王暉 王敬 高妍夏 楊帆 馬寶俊 谷苗 張乘云 薛翠翠 謝巖

摘要：本研究對(duì)家蠶中腸、脂肪體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析SSR位點(diǎn)的分布規(guī)律和特征。結(jié)果表明，從17915個(gè)Unigene中共檢測(cè)到1339個(gè)SSR位點(diǎn)，分布在960個(gè)Unigene中。SSR位點(diǎn)的基序長(zhǎng)度以1bp為主，隨著基序長(zhǎng)度的增加，SSR位點(diǎn)數(shù)量逐漸減少，SSR位點(diǎn)間的距離和平均長(zhǎng)度逐漸增加。家蠶SSR單核苷酸基序類型以A/T為主，占總基序數(shù)量的53.10%。SSR位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)主要集中在5～12次，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的87.60%，其中單核苷酸重復(fù)10次的SSR位點(diǎn)最多，共有368個(gè)。家蠶轉(zhuǎn)錄組SSR基序長(zhǎng)度分布范圍為10～688bp，高度多態(tài)性SSR位點(diǎn)（長(zhǎng)度≥ 20bp）有253個(gè)，占比18.89%。960個(gè)Unigene中分別有125、122個(gè)在GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中得到功能注釋，主要包括蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合、剪接體、代謝途徑等通路。隨機(jī)選擇20對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)19條引物擴(kuò)增成功。

關(guān)鍵詞：家蠶;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）;特征分析

中圖分類號(hào)：S881.2+6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2022）01-0014-07

家蠶作為目前唯一被人類完全馴化的無(wú)脊椎動(dòng)物，具有生長(zhǎng)周期短、經(jīng)濟(jì)效益好等優(yōu)點(diǎn)。中國(guó)家蠶養(yǎng)殖歷史悠久，古代中國(guó)的家蠶通過(guò)絲綢之路傳播，逐漸演化出許多地方品系，之后傳播到歐洲、東亞、南亞等國(guó)家，并形成當(dāng)?shù)靥赜衅贩N[1]。目前國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的家蠶品系可分為中系、日系等，中系家蠶品種主要有菁松、新松、蘇春、浙蕾甲等，日系家蠶品種主要有皓月、東肥、白云、玉種等[2]。此外，還有一些特色地方品種，如孝豐17號(hào)、安吉7號(hào)、余杭11等;一部分由引進(jìn)的日系品種改良選育而成的新品種，如蘇7、蘇10、蘇14等[3]。由于家蠶品系、品種、雜交種眾多，根據(jù)形態(tài)特征已難以進(jìn)行準(zhǔn)確的種間鑒定。

分子標(biāo)記是能反映生物基因組差異的特異性的DNA片段，由于具有位點(diǎn)數(shù)量多、多態(tài)性高、檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)單快捷等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物品種選育、物種親緣關(guān)系鑒定、基因定位等領(lǐng)域[4]。目前已報(bào)道的分子標(biāo)記主要有RFLP（限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性）、RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）、SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列）等。SSR為目前最常用的分子標(biāo)記，基于基因組或轉(zhuǎn)錄組序列信息開(kāi)發(fā)，可分為基因組SSR標(biāo)記和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（EST-SSR）標(biāo)記。EST-SSR標(biāo)記在團(tuán)頭魴[5]、文蛤[6]、螞蟥[7]、紅腹錦雞[8]、綿羊[9]等物種的種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳多樣性分析、QTL定位方面已有報(bào)道。基于不同的家蠶品種，AFLP[10]、RAPD[11]、SSR[12]分子標(biāo)記均表現(xiàn)出較好的鑒別力。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和成本的降低，從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中可以挖掘出更多的SSR分子標(biāo)記。

本研究選擇代表性家蠶品種，獲得家蠶重要的消化（中腸）、免疫器官（脂肪體）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中的SSR位點(diǎn)進(jìn)行篩選和分析，研究其分布規(guī)律，并通過(guò)設(shè)計(jì)引物，初步驗(yàn)證SSR標(biāo)記的有效性，以期為家蠶品種鑒定提供有效的分子標(biāo)記工具。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年6月將家蠶品種‘東肥‘彩3‘彩4‘菁松×皓月幼蟲飼養(yǎng)于溫度（25±2）℃、濕度60% ～70%和自然光周期的環(huán)境中。7月份解剖‘東肥與‘彩4蠶體（5齡最后一天、預(yù)蛹期、排凈糞便），分離得到中腸、脂肪體組織，迅速投入液氮中，保存于-80℃，送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SSR位點(diǎn)分析 采用MISA程序（1.0版，http：//pgrc.ipkgatersleben.de/misa/misa.html）檢測(cè)基因的SSR位點(diǎn)，參數(shù)設(shè)置默認(rèn)，1、2、3、4、5、6個(gè)unitsize的最少重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5、5，統(tǒng)計(jì)不同SSR類型在轉(zhuǎn)錄本（Unigene）中的分布規(guī)律。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 使用動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，D1700）提取4種家蠶蠶體的DNA，NanoDrop2000檢測(cè)DNA濃度和純度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，-20℃保存?zhèn)溆谩＿x擇與家蠶抗氧化途徑相關(guān)的、含有SSR位點(diǎn)的重要基因，采用Primer3設(shè)計(jì)引物。PCR反應(yīng)體系：DNA0.2μL，引物F、R（10μmol/L）各0.8μL，2×ReactionMix10μL，Taq酶0.4μL，ddH2O8.2μL。擴(kuò)增程序：94℃ 3min;94℃ 30s，55℃ 30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán);72℃ 10min。反應(yīng)結(jié)束后，采用2.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用MicrosoftExcel2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，OriginPro2021b軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶SSR位點(diǎn)數(shù)量與分布

從家蠶的脂肪體和中腸共檢測(cè)到1339個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于960個(gè)Unigene，平均每個(gè)Unigene含有1.39個(gè)SSR位點(diǎn);192個(gè)Unigene含有1個(gè)以上SSR位點(diǎn)，SSR發(fā)生頻率和出現(xiàn)頻率分別為5.35%、7.47%;每10kb長(zhǎng)度序列包含1.53個(gè)SSR位點(diǎn)（表1）。SSR位點(diǎn)的基序長(zhǎng)度以1bp為主;基序長(zhǎng)度為1、3bp時(shí)，SSR位點(diǎn)總長(zhǎng)度較大;隨著基序長(zhǎng)度繼續(xù)增加，SSR位點(diǎn)數(shù)量大幅減少，位點(diǎn)間的平均距離和平均長(zhǎng)度總體呈增加趨勢(shì)（表2）。

2.2 家蠶轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)基序類型

家蠶SSR位點(diǎn)基序類型共有66種，從單核苷酸至六核苷酸均含有多種基序類型。單核苷酸基序類型以A/T為主，占總基序數(shù)量的53.10%，C/G基序出現(xiàn)頻率很低;二核苷酸基序類型有8種，以AC/GT為主;三核苷酸基序類型有20種，以CCG/CGG為主;四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸基序類型分別有12、8、14種，分別以AAAT/ATTT、ACAGG/CCTGT、ACCGAG/CGGTCT為主要類型（圖1）。

2.3 家蠶轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)基序長(zhǎng)度分布特征

家蠶轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)與基序類型相關(guān)，單核苷酸的重復(fù)次數(shù)主要范圍為10～17次，二核苷酸的重復(fù)次數(shù)主要范圍為6～10次，三核苷酸的重復(fù)次數(shù)主要范圍為5～7次，四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的重復(fù)次數(shù)以5次為主。SSR位點(diǎn)的重復(fù)數(shù)主要集中在5～12次，占總SSR位點(diǎn)數(shù)的87.60%，其中單核苷酸重復(fù)10次的SSR位點(diǎn)最多，共有368個(gè);其次為三核苷酸重復(fù)5次，有245個(gè)（圖2）。

家蠶轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)基序長(zhǎng)度分布范圍為10～688bp，低度多態(tài)性的SSR位點(diǎn)（長(zhǎng)度范圍10～11bp）有469個(gè);中度多態(tài)性的SSR位點(diǎn)（長(zhǎng)度范圍12～19bp）有617個(gè);高度多態(tài)性SSR位點(diǎn)（長(zhǎng)度≥ 20bp）有253個(gè)，占比18.89%（圖3）。

2.4 含有SSR位點(diǎn)的Unigene的GO、KEGG功能注釋

960個(gè)Unigene中分別有125、122個(gè)在GO、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中得到功能注釋。GO注釋結(jié)果中，分別有47、12、11個(gè)Unigene注釋到蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合、核酸結(jié)合通路（圖4A）;KEGG注釋結(jié)果中，分別有11、10、7、7個(gè)Unigene注釋到剪接體、代謝途徑、內(nèi)吞作用、核糖體生物合成通路（圖4B）。

2.5 SSR引物的有效性與多態(tài)性分析

隨機(jī)選擇含有不同長(zhǎng)度SSR位點(diǎn)的Unigene設(shè)計(jì)20對(duì)引物（表3），以4個(gè)家蠶品種進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)19條引物在至少1個(gè)家蠶品種中擴(kuò)增出條帶，7條引物在4個(gè)家蠶品種中均擴(kuò)增出條帶（圖5），說(shuō)明引物擴(kuò)增性較好。

3 討論與結(jié)論

家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，在基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究中發(fā)揮著重要作用。人工的不斷選育、馴化使家蠶品種多樣、性狀特異，是昆蟲中遺傳資源保存最為豐富的物種之一。前人研究已經(jīng)證實(shí)，微衛(wèi)星DNA在昆蟲的基因組中廣泛存在。

通過(guò)高通量測(cè)序獲得的Unigene和SSR位點(diǎn)數(shù)量表現(xiàn)出種間特異性。本研究以家蠶中腸、脂肪體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共組裝得到17915條Unigene，其中960個(gè)Unigene上共檢測(cè)到1339個(gè)SSR位點(diǎn)。意大利蜜蜂幼蟲腸道轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得12115條Unigene，其中2149條Unigene上分布6312個(gè)SSR位點(diǎn)[13]。麥紅吸漿蟲唾腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)只組裝得到1047條Unigene，檢索到141個(gè)SSR位點(diǎn)[14]。SSR位點(diǎn)基序類型重復(fù)次數(shù)的多少與軟件種類、軟件設(shè)置、物種、樣品類型有關(guān)。常用的SSR位點(diǎn)檢測(cè)軟件有MISA、MSATCOMMANDER等。本研究中使用MISA軟件檢測(cè)家蠶SSR位點(diǎn)，檢測(cè)條件設(shè)置從單核苷酸至六核苷酸，單核苷酸的重復(fù)次數(shù)最多。當(dāng)MISA軟件設(shè)置只檢測(cè)二核苷酸至六核苷酸時(shí)，意大利蜜蜂幼蟲腸道轉(zhuǎn)錄組中二核苷酸SSR位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)最多[13]。即使設(shè)置條件一致，軟件、物種不同，重復(fù)次數(shù)最多的SSR位點(diǎn)基序類型也不相同，MSATCOMMANDER軟件檢測(cè)桔小實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)三核苷酸SSR位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)最多[15]。

許多昆蟲轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)研究表明，單核苷酸重復(fù)是占比最高的重復(fù)類型。通常來(lái)說(shuō)，A/T既是單核苷酸重復(fù)中的優(yōu)勢(shì)類型，也是所有重復(fù)類型的優(yōu)勢(shì)類型，但所占比例因物種不同而不同。家蠶中腸、脂肪體SSR位點(diǎn)基序A/T類型占總基序數(shù)量的53.10%;梨小食心蟲幼蟲中腸轉(zhuǎn)錄組中A/T出現(xiàn)頻率可達(dá)79.82%[16];在窄足真蚋中則高達(dá)86.93%[17];麥紅吸漿蟲唾腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中A/T只占31.21%[14]。本研究發(fā)現(xiàn)家蠶中腸、脂肪體中三核苷酸重復(fù)是僅次于單核苷酸重復(fù)的類型，占比27.56%，這可能與三核苷酸更容易留在編碼區(qū)并且不會(huì)引起編碼框移碼有關(guān)[18]。

在雙翅目昆蟲中，AC/GT是二核苷酸優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型[17]。鱗翅目中的粘蟲[19]、小菜蛾、煙草天蛾、棉鈴蟲[20]的二核苷酸優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型也是AC/GT，與本研究結(jié)果一致;印度谷螟[21]、帝王蝶、菜粉蝶[19]則是AT/AT。說(shuō)明，鱗翅目昆蟲的二核苷酸優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型與物種相關(guān)，沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的分類學(xué)層面特征。

雖然轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)的SSR多態(tài)性通常低于基因組SSR，但其成本更低、技術(shù)成熟，更容易開(kāi)發(fā)大量可用的SSR分子標(biāo)記。本研究隨機(jī)選擇了20對(duì)引物，對(duì)4種家蠶進(jìn)行了種間檢測(cè)與驗(yàn)證，初步證實(shí)這些引物擴(kuò)增性較好，為下一步大規(guī)模開(kāi)發(fā)SSR分子標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。