凝膠電泳是食源性致病菌溯源應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，其具有特異性高、重復(fù)性好、結(jié)果可靠等優(yōu)點，已成功應(yīng)用于克羅諾桿菌分型溯源研究[21-23]。

本研究中，2個嬰幼兒配方乳粉加工廠克羅諾桿菌陽性樣品檢出率為1.12%，說明2廠均有一定程度的阪崎克羅諾污染，存在潛在的危害。陳曦[20]等在貴州采集市售嬰兒配方乳粉350份，分離出21株克羅諾桿菌，污染率為6%。胡靜等[24]調(diào)查了中國6個省份嬰幼兒配方羊乳粉中克羅諾桿菌的流行情況，檢出率為2.18%。雖然該2項調(diào)查研究的對象為成品嬰幼兒配方粉，但克羅諾桿菌陽性樣品檢出率均與此次調(diào)查結(jié)果接近。

SF廠克羅諾桿菌陽性樣品檢出率（4.10%）明顯高于YT廠（0.57%），雖然這一結(jié)果可能與采樣樣本數(shù)量有關(guān)，也可能由于2個工廠生產(chǎn)規(guī)模不同，大型企業(yè)對原料、生產(chǎn)、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)管控較嚴(yán)，衛(wèi)生情況較好所致[25]。SF工廠檢出的13株克羅諾桿菌中有9株來自于土壤，YT廠家檢出20株克羅諾桿菌中有12株來自于土壤，這一現(xiàn)象也證實了林學(xué)海等[26]關(guān)于嬰幼兒食品作為克羅諾桿菌污染途徑之一，最主要的特征是外源性，即外部環(huán)境的影響這一觀點。因此，兩個工廠均需要對生產(chǎn)的外部環(huán)境嚴(yán)加把控和管理。YT廠檢出的5份陽性樣品中有2份為乳糖粉，可能與該月份供貨商提供原輔料相關(guān)，提醒該企業(yè)對于原輔料的質(zhì)量把關(guān)要加緊。不同季度克羅諾桿菌陽性樣品檢出率有差異，與周厚德等[25]的調(diào)查結(jié)果不一致，分析可能與采樣量差異有關(guān)。

PFGE結(jié)果表明，2016年9月和10月分離自工廠邊土壤的陽性菌株聚類后幾乎都處于一大簇，表明環(huán)境中存在的克羅諾桿菌親緣關(guān)系較近。一般而言，如菌株DNA圖譜相似性為100%，則它們屬于同一PFGE型別，基因同源性很高。本研究發(fā)現(xiàn)多株菌相似性為100%，表明兩個嬰幼兒配方粉加工廠家受污染的克羅諾桿菌類型相對集中。YT廠IA簇源于后包車間的一株陽性菌株（P08）與另一株源于工廠邊土壤的陽性菌株（F19）呈現(xiàn)高度相似性，表明其在生產(chǎn)過程中可能來自同一污染源。ID簇來自乳糖粉（F08）的7株菌相似度大于98%，表明分離于同一輔料的菌株具有較高同源性。IE簇中SF廠中6株菌呈現(xiàn)高度相似性，這些菌株均來自于2016年9月的工廠邊土壤樣本。SF廠IB簇源于工廠邊土壤的一株陽性菌株（F19）與源于車間陰溝的一株陽性菌株（T19），IH簇源于工廠邊土壤的一株陽性菌株（F19）與源于凈化系統(tǒng)進(jìn)風(fēng)口的一株陽性菌株（T18），它們兩兩之間均分別呈現(xiàn)出高度相似性，表明其可能存在共同的污染源或存在交叉污染。

本研究初步發(fā)現(xiàn)陜西省2家嬰幼兒配方粉加工廠原輔料與環(huán)境均存在不同的污染，SF廠家污染相對較嚴(yán)重。乳粉糖、工作人員鞋底、工廠邊土壤、后包車間、凈化系統(tǒng)進(jìn)風(fēng)口和車間陰溝等均可能是克羅諾桿菌污染的關(guān)鍵點。本研究可為SF和YT 2個嬰配粉生產(chǎn)工廠對克羅諾桿菌污染預(yù)防提供數(shù)據(jù)和理論參考，也可為其他同類食品生產(chǎn)廠家克羅諾桿菌防控提供依據(jù)。