董亞茹 李茹霞 趙東曉 耿兵 孫景詩(shī) 李云芝 王照紅

摘要：AP2/ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用。為發(fā)掘桑樹(shù)AP2/ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的成員及其功能，從桂桑優(yōu)12中克隆到7個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，命名為MnAP2/ERF1～MnAP2/ERF7。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，這7個(gè)AP2/ERF蛋白都屬于不穩(wěn)定蛋白，且均屬于親水性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，亞細(xì)胞定位顯示主要位于細(xì)胞核中。氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，這7個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子均含有1個(gè)保守AP2結(jié)構(gòu)域，其中MnAP2/ERF1～MnAP2/ERF4屬于ERF亞家族，MnAP2/ERF5～MnAP2/ERF7屬于DREB亞家族。熒光定量分析顯示，NaCl、PEG6000、水淹脅迫可誘導(dǎo)7個(gè)桑樹(shù)AP2/ERF基因上調(diào)表達(dá)，其中MnAP2/ERF3、MnAP2/ERF5、MnAP2/ERF6分別響應(yīng)水淹、干旱和鹽脅迫，說(shuō)明桑樹(shù)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與逆境脅迫響應(yīng)之間有密切的聯(lián)系。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步揭示AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控桑樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：桑樹(shù);AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子;生物信息學(xué)分析;基因表達(dá);非生物脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)：S888.3：Q786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2022）01-0007-07

植物的生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)常遭受干旱、鹽、冷、熱等非生物脅迫[1，2]，響應(yīng)這些脅迫的過(guò)程受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[3]。轉(zhuǎn)錄因子作為一類(lèi)重要的調(diào)控蛋白，在植物發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境脅迫的信號(hào)通路和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[4，5]。

AP2/ERF （APETALA2/ethyleneresponsivefactor，AP2/ERF）家族是最重要的植物轉(zhuǎn)錄因子之一，至少包含一個(gè)AP2高度保守的DNA結(jié)合域，由60～70個(gè)保守氨基酸組成[6]。AP2/ERF家族除了At4g13040外，又可根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域的序列相似性和重復(fù)程度分為AP2、ERF和RAV家族[7]，其中，AP2家族蛋白有兩個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，ERF家族蛋白只有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，RAV家族成員有一個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)特異的B3DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[8]。根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域的序列相似性，ERF家族又進(jìn)一步細(xì)分為ERF和DREB兩個(gè)亞家族，ERF亞家族的第14和19個(gè)氨基酸分別為丙氨酸（Ala）和天冬氨酸（Asp），而DREB亞家族分別為纈氨酸（Val）和谷氨酸（Glu）[9]。

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及多種逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)有著重要調(diào)控作用。從大豆中克隆的GmERF3異源性表達(dá)增強(qiáng)了煙草對(duì)鹽和干旱脅迫的耐受性[10];從甘薯中分離出的IbERF1和IbERF2基因?qū)Σ煌姆巧锩{迫表現(xiàn)出不同的響應(yīng)[11];過(guò)表達(dá)AtERF1的擬南芥株系更能耐受鹽和干旱脅迫[12];花生AhERF019基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)可以提高擬南芥的抗旱和耐鹽性[13];將罌粟中的PsAP2基因在煙草中過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)煙草對(duì)非生物脅迫的耐受性[14]。

桑樹(shù)（MorusbalbaL.）在我國(guó)分布廣泛，是家蠶的唯一植物性食物，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值[15，16]。目前從桑樹(shù)中共鑒定到116個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員[17]，但對(duì)其具體功能的研究還比較少。故本研究對(duì)從桂桑優(yōu)12中克隆獲得的7個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并分析不同逆境脅迫下其在桑樹(shù)不同組織中的表達(dá)特征，以期為進(jìn)一步研究桑樹(shù)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子參與逆境脅迫等過(guò)程奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試桑樹(shù)品種為桂桑優(yōu)12，種子購(gòu)于廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站。挑選健康、飽滿的種子，播種于10cm×10cm×9cm育苗盆中，培養(yǎng)基質(zhì)為按2∶1比例混合的草炭土和蛭石，于山東省蠶業(yè)研究所溫室大棚內(nèi)，在光周期14h/10h、溫度25℃、相對(duì)濕度60% ～70%條件下培養(yǎng)，至四葉一心期間苗，每盆留苗4棵。播種兩個(gè)月后，挑選72盆長(zhǎng)勢(shì)基本一致的桑樹(shù)幼苗，分為3組，每組24盆，第一組和第二組分別用200mmol/LNaCl、20%PEG6000溶液進(jìn)行澆灌處理，第三組進(jìn)行水淹處理（以水淹沒(méi)莖部1cm為準(zhǔn)），均設(shè)3個(gè)重復(fù)。于處理0、12、24、48h分別取桑樹(shù)植株的根和葉，經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑樹(shù)AP2/ERF蛋白的生物信息學(xué)分析 基于川桑基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和桂桑優(yōu)12轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得7條AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子序列，利用ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）在線網(wǎng)站分析其理化性質(zhì)，利用https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html在線網(wǎng)站分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用BioEdit軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，利用SoftBerryProtComp9.0和WoLFPSORT軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2 桑樹(shù)AP2/ERF基因表達(dá)分析 用OMEGA植物RNA試劑盒（R6827）提取桑樹(shù)不同組織總RNA，分別取1μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系和操作程序參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）說(shuō)明。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，選擇MnRPL15和β-actin作為內(nèi)參基因[18，19]，進(jìn)行定量RT-PCR，引物見(jiàn)表1，由上海生工生物工程有限公司合成。RT-PCR反應(yīng)體系為20μL：TB GreenPremixExTaq10μL，基因特異性上下游引物各1μL（10μmol/L），模板cDNA2μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序按照TB GreenPremixExTaq（TaKaRaNo.RR820Q）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在CFX96RealTimePCRDetectionSystem儀器（BioRadBio.CA.USA.）上完成。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，RT-PCR數(shù)據(jù)利用2-△△Ct法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 7個(gè)桑樹(shù)AP2/ERF蛋白的生物信息學(xué)分析

結(jié)果（表2）顯示，7個(gè)桑樹(shù)AP2/ERF蛋白的編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為588、1050、828、1008、1173、963、477bp，分別編碼195、349、275、335、390、320、158個(gè)氨基酸。7個(gè)MnAP2/ERF蛋白都屬于不穩(wěn)定蛋白，且均屬于親水性蛋白，其中MnAP2/ERF1、MnAP2/ERF5、MnAP2/ERF6蛋白的PI值大于7，為堿性蛋白，其余則為酸性蛋白。對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（表3）表明這7個(gè)AP2/ERF蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，均在50%以上，其次是α-螺旋，在20%以上，β-轉(zhuǎn)角占比最少，均在6%以下。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，桑樹(shù)這7個(gè)AP2/ERF蛋白均含有1個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域（圖1）。

2.2 7個(gè)桑樹(shù)AP2/ERF蛋白的亞細(xì)胞定位

利用SoftBerryProtComp9.0軟件預(yù)測(cè)的亞細(xì)胞定位結(jié)果（表4）顯示，MnAP2/ERF1～MnAP2/ERF7均為定位在細(xì)胞核的預(yù)測(cè)值最高（總分10分，數(shù)值越高可信度越大）。而利用WoLFPSORT軟件進(jìn)行的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)則將MnAP2/ERF3定位到葉綠體，其余均與SoftBerryProtComp9.0軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。綜合兩種預(yù)測(cè)結(jié)果，考慮MnAP2/ERF1～MnAP2/ERF7可能位于細(xì)胞核。

2.3 7個(gè)桑樹(shù)AP2/ERF蛋白的進(jìn)化分析

為了明確桑樹(shù)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族之間的進(jìn)化關(guān)系，用得到的7個(gè)桑樹(shù)AP2/ERF蛋白序列與26個(gè)擬南芥AP2/ERF蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖2）顯示，MnAP2/ERF1和MnAP2/ERF2、MnAP2/ERF3、MnAP2/ERF4分別屬于ERF亞家族的B3、B2、B4，MnAP2/ERF5和MnAP2/ERF6、MnAP2/ERF7分別屬于DREB亞家族的A6、A5。

2.4 7個(gè)桑樹(shù)AP2/ERF基因在不同逆境脅迫下的表達(dá)特征

結(jié)果（圖3）顯示，NaCl、干旱和水淹脅迫均能誘導(dǎo)7個(gè)MnAP2/ERF基因上調(diào)表達(dá)，但不同脅迫處理不同時(shí)間的表達(dá)量有所不同。

NaCl脅迫下，MnAP2/ERF1～ MnAP2/ERF7基因在葉片中的表達(dá)量整體高于根系中，其中MnAP2/ERF6基因在葉片中的表達(dá)量升高最明顯，在脅迫12h達(dá)到最大值，24h略有下調(diào)，48h則顯著下調(diào);MnAP2/ERF1～MnAP2/ERF5均在脅迫24h表達(dá)量較高。根系中MnAP2/ERF3、MnAP2/ERF4、MnAP2/ERF5三個(gè)基因分別在12、12、48h表達(dá)量達(dá)到最高值，明顯高于其它時(shí)期各基因的表達(dá)量。

PEG6000脅迫下，MnAP2/ERF基因在葉片中的表達(dá)量也多高于在根系中的。葉片中MnAP2/ERF1、MnAP2/ERF2、MnAP2/ERF4均在脅迫48h表達(dá)量大幅上調(diào);MnAP2/ERF5基因在脅迫24h表達(dá)量大幅升高，但在48h又急劇下調(diào);MnAP2/ERF6在脅迫后即急劇上調(diào)表達(dá)，12～48h的表達(dá)量差異不顯著。根系中MnAP2/ERF4基因在整個(gè)處理期的表達(dá)量也較高，明顯高于其他6個(gè)基因的表達(dá)量。

與鹽脅迫和干旱脅迫不同，水淹脅迫下MnAP2/ERFs基因的最高表達(dá)量出現(xiàn)在根系中。根系中MnAP2/ERF3基因在水淹脅迫12h的表達(dá)量大幅升高，一直持續(xù)到48h，高于其它MnAP2/ERF基因。葉片中MnAP2/ERF4基因在脅迫24h的表達(dá)量明顯高于其它時(shí)期各基因的表達(dá)量。

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子包含DNA結(jié)合區(qū)、核定位信號(hào)、蛋白質(zhì)相互作用和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等區(qū)域，具有相似保守基序的轉(zhuǎn)錄因子可能具有相似的功能[20]。本研究從桑樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選到7條完整的AP2/ERF家族蛋白序列，其中4個(gè)為ERF亞家族成員、3個(gè)為DREB亞家族成員，聚類(lèi)結(jié)果與擬南芥的相似，說(shuō)明AP2/ERF家族在不同物種間高度保守。這7個(gè)桑樹(shù)AP2/ERF蛋白的編碼區(qū)長(zhǎng)度、氨基酸數(shù)目、理論等電點(diǎn)等方面存在差異，可能決定了各蛋白執(zhí)行著不同的生物學(xué)功能。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)將桑樹(shù)AP2/ERF蛋白定位于細(xì)胞核上，說(shuō)明是在細(xì)胞核中對(duì)下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

ERF轉(zhuǎn)錄因子是植物中參與非生物脅迫反應(yīng)的重要候選因子[21，22]。AP2/ERF已被報(bào)道是擬南芥、水稻、大豆、蘋(píng)果和黃瓜等多種植物中的脅迫調(diào)節(jié)因子[23]。本研究結(jié)果也表明，NaCl、干旱和水淹脅迫均能誘導(dǎo)7個(gè)MnAP2/ERF基因上調(diào)表達(dá)，但不同脅迫不同時(shí)間在葉片和根中的表達(dá)量不同，NaCl和干旱脅迫下在葉片中的表達(dá)量更高，而水淹脅迫下在根系中的表達(dá)量更高。NaCl脅迫下，MnAP2/ERF6在脅迫12～24h的葉片中表達(dá)量較高，其次為MnAP2/ERF4，根系中則以脅迫12hMnAP2/ERF3、MnAP2/ERF4和48hMnAP2/ERF5的表達(dá)量較高;PEG脅迫下桑樹(shù)葉中的MnAP2/ERF4、MnAP2/ERF5、MnAP2/ERF6和根中的MnAP2/ERF4表達(dá)量變化較為突出。說(shuō)明大多數(shù)基因表現(xiàn)出特定的時(shí)空表達(dá)模式，具有潛在的耐鹽、耐旱能力，與在楊樹(shù)、煙草、水稻、番茄、擬南芥中的研究結(jié)果類(lèi)似[24-28]。植物為適應(yīng)水淹時(shí)的缺氧環(huán)境，其自身通過(guò)多種基因調(diào)控以減少損傷[28，29]，淹水脅迫顯著誘導(dǎo)ERF基因表達(dá)，說(shuō)明其可能參與了缺氧反應(yīng)基因的激活[29，30]。本研究中，水淹脅迫下桑樹(shù)葉中的MnAP2/ERF4、MnAP2/ERF6和根中的MnAP2/ERF3表達(dá)量?jī)?yōu)于其它基因，也說(shuō)明了ERF基因具有潛在的耐水淹脅迫的能力。

4 結(jié)論

本研究從桂桑優(yōu)12中克隆了7個(gè)AP2/ER轉(zhuǎn)錄因子序列，預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞核，其中，MnAP2/ERF1和MnAP2/ERF2、MnAP2/ERF3、MnAP2/EFR4分別屬于ERF亞家族的B3、B2、B4，MnAP2/ERF5和MnAP2/ERF6、MnAP2/ERF7分別屬于DREB亞家族的A6、A5。NaCl、PEG6000和水淹脅迫均能誘導(dǎo)其上調(diào)表達(dá)，推測(cè)可能參與調(diào)控桑樹(shù)非生物脅迫應(yīng)答的過(guò)程。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步揭示桑樹(shù)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育以及逆境響應(yīng)等機(jī)理提供參考。