宋姍姍，楊 洋，陳 陽(yáng)，何 靜

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710077)

子癇前期(preeclampsia，PE)為妊娠期相關(guān)疾病，常因造成不良孕產(chǎn)結(jié)局而導(dǎo)致圍生期母嬰死亡[1]。疾病多發(fā)于妊娠20周之后，患者出現(xiàn)血壓升高、蛋白尿、水腫等，如病情加重會(huì)出現(xiàn)全身抽搐及多臟器功能損傷[2]。研究顯示，子癇前期與早產(chǎn)、胎死宮內(nèi)、胎兒窘迫、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限及胎盤(pán)早剝等不良孕產(chǎn)結(jié)局均直接相關(guān)[3]。PE患者一旦發(fā)生不良孕產(chǎn)結(jié)局，會(huì)對(duì)患者產(chǎn)生巨大影響并增加社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，故該疾病不良孕產(chǎn)結(jié)局的預(yù)測(cè)對(duì)于臨床具有重要價(jià)值。

目前研究顯示，PE相關(guān)微小RNA以及相關(guān)血管生成因子在PE的預(yù)測(cè)中具有一定作用[4]。其中微小RNA152(microRNA-152，miR-152)[5]、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PIGF)、可溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(soluble fms-like tyrosine kinase 1，sFlt-1)和可溶性內(nèi)皮抑素(soluble endoglin，sEng)水平對(duì)PE的發(fā)生具有重要預(yù)測(cè)及診斷價(jià)值[6]。但是，在PE患者群體中，上述因子是否與PE發(fā)生所導(dǎo)致的孕產(chǎn)不良結(jié)局具有相關(guān)性仍值得探索。因此，通過(guò)本研究項(xiàng)目，選擇既往研究發(fā)現(xiàn)對(duì)PE發(fā)病有診斷價(jià)值的因子miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng作為候選因子，篩選特異性和敏感性較高的組合對(duì)PE患者發(fā)生不良孕產(chǎn)結(jié)局進(jìn)行診斷預(yù)測(cè)，期待能夠?yàn)镻E的臨床診治提供理論依據(jù)。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選取西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科2019年1月至2020年12月收治的145例子癇前期患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷符合子癇前期，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第九版人民衛(wèi)生出版社《婦產(chǎn)科學(xué)》；②自然妊娠；③單胎妊娠；④既往無(wú)高血壓或者子癇病史。其中，發(fā)生不良孕產(chǎn)結(jié)局者為研究組(n=60)，未發(fā)生不良孕產(chǎn)結(jié)局者為對(duì)照組(n=85)。不良孕產(chǎn)結(jié)局包括早產(chǎn)、胎盤(pán)早剝、胎兒窘迫、低出生體重兒、胎死宮內(nèi)、新生兒肺炎。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意并批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2研究方法

所有患者診斷PE，入院后清晨空腹采集靜脈血8mL，3 000r/min離心5分鐘后，吸取上層血清，標(biāo)記后置于-80℃冰箱保存待檢測(cè)。

1.2.1 miR-152的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)定量PCR分析法檢測(cè)各組miR-152的表達(dá)。按照RNAisoTM試劑盒說(shuō)明步驟提取血清總樣本RNA，檢測(cè)RNA質(zhì)量。根據(jù)PrimerBank公布的基因序列設(shè)計(jì)合成miR-152及內(nèi)參U6的引物序列。miR-152上游引物序列：GTCGTCAGTGC ATGACAGAACTT；miR-152下游引物序列：GTG CAGGGTCCGAGGT。U6上游引物序列：CTC GCTTCGGCAGCACA；U6下游引物序列：AAC GCTTCACGAATTTGCGT。使用PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄合成miR-152 cDNA。以U6為內(nèi)參，按照SYBR Premix ExTaq試劑盒說(shuō)明行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。每次檢測(cè)設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣本重復(fù)3次。以上在每個(gè)PCR循環(huán)的延伸期采集熒光信號(hào)，PCR反應(yīng)完成后利用溫度梯度變性獲得溶解曲線供PCR產(chǎn)物定性分析。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，得到每個(gè)樣本的循環(huán)周期數(shù)(Cq值)，計(jì)算各組中目的基因的表達(dá)水平情況。

1.2.2產(chǎn)婦血清sFlt-1、PIGF、sEng的檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)各組產(chǎn)婦血清中sFlt-1、PIGF、sEng的表達(dá)水平。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行，所有標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)3次，以變異量低于5%時(shí)記錄檢測(cè)結(jié)果為最終濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組患者臨床特征比較

本研究145例PE患者中發(fā)生不良孕產(chǎn)結(jié)局的患者為60例(41.38%)，其中早產(chǎn)40例(66.67%)、胎盤(pán)早剝5例(8.33%)、胎兒窘迫12例(20.00%)、低出生體重兒44例(73.33%)、胎死宮內(nèi)1例(1.67%)、新生兒肺炎13例(21.67%)。研究組患者孕周和胎兒出生體重小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/H值分別為7.58、11.29，P<0.05)，兩組間年齡和住院天數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料分析Table 1 General data analysis between the two

2.2各組患者miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng的表達(dá)比較

與對(duì)照組相比，研究組患者miR-152、sFlt-1、sEng的表達(dá)水平上升，PIGF水平下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/H值分別為-7.73、-3.62、-5.18、4.06，P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng的表達(dá)分析Table 2 Expression analysis of miR-152,PIGF,sFlt-1 and sEng between the two

2.3患者miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng對(duì)不良孕產(chǎn)結(jié)局的診斷預(yù)測(cè)

單獨(dú)指標(biāo)診斷PE患者發(fā)生不良孕產(chǎn)結(jié)局時(shí)，miR-152診斷AUC最大，為0.80；sFlt-1診斷特異性較高，為96.47%；而sEng診斷敏感性較高，為88.33%。聯(lián)合指標(biāo)診斷時(shí)，AUC為0.89，特異性為86.23%，敏感性為77.47%，見(jiàn)表3及圖1。

表3 miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng對(duì)不良孕產(chǎn)結(jié)局的診斷預(yù)測(cè)分析Table 3 The diagnostic prediction of miR-152,PIGF,sFlt-1 and sEng on adverse pregnancy outcomes

3討論

3.1針對(duì)PE患者不良孕產(chǎn)結(jié)局的診斷預(yù)測(cè)意義

PE可導(dǎo)致嚴(yán)重母兒并發(fā)癥及不良妊娠結(jié)局，其為胎盤(pán)源性疾病，胎盤(pán)娩出后癥狀即消退；但在PE患者人群中胎盤(pán)功能出現(xiàn)異常變化的程度常常不一，并不是所有的患者均會(huì)出現(xiàn)相同或類似的圍產(chǎn)結(jié)局，尤其是嚴(yán)重的圍產(chǎn)結(jié)局患者；另外，在臨床工作中，PE患者的發(fā)病因素、臨床表現(xiàn)、首發(fā)病征均存在個(gè)體差異[7]，因此在PE的產(chǎn)時(shí)管理(包括分娩時(shí)機(jī)和方式的選擇)中面臨著很大的挑戰(zhàn)和考驗(yàn)。如何及時(shí)識(shí)別PE患者中不良孕產(chǎn)結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、提早預(yù)判和積極處置，以得到最佳的圍產(chǎn)結(jié)局具有非常重要的臨床意義[8]。因此，本研究選擇miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng水平作為候選預(yù)測(cè)因子，進(jìn)行ROC曲線分析，篩選特異性和敏感性較高的組合預(yù)測(cè)模型，探究不同因子單獨(dú)或聯(lián)合診斷預(yù)測(cè)已確診為PE的患者發(fā)生不良孕產(chǎn)結(jié)局的診斷價(jià)值。

3.2外周血miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng對(duì)PE患者不良孕產(chǎn)結(jié)局的診斷預(yù)測(cè)分析

既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA調(diào)控了PE患者病理生理變化。在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)水平，微小RNA通過(guò)與其靶基因相互作用，參與PE的發(fā)病過(guò)程[9]。其中，子癇前期相關(guān)miR-152可通過(guò)調(diào)控人組織相容性白細(xì)胞抗原G的表達(dá)參與子癇前期發(fā)生，其通過(guò)提高自然殺傷細(xì)胞對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的殺傷作用參與PE發(fā)病過(guò)程[10]。且既往研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)檢測(cè)孕婦血清中miR-152的表達(dá)聯(lián)合超聲指標(biāo)對(duì)PE的發(fā)病具有較高的診斷預(yù)測(cè)價(jià)值[5]。本研究在PE患者中利用miR-152對(duì)其不良孕產(chǎn)結(jié)局進(jìn)行ROC分析，同樣發(fā)現(xiàn)miR-152診斷預(yù)測(cè)價(jià)值較好，其AUC面積為0.80，特異性為76%，敏感性為78%，提示miR-152不僅可以作為PE疾病發(fā)生的預(yù)測(cè)因子，同時(shí)在PE不良孕產(chǎn)結(jié)局的預(yù)測(cè)中具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。

另外，PE的發(fā)病機(jī)制主要和胎盤(pán)形成、植入過(guò)程中促血管和抗血管生成因子的不平衡進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂有關(guān)，故血管生成相關(guān)因子與PE的發(fā)生密切相關(guān)[11-12]。其中，PIGF為促血管生成因子代表，sFlt-1和sEng為抗血管生成因子代表。已有大量研究結(jié)果表明，在PE患者的血清中，sFlt-1及sEng水平呈明顯增高趨勢(shì)，而PIGF呈明顯下降趨勢(shì)，該變化可能引起血管收縮以及內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而導(dǎo)致如胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限等不良孕產(chǎn)結(jié)局[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，和對(duì)照組相比，研究組患者PIGF的表達(dá)水平顯著下降，miR-152、sFlt-1和sEng的表達(dá)水平顯著上升，提示以上指標(biāo)和疾病的預(yù)后同樣密切相關(guān)。既往研究認(rèn)為，對(duì)于PE孕婦，孕早期和孕中期sFlt-1和sEng水平的連續(xù)性變化可預(yù)測(cè)PE患者是否發(fā)生早產(chǎn)，提示上述指標(biāo)對(duì)PE患者發(fā)生不良孕產(chǎn)結(jié)局同樣具有預(yù)測(cè)價(jià)值[14]。本研究通過(guò)ROC曲線進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)sFlt-1、PIGF的診斷特異性較高，而sEng診斷敏感性較高。相關(guān)機(jī)制研究認(rèn)為，在PE發(fā)生前5～6周sFlt-1和PIGF水平即增加，而sEng水平則在發(fā)生PE前2～3個(gè)月即開(kāi)始增高[11]。故相對(duì)于sFlt-1和PIGF，sEng水平具有更高的敏感性，而當(dāng)疾病進(jìn)展后，sFlt-1和PIGF水平的增加顯示出其診斷預(yù)測(cè)不良孕產(chǎn)結(jié)局的高度特異性。

3.3外周血miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng聯(lián)合檢測(cè)可提高對(duì)PE患者不良孕產(chǎn)結(jié)局的診斷預(yù)測(cè)效率

以往研究結(jié)果證實(shí)，對(duì)PIGF、sFlt-1和sEng水平的聯(lián)合檢測(cè)，可以顯著增加孕婦PE的檢出率[15]。本研究在miR-152因子的基礎(chǔ)上，結(jié)合以上血管形成相關(guān)因子建立聯(lián)合診斷模型，提示對(duì)上述因子聯(lián)合診斷預(yù)測(cè)PE患者發(fā)生不良孕產(chǎn)結(jié)局時(shí)，AUC為0.89，特異性為86.23%，敏感性為77.47%。故對(duì)于已確診的PE患者，預(yù)測(cè)其是否發(fā)生不良孕產(chǎn)結(jié)局時(shí)，若為了進(jìn)一步提高診斷預(yù)測(cè)率，可選擇上述多因子聯(lián)合檢測(cè)行診斷預(yù)測(cè)。另外，上述因子在孕早期或孕中期是否仍具有診斷預(yù)測(cè)應(yīng)用價(jià)值，在后續(xù)的研究中，我們將進(jìn)一步探究。

綜上，外周血中miR-152、PIGF、sFlt-1和sEng水平不僅可用于預(yù)測(cè)PE疾病，而且也可作為預(yù)測(cè)已確診的PE患者發(fā)生不良孕產(chǎn)結(jié)局的指標(biāo)，其中單獨(dú)應(yīng)用miR-152具有良好的診斷效果，多因子聯(lián)合檢測(cè)診斷效率更高。通過(guò)本項(xiàng)目研究，以期能夠?yàn)镻E疾病的臨床診斷預(yù)測(cè)提供參考依據(jù)。