徐彪 王佰眾 李玉發(fā) 楊翔宇 王偉 牛海龍 李偉堂 劉紅欣 吳松權 何中國

摘要：為了建立適宜不同來源花生種質(zhì)遺傳差異分析的MITE反應體系，本研究從反應體系總量、TaqPCRMix用量、引物濃度、模板DNA濃度及退火溫度、循環(huán)次數(shù)方面對反應體系進行優(yōu)化，得到的最佳反應體系為：反應總體積10μL，模板DNA20ng，引物（15μmol/L）2μL，TaqPCRMix5μL。反應程序為95℃預變性3min;95℃變性30s，58℃退火40s，72℃延伸30s，循環(huán)32次;72℃延伸10min;4℃保存。利用優(yōu)化的反應體系從50對AhMITE引物中篩選出11對多態(tài)性高的引物，并用于對22份不同來源的花生種質(zhì)進行遺傳多樣性分析。結果表明，共擴增出23條帶，其中，多態(tài)性帶21條，多態(tài)性比例為91.3%，每個引物平均擴增的多態(tài)性帶為1.91條。種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)在0.222～0.957之間，平均值為0.644;通過NTSYS-pcVersion2.1軟件基于UPGMA法進行聚類圖繪制，在遺傳相似系數(shù)為0.62時可將22份花生種質(zhì)分為3大類。表明經(jīng)過優(yōu)化的AhMITE反應體系可以有效地用于不同來源花生種質(zhì)的遺傳多樣性分析，表現(xiàn)出良好的多態(tài)性，可為進一步使用AhMITE標記對花生品種鑒定和遺傳圖譜構建奠定基礎。

關鍵詞：花生;AhMITE標記;反應體系優(yōu)化;遺傳多樣性分析

中圖分類號：S565.203 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2022）01-0001-06

栽培花生（ArachishypogaeaLinn.，AABB，2n=4x=40）是一種重要的異源四倍體作物，原產(chǎn)于南美洲，富含油脂、蛋白質(zhì)、維生素和其他微量營養(yǎng)元素[1，2]。評估花生種質(zhì)資源的遺傳變異和種群結構，分析其遺傳多樣性，對于挖掘花生種質(zhì)的遺傳潛力、選育滿足不同需求的花生品種具有重要意義[3]。

分子標記技術已被廣泛用于花生種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，如姜慧芳等[4]用簡單序列重復（SSR）標記和擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）技術分析了31份具有不同青枯病抗性的花生種質(zhì)的遺傳多樣性;楊海棠等[5]利用200對多態(tài)性較好的SSR分子標記對河南省近年推廣及新選育的60個花生品種（系）進行了遺傳多樣性分析;閆苗苗等[6]應用RAPD和ISSR標記對24份花生材料進行了遺傳多樣性分析;Zou等[7]使用具有單核苷酸多態(tài)性（SNP）標記評估了384份花生種質(zhì)的遺傳多樣性。

MITEs即微型反向重復轉座元件（miniatureinverted-repeattransposableelements），最早是從玉米中發(fā)現(xiàn)的，后被證明廣泛存在于動植物基因組中，是一種活躍的、非自主的DNA轉座子，在調(diào)控基因表達、進化及生物多樣性形成中起著重要作用[8，9]。研究表明，利用MITE標記輔助花生種質(zhì)鑒定和多樣性分析簡單高效，且揭示的栽培花生DNA多態(tài)性明顯高于SSR和其他類型分子標記[10-12]。建立適宜的MITE反應體系是擴增多態(tài)性條帶的關鍵，決定了后續(xù)多樣性分析結果的準確性;但不同基因型、不同來源花生種群因受環(huán)境影響其最佳AhMITE 反應體系會存在差異[13-15]。因此，本試驗首先對AhMITEPCR反應體系的總量、TaqPCRMix用量、引物濃度、模板DNA濃度及退火溫度、循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化，然后用優(yōu)化后的反應體系對不同來源的22份花生種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，評估品種間的遺傳變異程度，以期為今后開發(fā)和利用AhMITE標記分析花生種群結構、進行種質(zhì)鑒定及構建遺傳圖譜提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用22份花生種質(zhì)材料均來自于吉林省農(nóng)業(yè)科學院花生育種研究團隊，其中，珍珠豆型花生種質(zhì)19份，多粒型花生種質(zhì)3份。材料名稱和來源見表1。

1.2 DNA提取及PCR擴增

采用CTAB法提取花生組DNA[13]，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測花生組DNA的片段和質(zhì)量，并用超微量分光光度計對DNA的濃度進行測定，將DNA稀釋為20ng/μL，放于-20℃冷凍備用。

PCR預先設定的反應程序為：95℃預變性3min;95℃變性30s，56～61℃退火40s，72℃延伸30s，循環(huán)28～33次;72℃延伸10min;4℃保存。

PCR產(chǎn)物使用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電極緩沖液采用0.5×TBE，核酸染料（goldview）染色后在凝膠分子成像系統(tǒng)（JY04S-3E型）中拍照保存。

1.3 AhMITE引物的篩選

將來源不同的東北王、花育20、商花5、宇花16、開農(nóng)310、冀花13號的花生組DNA以相同比例混合在一起作為DNA模板，對50對AhMITE引物進行特異性篩選[14]，最后篩選出11對多態(tài)性AhMITE引物（表2），用于花生資源的遺傳多樣性分析，其中AhTE0577用于AhMITE反應體系的優(yōu)化。

1.4 AhMITE-PCR反應體系和反應程序優(yōu)化

對影響PCR反應的6個主要因素進行優(yōu)化：①反應體系總量設置5、10、15、20、25、30μL，6個梯度;②TaqPCRMix用量設置1、2、3、4、5、6μL，6個梯度;③ 退火溫度設置56、57、58、59、60、61℃，6個梯度;④循環(huán)次數(shù)設置28、29、30、31、32、33，6個梯度;⑤引物（15μmol/L）用量設置1、2、3、4、5、6μL，6個梯度;⑥模板DNA用量設置5、10、15、20、25、30ng，6個梯度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)擴增的電泳條帶，在NTSYS-pcVersion2.1軟件的ntedit中輸入“1”（有條帶）、“0”（無條帶）、“9”（條帶缺失），使用軟件中的Similarity程序計算花生種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，最后使用Clustering程序基于UPGMA的方法繪制聚類圖。

2 結果與分析

2.1 花生基因組DNA濃度及質(zhì)量檢測

提取的花生組DNA經(jīng)超微量紫外分光光度計檢測，OD260/OD280值在2.0左右;瓊脂糖電泳檢測結果如圖1所示，條帶明亮、整齊、無污染，濃度較高，可以進一步用于后續(xù)試驗。

2.2 AhMITE反應體系的優(yōu)化

2.2.1 反應體系總量和TaqPCRMix用量對PCR擴增的影響 反應體系總量會影響擴增效率，當反應體系總量為5μL時，部分條帶模糊、缺失，而在10～30μL時擴增條帶基本一致（圖2）。當TaqPCRMix用量為1～3μL時，條帶模糊不清，用量為5、6μL時，條帶清晰明亮（圖3）。綜合考慮，反應體系總量選用10μL，TaqPCRMix用量選用5μL。

2.2.2 退火溫度和循環(huán)次數(shù)對PCR擴增的影響

由圖4可見，當退火溫度為56℃和57℃時條帶模糊不清晰，退火溫度為58℃時條帶清晰可見;退火溫度繼續(xù)升高，條帶又變得模糊且亮度減弱。因此，退火溫度選用58℃。由圖5可見，循環(huán)次數(shù)為28～30時，180～190bp的條帶模糊;循環(huán)次數(shù)為31時，180bp的條帶彌散不清楚;循環(huán)次數(shù)為33時，條帶也模糊不清;只有循環(huán)次數(shù)為32時，條帶清晰可見。因此，循環(huán)次數(shù)選用32。

2.2.3 引物和DNA用量對PCR擴增的影響 引物濃度是影響AhMITEPCR擴增效果的重要因素之一。結果（圖6）顯示，當引物（15μmol/L）用量為1μL時條帶模糊，2μL時180、190bp的擴增條帶清晰;超過2μL，隨著引物用量的增加，擴增條帶逐漸模糊、變暗。因此，2μL是最佳引物用量。

結果（圖7）顯示，模板DNA用量為5～20ng時，條帶逐漸變得清晰明亮;DNA用量為25ng和30ng時，條帶明亮程度不變。綜合考慮，選用20ng作為最適模板DNA用量。

2.3 遺傳多樣性分析

從50對AhMITE引物中篩選出重復性好、多態(tài)性高的引物11對，用于對22份花生種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，獲得了較理想的擴增結果（表2）。圖8為以多態(tài)性引物AhTE0254為例的擴增結果。

11對AhMITE引物共擴增出23條帶，多態(tài)性帶21條，多態(tài)性比率為91.3%;每個引物擴增的條帶數(shù)為1～3，平均每個引物擴增1.91條多態(tài)性帶;引物AhTE0622擴增出的帶最多，為3條，其余引物均擴增出2條帶。

2.4 聚類分析

22份花生種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.222～0.957，平均值為0.644。其中，商花511和宇花4的遺傳相似系數(shù)最小，為0.222，二者遺傳距離最遠;白院花9號和花育20的遺傳相似系數(shù)最大，為0.957，二者遺傳距離最近。

在遺傳相似系數(shù)為0.62時，可將22份花生種質(zhì)分為3大類（圖9）：第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類分別包括9、10、3份花生材料。在遺傳相似系數(shù)為0.754時，第Ⅰ大類又可分為兩個亞類，第1亞類包括東北王、白院花9號、吉花9號、I2S2、花育20，第2亞類包括白沙308、宇花16、宇花4、宇花9;第Ⅱ大類在遺傳相似系數(shù)為0.703時也可分為兩個亞類，第1亞類包括花育25、吉花50、阜花22、商花511、宇花5、花育961，第2亞類包括9102、商花5、冀花甜1號、開農(nóng)310。

3 討論與結論

3.1 AhMITE反應體系優(yōu)化

AhMITEPCR反應體系的模板DNA濃度、引物濃度、TaqPCRMix用量和退火溫度等因素都會對擴增結果造成明顯影響，從而影響后續(xù)遺傳多樣性分析的結果;而且不同花生種質(zhì)因基因型差異和環(huán)境影響，其最佳AhMITEPCR反應體系也會存在差異[15]。因此，優(yōu)化AhMITEPCR反應體系對試驗結果起著至關重要的作用。

PCR反應體系總量會影響擴增效率。本試驗結果顯示，反應體系總量過低會導致擴增條帶模糊、缺失，總量在10～30μL時條帶比較清晰、一致。

TaqPCRMix用量過少會導致PCR擴增產(chǎn)物不足，用量過多則會導致非特異性擴增產(chǎn)物增多且增加檢測成本[16]。本試驗結果表明，TaqPCRMix用量為1μL和2μL時，出現(xiàn)擴增條帶缺失現(xiàn)象;隨用量增加，逐漸出現(xiàn)清晰條帶，當用量為5μL和6μL時條帶清晰明亮，效果最佳。

引物濃度過高會導致不匹配和非特異性擴增，而過低則導致無法進行有效擴增;模板DNA濃度過高會使引物或dNTP過早耗盡，導致非特異性擴增，而過低則會導致反應產(chǎn)物減少、擴增條帶變?nèi)鮗17]。本試驗結果表明，當15μmol/L引物用量低于或超過2μL時，擴增條帶模糊、發(fā)暗，用量2μL時擴增條帶最清晰;在5～20ng范圍內(nèi)，隨著模板DNA用量的增大，擴增條帶清晰度增加，15～30ng時條帶清晰度無明顯差別，與前人研究結果[18，19]基本一致。

退火溫度對PCR擴增結果也有較大影響。在一定范圍內(nèi)，退火溫度高時擴增產(chǎn)物的特異性較好，退火溫度較低則會導致模板DNA與引物的非特異性結合[20]。本試驗結果表明，退火溫度為58℃時條帶清晰，低于或高于該溫度時擴增條帶均模糊，呈現(xiàn)出低則結合率低、高則抑制的現(xiàn)象。循環(huán)次數(shù)亦如此，僅當循環(huán)32次時可得到清晰條帶。這與徐雯等[21]的研究結果基本一致。

綜合考慮成本和時間等問題，最終確定AhMITEPCR的最佳反應體系為：反應總體積10μL，模板DNA20ng，15μmol/L引物2μL，TaqPCRMix5μL。擴增程序為：95℃預變性3min;95℃變性30s，58℃退火40s，72℃延伸30s;共循環(huán)32次;4℃保存。

3.2 22份花生種質(zhì)材料的遺傳多樣性分析

目前花生中應用MITE標記進行的研究多是基于Shirasawa等[22]開發(fā)的AhMITE1標記進行的，根據(jù)標記在特定位點的插入或缺失判斷PCR產(chǎn)物多態(tài)性[23，24]。本研究選用Shirasawa等[22]開發(fā)的50對引物，并從中篩選到11對多態(tài)性引物，對22份花生種質(zhì)進行檢測，結果共擴增出23條帶，多態(tài)性條帶21條，多態(tài)性比例為91.3%，每個引物平均擴增的多態(tài)性條帶為1.91條，多態(tài)性較高，表明這些引物可以用于對不同來源花生種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。本試驗供試材料間的遺傳相似系數(shù)在0.222～0.957之間，平均值為0.644，具有比較豐富的遺傳多樣性，這與白冬梅[25]、侯睿[26]等的研究結果類似。聚類分析結果表明，在遺傳相似系數(shù)0.62處可將22份花生種質(zhì)分為3大類，其中，商花511和宇花4的遺傳相似系數(shù)最?。?.222），親緣關系較遠;白院花9號和花育20的遺傳相似系數(shù)最大（0.957），說明兩者親緣關系較近，也可能是由于AhMITE引物對兩花生材料沒有特異性。

綜合上述分析，優(yōu)化后的AhMITE反應體系能夠擴增出清晰的多態(tài)性條帶，可用于不同來源花生種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。開發(fā)更多AhMITE標記對于進一步促進花生分子輔助育種水平及加快新品種選育進程具有重要意義。