慢加急性肝衰竭(ACLF)是我國(guó)較為常見(jiàn)的一種肝衰竭，而乙型肝炎病毒(HBV)感染是其主要誘因，ACLF合并乙型病毒性肝炎又稱HBV相關(guān)ACLF(HBV-ACLF)

。HBV-ACLF發(fā)病機(jī)制尚未十分明確，病情危重、病死率高、預(yù)后差，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，已成為社會(huì)和家庭的沉重負(fù)擔(dān)。研究表明，自噬在HBV-ACLF發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，且與病情程度有關(guān)

。Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)是兩種自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白質(zhì)，二者與肝祖細(xì)胞成熟分化有重要聯(lián)系

。微小RNA-17-5p(miRNA-17-5p)可通過(guò)靶向自噬mRNA參與自噬調(diào)控

。然而目前關(guān)于miRNA-17-5p在HBV-ACLF患者中的表達(dá)研究較少，且miRNA-17-5p與自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ相關(guān)性的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究通過(guò)探討HBV-ACLF患者血清miRNA-17-5p與Beclin1、LC3-Ⅱ表達(dá)的相關(guān)性，初步探究miRNA-17-5p在HBV-ACLF患者自噬中發(fā)揮的作用，以期為臨床上開(kāi)發(fā)早期HBV-ACLF診斷指標(biāo)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年2月至2020年5月本院住院治療的HBV-ACLF患者82例為HBV-ACLF組，男49例，女33例，平均年齡(36.26±12.36)歲；選取同期住院治療的慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者79例作為CHB組，男45例，女34例，平均年齡(34.72±12.96)歲；另選取同期86例健康體檢者作為對(duì)照組，男50例，女36例，平均年齡(35.79±12.89)歲。三組研究人群年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

>0.05)。試驗(yàn)經(jīng)本院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)要求。

按照改革實(shí)施方案，蹄疾步穩(wěn)推進(jìn)安順農(nóng)墾改革。以推動(dòng)茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展為主導(dǎo)方向，在原有的茶葉聯(lián)盟基礎(chǔ)上，以貴州省安順市茶葉果樹(shù)場(chǎng)為核心，依托安順御茶村茶業(yè)有限責(zé)任公司的市場(chǎng)渠道和成熟技術(shù)，大力打造覆蓋山京畜牧場(chǎng)等5家農(nóng)墾農(nóng)場(chǎng)和4家民營(yíng)企業(yè)的安順九龍山山脈區(qū)域3萬(wàn)多畝茶葉大基地。以安順“瀑布茶”為平臺(tái)，組建更緊密的區(qū)域性農(nóng)墾茶葉實(shí)體集團(tuán)，確?！鞍矇ㄆ俨疾琛逼放苹?、加工、營(yíng)銷等持續(xù)發(fā)展。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①CHB診斷符合CHB防治指南(2015年版)

，HBV-ACLF診斷符合《肝衰竭診治指南(2012年版)》

，HBV-ACLF診斷要點(diǎn)為慢性肝病基礎(chǔ)上4周內(nèi)出現(xiàn)以下癥狀：消化道癥狀明顯，乏力；失代償腹水；黃疸明顯，總膽紅素大于正常值上限10倍；伴或不伴肝性腦?。慌懦渌惓Ｔ蚝竽冈顒?dòng)度≤40%。②病例資料齊全。③一個(gè)月內(nèi)未使用抗炎、免疫抑制劑。④患者均自愿參加研究，并簽署知情同意書。

本文研制的是一種無(wú)機(jī)泡沫吸波材料，是利用碎玻璃或火山灰等為主要原材料，在其中添加電磁損耗物質(zhì)，熔融發(fā)泡而成的一種隱身材料，如圖7所示。

1.5.1 樣品采集及保存 采集健康體檢者體檢當(dāng)天及CHB、HBV-ACLF患者入院第2天清晨空腹靜脈血，3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80℃保存待測(cè)。

1.5.2 血清miRNA-17-5p水平測(cè)定 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)受試者血清miRNA-17-5p表達(dá)水平。采用RNA提取試劑盒提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用qRT-PCR儀對(duì)miRNA-17-5p及其內(nèi)參U6進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系共10 μl：cDNA模板(50 ng/μl)1 μl，正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5 μl，ddH

O 3.0 μl，Rox reference dye(50×)0.2 μl，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用2

法計(jì)算血清miRNA-17-5p相對(duì)表達(dá)量。

2.2 3組受試者總膽紅素、白蛋白、HBV DNA載量比較見(jiàn)表3。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①伴有人免疫缺陷病毒或其他病毒感染者；②遺傳代謝性肝病、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷、酒精性肝病者；③伴有腎臟疾病、腎功能不全者。

1.4 主要試劑與儀器 Beclin1 ELISA試劑盒(貨號(hào)：MM-13158H1)、LC3-Ⅱ ELISA試劑盒(貨號(hào)：MM-2005H1)均購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司；總膽紅素ELISA試劑盒(貨號(hào)：QTE20094)購(gòu)自上海乾途生物科技有限公司；白蛋白ELISA試劑盒(貨號(hào)：KA0454)購(gòu)自上海群己生物科技有限公司；RNA提取試劑盒(貨號(hào)：JL1545)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：toyobo/FSQ-301)購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司；Rox reference dye(貨號(hào)：AAT-400-E)購(gòu)自艾美捷科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(貨號(hào)：RR820A)購(gòu)自上海善然生物科技有限公司；HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒(PCR熒光探針?lè)?(貨號(hào)：20163401365)購(gòu)自杭州艾康生物技術(shù)有限公司；qRT-PCR儀(型號(hào)：Stratagene Mx3005P)購(gòu)自上海普迪生物科技有限公司。

1.5.3 血清自噬相關(guān)蛋白、總膽紅素、白蛋白水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)各組血清自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ及總膽紅素、白蛋白水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.4 血清HBV DNA載量檢測(cè) 血清HBV DNA載量測(cè)定采用PCR結(jié)合熒光探針的體外擴(kuò)增技術(shù)。HBV引物序列P1：5′-ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT-3′，P2：5′-ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA-3′，熒光探針序列：5′-TGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTG-3′，引物及探針由中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因診斷中心合成。提取DNA后，按照熒光探針HBV DNA定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，之后放入qRT-PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，電腦分析并計(jì)算出HBV DNA拷貝數(shù)。

有人說(shuō)：戲劇的本質(zhì)就是沖突。矛盾沖突是構(gòu)成戲劇情境的基礎(chǔ)，是展現(xiàn)人物性格、反映生活本質(zhì)、揭示作品主題的重要手段。教學(xué)時(shí)抓住了矛盾沖突等于找到了戲劇的正確“打開(kāi)方式”，剖析矛盾沖突，對(duì)品析人物性格，走進(jìn)人物內(nèi)心，乃至演好劇本都將起到至關(guān)重要的作用。

正如保羅·萊文森所提出的媒介演進(jìn)的“人性化趨勢(shì)”［6］理論，隨著智媒時(shí)代的到來(lái)，媒介會(huì)越來(lái)越人性化，AI 技術(shù)會(huì)隨著用戶需求的變化不斷完善。同時(shí)，彭蘭教授也提到媒介的“自我進(jìn)化”［5］，人機(jī)合一的模式會(huì)使機(jī)器具有洞察人心的能力，而人對(duì)機(jī)器的駕馭能力也互為推進(jìn)。那么人如何把握機(jī)器？人的價(jià)值如何體現(xiàn)？這些問(wèn)題需要我們時(shí)刻思考。技術(shù)的發(fā)展要求媒體工作者進(jìn)一步提升自身素質(zhì)，具備組織人工智能、“應(yīng)用”大數(shù)據(jù)等新興技術(shù)的能力。

2 結(jié)果

2.1 3組受試者血清miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ水平比較 見(jiàn)表2。

1.5 研究方法

2.4 血清miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ水平對(duì)HBV-ACLF的診斷價(jià)值 以血清miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ水平為檢驗(yàn)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，血清miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ水平診斷HBV-ACLF的曲線下面積(AUC)分別為0.862(95%

:0.806～0.918)、0.784(95%

: 0.715～0.853)、0.886(95%

: 0.836～0.935)，截?cái)嘀捣謩e為1.311、10.192 ng/ml、58.416 ng/ml，特異性分別為88.4%、80.2%、81.4%，敏感度分別為74.4%、63.4%、81.7%；三者聯(lián)合診斷的AUC為0.915(95%

: 0.869～0.961)，特異性為88.4%，敏感度為82.9%，見(jiàn)圖3。

2.3 HBV-ACLF患者血清miRNA-17-5p與Beclin1、LC3-Ⅱ、總膽紅素、白蛋白、HBV DNA載量的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HBV-ACLF患者血清miRNA-17-5p水平與Beclin1、LC3-Ⅱ呈負(fù)相關(guān)(

=-0.580、-0.511；均

<0.05)，見(jiàn)圖1、2。HBV-ACLF患者血清miRNA-17-5p與總膽紅素、HBV DNA載量均呈負(fù)相關(guān)，與白蛋白呈正相關(guān)(

<0.05)；Beclin1、LC3-Ⅱ與總膽紅素、HBV DNA載量均呈正相關(guān)，與白蛋白呈負(fù)相關(guān)(

<0.05)，見(jiàn)表4。

目前，常用的沙門氏菌檢測(cè)方法有傳統(tǒng)方法如國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、AOAC等，以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法如酶聯(lián)免疫法（ELISA）等，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 等[6]。傳統(tǒng)方法培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一般需要3～4 d檢測(cè)時(shí)間[7]。ELISA方法從樣品的制備到檢測(cè)結(jié)束大概要40～48 h才能完成，且由于使用的多價(jià)血清存在不同程度的交叉反應(yīng)，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性[8]。PCR方法需要昂貴的PCR儀器和繁瑣的電泳，故不宜普遍推廣。因此，亟需開(kāi)發(fā)一種快速檢測(cè)食品中沙門氏菌的檢測(cè)方法，對(duì)于保障我國(guó)食品安全具有重要意義。

2.5 影響HBV-ACLF發(fā)生的多因素Logistic回歸分析將是否發(fā)生HBV-ACLF作為因變量，以miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ、總膽紅素、白蛋白、HBV DNA載量為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示Beclin1、HBV DNA載量是影響HBV-ACLF發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(

<0.05)，miRNA-17-5p水平是影響HBV-ACLF發(fā)生的保護(hù)因素(

<0.05)，見(jiàn)表5。

1.名詞適用應(yīng)統(tǒng)一。行政院提出之草案版本名稱為“糾纏行為防制法”，而立法委員提出之草案版本名稱為“跟蹤騷擾防制法”。為貼近一般大眾所能理解的反復(fù)、持續(xù)侵?jǐn)_情形，建議應(yīng)將名詞統(tǒng)一，以避免名詞解釋上模棱兩可。

3 討論

肝衰竭是肝病的一種類型，多數(shù)肝衰竭患者發(fā)病與HBV感染有關(guān)

。HBV-ACLF是在CHB基礎(chǔ)上，短期迅速發(fā)展，出現(xiàn)肝功能失代償，進(jìn)而出現(xiàn)凝血功能障礙、肝性腦病、高膽紅素及腹水等表現(xiàn)的一組臨床癥候群

。HBV-ACLF臨床表現(xiàn)多樣，治愈率極低，因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早評(píng)估，進(jìn)而采取積極有效的應(yīng)對(duì)辦法仍是目前HBV-ACLF診療過(guò)程中亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。

肝細(xì)胞壞死和再生障礙是HBV-ACLF的發(fā)病機(jī)制之一，而肝細(xì)胞自噬也可能是其機(jī)制之一

。Beclin1定位于人染色體17q21，是調(diào)節(jié)自噬現(xiàn)象的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，且能與線粒體結(jié)合促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡

。LC3-Ⅱ位于自噬的雙層膜上，主要參與自噬體的伸展與延長(zhǎng)，是一種常用于檢測(cè)自噬水平的分子標(biāo)志物

。本研究結(jié)果顯示，HBV-ACLF患者血清Beclin1、LC3-Ⅱ水平高于CHB患者和健康人群，CHB患者血清Beclin1、LC3-Ⅱ水平高于健康人群，與梁振國(guó)等

研究結(jié)果基本一致。提示肝臟疾病患者血清Beclin1、LC3-Ⅱ水平可能隨患者病情加重而升高，其可能是由于疾病發(fā)生后細(xì)胞凋亡過(guò)程中激活的相關(guān)蛋白可剪切Beclin1，剪切后形成的C端Beclin1可啟動(dòng)自噬，參與自噬體的合成，而被激活的LC3-Ⅱ參與自噬體的伸展與延長(zhǎng)，影響患者病情進(jìn)展。

miRNA是長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性、非編碼的單鏈小RNA分子，可參與細(xì)胞凋亡、自噬等多種過(guò)程的調(diào)控，在循環(huán)中穩(wěn)定存在

。洪丹彤等

研究表明，miRNA-17-5p可靶向自噬相關(guān)蛋白，進(jìn)而調(diào)控巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分歧桿菌感染。本研究結(jié)果顯示，HBV-ACLF患者血清miRNA-17-5p水平低于CHB患者和健康人群，且與Beclin1、LC3-Ⅱ呈負(fù)相關(guān)，Beclin1、miRNA-17-5p均是影響HBV-ACLF發(fā)生的因素。推測(cè)HBV感染過(guò)程中，miRNA-17-5p下調(diào)后可能通過(guò)靶向上調(diào)Beclin1表達(dá)水平，并且增加LC3-Ⅱ表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)自噬體的合成及其與溶酶體的結(jié)合，增強(qiáng)自噬作用，最終對(duì)患者病情進(jìn)行調(diào)控。且本研究ROC結(jié)果顯示，miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ三者對(duì)HBV-ACLF均有一定的診斷價(jià)值，且三者聯(lián)合診斷價(jià)值較高，臨床中可參考三者截?cái)嘀邓剑瑢?duì)患者病情進(jìn)行初步診斷。臨床研究表明，總膽紅素、HBV DNA載量均是反映肝臟疾病肝功能及病毒載量情況的重要指標(biāo)

。而本研究結(jié)果中miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ與總膽紅素、HBV DNA載量均呈一定的相關(guān)性，進(jìn)一步提示miRNA-17-5p可能通過(guò)調(diào)控Beclin1、LC3-Ⅱ表達(dá)影響自噬水平，參與肝臟疾病的發(fā)展及肝功能的調(diào)節(jié)。

綜上所述，HBV-ACLF患者血清miRNA-17-5p表達(dá)水平升高，且與自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ均呈一定的相關(guān)性。表明HBV-ACLF可能與自噬處于異常激活狀態(tài)有關(guān)，而miRNA-17-5p可能通過(guò)影響自噬水平參與HBV-ACLF病情的發(fā)生、發(fā)展。但因本研究收集受試者樣本量有限，結(jié)果可能存在一定的局限性，且miRNA-17-5p參與HBV-ACLF的機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

[1] Cai JJ, Wang K, Han T,

. Evaluation of prognostic values of inflammation-based makers in patients with HBV-related acute-on-chronic liver failure[J]. Medicine, 2018, 97(46):1-11.

[2] Wang Y, Wang JL, Cheng H,

. Mesenchymal stem cells increase heme oxygenase 1-activated autophagy in treatment of acute liver failure[J]. Biochem Bioph Res Co, 2019, 508(3):682-689.

[3] 崔潔潔, 方姝煜, 龔夢(mèng)嘉, 等. 全反式維甲酸調(diào)控自噬促進(jìn)肝祖細(xì)胞成熟分化的作用研究[J]. 中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 40(5):759-767.

[4] Huang C, Yu XH, Zheng XL,

. Interferon-stimulated gene 15 promotes cholesterol efflux by activating autophagy via the miR-17-5p/Beclin-1 pathway in THP-1 macrophage-derived foam cells[J]. Eur J Pharmacol, 2018, 827(1):13-21.

[5] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì), 中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì). 慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)[J]. 中國(guó)肝臟病雜志(電子版), 2015, 7(3):1-18.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)肝衰竭與人工肝學(xué)組, 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)重型肝病與人工肝組學(xué). 肝衰竭診治指南(2012年版)[J]. 實(shí)用器官移植電子雜志, 2013, 1(4):193-202.

[7] Wang YY, Chen C, Qi JJ,

. Altered PGE2-EP2 is associated with an excessive immune response in HBV-related acute-on-chronic liver failure[J]. J Transl Med, 2019, 17(1):93-108.

[8] Lin W, Zhang J, Liu XH,

. A dynamic model for predicting outcome in patients with HBV related acute-on-chronic liver failu-re[J]. Ann Hepatol, 2018, 17(3):392-402.

[9] Yang Z, Zhang Z, Cheng Q,

. Plasma perfusion combined with plasma exchange in chronic hepatitis B-related acute-on-chronic liver failure patients[J]. Hepatol Int, 2020, 14(9):491-502.

[10] 于守水, 王剛平, 冷靜, 等. 線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體在氧糖剝奪-復(fù)氧復(fù)糖SH-SY5 Y細(xì)胞線粒體自噬中的作用[J]. 中華麻醉學(xué)雜志, 2019, 39(3):377-380.

[11] 朱敏玲, 梁賢凱, 羅文才, 等. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬參與百草枯中毒所致肺損傷[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2018, 18(2):254-258.

[12] 梁振國(guó), 王佳潔, 勞曉潔, 等. HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者血清自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)及意義[J]. 廣西醫(yī)學(xué), 2019, 41(14):1792-1794.

[13] Jin L, Zhou Y, Han L,

. MicroRNA302-367-PI3K-PTEN-AKT-mTORC1 pathway promotes the development of cardiac hypertrophy through controlling autophagy[J]. Vitro Cell Dev An, 2020, 56(12):112-119.

[14] 洪丹彤, 張帆, 王淑娥, 等. miR-17-5p靶向自噬相關(guān)蛋白ATG7調(diào)控巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染作用的研究[J]. 中國(guó)生物工程雜志,2019,39(6):1-8.

[15] 翁艷, 劉曉川, 賈志偉, 等. HBeAg陰性與陽(yáng)性慢性乙肝合并肝硬化患者血清HBV DNA載量與肝臟生化指標(biāo)的相關(guān)性[J]. 海南醫(yī)學(xué), 2019,30(4):18-21.