張永曉，李英華（衡水市人民醫(yī)院 血液內(nèi)科，河北 衡水 053000）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一種異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以細(xì)胞減少為特征并伴有轉(zhuǎn)化為急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）的危險[1-2]。miRNA 是一類長度為18～22 個核苷酸的非編碼微小RNA，通過與3′UTR不完全堿基互補配對在轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致靶基因mRNA 的翻譯阻滯[3-4]。miRNA 廣泛參與人類多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，其中包括MDS[5-6]。miR-17-5p作為miR-17家族成員之一，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤、AML 和MDS 等多種腫瘤的進(jìn)展[7-9]。有研究結(jié)果[10]顯示，含SET結(jié)構(gòu)域蛋白2（SET domain containing 2，SETD2）參與AML的發(fā)病機(jī)制，雖其在MDS 中的作用也有相關(guān)報道，但其潛在的調(diào)控機(jī)制仍尚未明了。本課題觀察MDS 患者骨髓中miR-17-5p 和SETD2 的表達(dá)，探討MDS 細(xì)胞SKM-1中干預(yù)miR-17-5p、過表達(dá)SETD2、干預(yù)SETD2 處理后細(xì)胞的增殖與凋亡水平，以揭示miR-17-5p 調(diào)控MDS細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制，為臨床MDS的精準(zhǔn)治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本、細(xì)胞系及主要試劑

收集2019 年3 月至2021 年5 月衡水市人民醫(yī)院就診的35例MDS患者的骨髓組織標(biāo)本，患者確診依據(jù)為《骨髓增生異常綜合征中國診斷與治療指南》（2019 年版），標(biāo)記為MDS 組，所有患者均為未進(jìn)行任何治療的初診原發(fā)性MDS。同時收集35 例健康體檢者的骨髓組織標(biāo)本，標(biāo)記為對照組。所有標(biāo)本采集前均告知患者并簽署知情同意書。MDS細(xì)胞系SKM-1來自本醫(yī)院。

CCK-8 試劑盒購自日本同仁公司，Annexin Ⅴ/FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自日本TaKaRa 公司，LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔抗SETD2、cleaved caspase-3（C-caspase-3）、C-caspase-9 抗體購自上海艾博抗（Abcam）貿(mào)易有限公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自北京博爾西科技有限公司，實驗中所有引物、核酸序列均由上海吉瑪基因股份有限公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染

將SKM-1細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)液。

將培養(yǎng)48 h的SKM-1細(xì)胞分為NC組（不做任何處理）、si-miR-17-5p 組（轉(zhuǎn)染si-miR-17-5p mimic）、si-miR-CN 組（轉(zhuǎn)染si-miR-CN）、miR-17-5p 組（轉(zhuǎn)染miR-17-5p mimic）、miR-CN 組（轉(zhuǎn) 染miR-NC）、pcDNA 組（轉(zhuǎn)染pcDNA）、pcDNA-SETD2 組（轉(zhuǎn)染pcDNA-SETD2）、si-SETD2 組（轉(zhuǎn)染siSETD2）、si-NC（轉(zhuǎn)染siRNA）、si-miR-17-5p+si-CN 組（共轉(zhuǎn)染si-miR-17-5p 和si-CN）、si-miR-17-5p+si-SETD2 組（共轉(zhuǎn)染 si-miR-17-5p和si-SETD2）。按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書方法，將各個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SKM-1 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染12 h 時更換新鮮培養(yǎng)液。qPCR 或WB 實驗檢測轉(zhuǎn)染效率，確定轉(zhuǎn)染成功后方可進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3 qPCR法檢測SKM-1細(xì)胞中miR-17-5p 和SETD2 mRNA的表達(dá)

用RNA抽提試劑盒提取各組待檢測細(xì)胞中總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用qPCR試劑盒檢測cDNA中miR-17-5p、SETD2 mRNA的表達(dá)水平。引 物 序 列:miR-17-5p F 為5′-TCTAGATCCCGA GGACTG-3′，R為5′-ATCGTGACCTGAACC-3′；SETD2 F 為5′-AACGGGAGGCTCAGAAACAA-3′，R 為5′-GTGGGTAACCAGCAAAGGGA-3′；U6 F 為5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′，R 為5′ -CCAAGC TTATGACAGCCATCATC -3′ ；GAPDH F 為 5′-TGAGATCAACGTGTTCCAGTG-3′，R 為5′-ACC AGATGAAATG TGCCCC-3′。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共進(jìn)行41個循環(huán)；最后72 ℃保持5 min。以U6、GAPDH 為內(nèi)參，以2-△△Ct法計算miR-17-5p 和SETD2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 WB 法檢測SKM-1 細(xì)胞中SETD2、C-caspase-3和C-caspase-9的表達(dá)

取各組對數(shù)生長期細(xì)胞，用RIPA 細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白。對蛋白進(jìn)行定量、變性處理，離心取上清用于蛋白電泳上樣，進(jìn)行10%SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含有2.5%脫脂奶粉的封閉液37 ℃下處理2 h。將PVDF膜浸入稀釋的兔抗SETD2（1∶1 000）、C-caspase-3（1∶1 000）、C-caspase-9（1∶1 500）、β-actin（1∶800）一抗中，4 ℃下處理過夜。次日，充分清洗后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶500），37 ℃下處理2 h。清洗后，用ECL電化學(xué)發(fā)光法顯影、曝光。ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 CCK-8法檢測SKM-1細(xì)胞的增殖能力

將各組細(xì)胞密度調(diào)整至1×105個/mL，取100 μL加入96 孔板中，依次加入20 μL CCK-8 溶液，分別在24、48和72 h時，上酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處每孔的光密度（D）值，以D值表示細(xì)胞的增殖能力。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測SKM-1細(xì)胞的凋亡水平

將各組細(xì)胞用600 μL 結(jié)合緩沖液懸浮后，依次加入Annexin Ⅴ/FITC、PI染色液各5 μL，避光下放置20 min 后，快速上流式細(xì)胞儀檢測SKM-1 細(xì)胞的凋亡率。細(xì)胞總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-17-5p 與SETD2的靶向關(guān)系

通過TargetScan 軟件預(yù)測miR-17-5p 與SETD2之間存在的互補結(jié)合位點。將含有野生型（WT）或突變型（MUT）SETD2 3'UTR 中含miR-17-5p 結(jié)合位點的核苷酸序列克隆到pGL3 熒光素酶報告質(zhì)粒載體。將對數(shù)生長期SKM-1細(xì)胞接種在24孔板（2×105個/孔），然 后 用LipofectamineTM3000 將miR-17-5p mimic、miR-NC 與WT 或MUT報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至SKM-1 細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，使用雙熒光素酶試劑盒測定細(xì)胞的熒光活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

qPCR、WB、CCK-8 和流式細(xì)胞術(shù)等實驗均重復(fù)3 次。采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用獨立樣本t檢驗，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，miR-17-5p與SETD2 mRNA表達(dá)之間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05或P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDS 骨髓組織中miR-17-5p 高表達(dá)而SETD2 mRNA低表達(dá)

qPCR 和WB 法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，MDS 骨髓組織中miR-17-5p 表達(dá)水平顯著升高（11.65±4.69vs1.00±0.32，t=13.403，P<0.01），SETD2 mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著降低（0.41±0.22vs1.00±0.34，t=8.619，P<0.01；0.21±0.07vs0.68±0.14，t=9.008，P<0.01；圖1A）。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果（圖1B）顯示，MDS骨髓組織中miR-17-5p 表達(dá)與SETD2 mRNA表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.546，P<0.01）。

圖1 MDS骨髓組織中SETD2表達(dá)（A）和miR-17-5p與SETD2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析（B）

2.2 干擾miR-17-5p可抑制SKM-1細(xì)胞的增殖能力

CCK-8 法檢測結(jié)果顯示，與NC 組和si-miR-NC組相比，si-miR-17-5p 組SKM-1 細(xì)胞中miR-17-5p表達(dá)顯著降低（0.24±0.05vs1.00±0.07、0.98±0.12，F(xiàn)=234.349，P<0.01）；在轉(zhuǎn)染24、48 和72 h 時，細(xì)胞增殖能力均顯著降低（t24h：0.32±0.04vs0.39±0.04、0.38±0.05，F(xiàn)=6.789，P<0.01；t48h：0.45±0.05vs0.67±0.08、0.65±0.06，F(xiàn)=31.968，P<0.01；t72h：0.73±0.09vs1.12±0.13、1.14±0.14，F(xiàn)=32.348，P<0.01）。結(jié)果表明，干擾miR-17-5p 表達(dá)可顯著降低SKM-1 細(xì)胞的增殖能力。

2.3 干擾miR-17-5p可誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與NC 組和si-miR-NC組相比，si-miR-17-5p 組SKM-1 細(xì)胞凋亡率顯著升高[（13.36±2.54）%vs（3.26±0.60）%、（3.46±0.69）%，F(xiàn)=123.533，P<0.01 ；圖2A] 。WB法檢測結(jié)果顯示，si-miR-17-5p 組SKM-1細(xì)胞中C-caspase-3、C-caspase-9 表達(dá)水平顯著升高（0.37±0.05vs0.15±0.03、0.13±0.04，F(xiàn)=95.760，P<0.01；0.43±0.07vs0.08±0.03、0.11±0.04，F(xiàn)=137.311，P<0.01；圖2B）。結(jié)果表明，干擾miR-17-5p表達(dá)可誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞凋亡。

圖2 干擾miR-17-5p對SKM-1細(xì)胞凋亡（A）及其相關(guān)蛋白表達(dá)（B）的影響

2.4 miR-17-5p靶向調(diào)控SETD2表達(dá)

通過預(yù)測軟件TargetScan 預(yù)測到miR-17-5p 與SETD2之間存在連續(xù)6個互補的核苷酸結(jié)合位點（圖3A）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果（圖3B）顯示，與miR-NC 組相比，轉(zhuǎn)染miR-17-5p mimic 后，WT 組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（t=13.389，P<0.01），而MUT組細(xì)胞的熒光素酶活性變化不顯著（t=0.651，P>0.05）。WB 法檢測結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，miR-17-5p mimic組細(xì)胞中SETD2蛋白表達(dá)顯著降低（0.06±0.01vs0.24±0.05，t=10.590，P<0.01）；與si-miRNC組相比，si-miR-17-5p mimic組細(xì)胞中SETD2蛋白表達(dá)顯著升高（0.43±0.07vs0.21±0.05，t=7.672，P<0.01；圖3C）。結(jié)果表明，miR-17-5p 靶向負(fù)調(diào)控SETD2蛋白的表達(dá)。

圖3 SKM-1細(xì)胞中miR-17-5p靶向調(diào)控SETD2的表達(dá)

2.5 過表達(dá)SETD2 可降低SKM-1 細(xì)胞的增殖活力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染pcDNA-SETD2后，WB、CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果（表1和圖4）顯示，與NC組和pcDNA組相比，pcDNA-SETD2組SKM-1細(xì)胞中SETD2 蛋白表達(dá)顯著升高（均P<0.01），轉(zhuǎn)染后24、48和72 h時細(xì)胞增殖活力均顯著降低（均P<0.01）、細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01），細(xì)胞中C-caspase-3 和C-caspase-9 表達(dá)均顯著升高（均P<0.01）。結(jié)果表明，過表達(dá)SETD2 可明顯降低SKM-1細(xì)胞的增殖能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

表1 過表達(dá)SETD2對SKM-1細(xì)胞增殖、凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 過表達(dá)SETD2對SKM-1細(xì)胞凋亡（A）及SETD2、C-caspase-9和C-caspase-3表達(dá)（B）的影響

2.6 沉默SETD2 可部分逆轉(zhuǎn)干擾miR-17-5p 對SKM-1細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用

轉(zhuǎn)染si-miR-17-5p后，WB、CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果（表2和圖5）顯示，與si-miR-NC組相比，si-miR-17-5p 組細(xì)胞中SETD2 蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）；在24、48和72 h時細(xì)胞的增殖能力均顯著降低（均P<0.01），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01），細(xì)胞中C-caspase-3 和C-caspase-9 表達(dá)均顯著升高（均P<0.01）；與si-miR-17-5p+si-NC組相比，si-miR-17-5p+si-SETD2組細(xì)胞中SETD2蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），在24、48、72 h 細(xì)胞增殖能力均顯著升高（均P<0.01），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.01），C-caspase-3 和C-caspase-9 表達(dá)均顯著降低（均P<0.01）。結(jié)果表明，沉默SETD2 可部分逆轉(zhuǎn)干擾miR-17-5p對SKM-1細(xì)胞的增殖抑制、凋亡促進(jìn)作用。

圖5 同時干擾SETD2和miR-17-5p對SKM-1細(xì)胞凋亡（A）及其相關(guān)蛋白表達(dá)（B）的影響

表2 同時干擾SETD2和miR-17-5p對SKM-1細(xì)胞增殖和凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

MDS是一種以造血功能低下為特征的克隆性干細(xì)胞疾病，具有向AML 轉(zhuǎn)化的高風(fēng)險[11]。miRNA 在多種腫瘤中作為抑癌基因或致癌基因發(fā)揮其作用，調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡[12-14]，也可能在MDS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近期的研究結(jié)果[15]顯示，miR-17-5p作為lncRNA HOTAIR 在AML 中表達(dá)異常升高并促進(jìn)AML細(xì)胞的分化，其機(jī)制為靶向抑制下游miR-17-5p表達(dá)而上調(diào)p21。HE等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-17/20a參與缺氧誘導(dǎo)因子1 介導(dǎo)的MDS 細(xì)胞的分化過程。VASILATOU 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p 在高危MDS患者中的表達(dá)水平顯著高于低危MDS 患者，并且其表達(dá)水平與MDS患者的總生存率有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p 在MDS 骨髓組織中高表達(dá)，這與前述研究者的研究結(jié)論相一致。為了探究miR-17-5p參與MDS 發(fā)展的調(diào)控機(jī)制，研究者[18]還檢測了干擾miR-17-5p表達(dá)對MDS細(xì)胞增殖與凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾miR-17-5p 表達(dá)顯著抑制MDS 細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時還下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白C-caspase-3和C-caspase-9的表達(dá)。研究結(jié)果揭示了miR-17-5p 在MDS 發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SETD2 在MDS 中作為miR-17-5p的靶基因而表達(dá)失調(diào)，這也許與miR-17-5p 在MDS中的調(diào)控作用存在一定的相關(guān)性。

MDS 發(fā)展為AML 與基因突變有關(guān)。據(jù)報道[18]，含有2 個SETD2 變異體的SET 結(jié)構(gòu)域為AML 患者預(yù)后不良的危險因素。但是SETD2 在MDS 中的作用機(jī)制仍有待深入研究。LI 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，SETD2基因低表達(dá)與MDS 患者不良預(yù)后密切相關(guān)，并且其可通過上調(diào)骨髓細(xì)胞中散亂蛋白3的表達(dá)促進(jìn)MDS轉(zhuǎn)化為AML。CHEN 等[20]也報道，SETD2 在MDS 中低表達(dá)與患者生存期縮短顯著相關(guān)，其具有促進(jìn)MDS 向AML 轉(zhuǎn)化的功能，提示SETD2 是治療MDS轉(zhuǎn)化為AML 的潛在靶點。上述研究結(jié)果均表明，SETD2 在MDS 中扮演致病基因的角色。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SETD2 在MDS 中呈顯著低表達(dá)，這與上述研究者的研究結(jié)果相一致。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SETD2的MDS細(xì)胞增殖能力顯著下降、凋亡能力明顯增強(qiáng)，而沉默SETD2 卻可以顯著逆轉(zhuǎn)干擾miR-17-5p 對MDS 細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。研究結(jié)果說明，不僅miR-17-5p 可負(fù)向調(diào)控SETD2在MDS 組織中的表達(dá)，SETD2 也具有逆向調(diào)控miR-17-5p表達(dá)的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明MDS骨髓中miR-17-5p高表達(dá)，其作用是調(diào)控MDS 細(xì)胞的增殖與凋亡能力，產(chǎn)生這種作用的機(jī)制與miR-17-5p 靶向負(fù)調(diào)控SETD2相關(guān)，此結(jié)果為MDS的治療提供了新的靶點。