呂微，賈云瀧，王佳麗，劉天旭，段玉青，劉麗華，2，3（.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 腫瘤免疫治療科，河北石家莊 050035；2.河北省腫瘤研究所，河北 石家莊 0500；3.河北醫(yī)科大學(xué) 國際合作研究干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 0500）

卵巢癌在全球婦科惡性腫瘤中發(fā)病率居第三位，病死率居第一位，最常見的病理類型是上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）[1-4]。約80%的EOC 患者確診時(shí)已為晚期（Ⅲ/Ⅳ期），患者5 年生存率僅30%[5-7]。目前，參與EOC 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍不明確，制約著新型藥物的研發(fā)及新治療策略的確立。橋接整合因子1（bridging intergrator 1，BIN1）是一種與MYC 相互作用的接頭蛋白，具有抑瘤作用，在多種類型腫瘤中低表達(dá)[8-11]。本課題組前期研究結(jié)果[12-17]表明，BIN1可以通過NF-κB途徑降低非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細(xì)胞的侵襲與遷移能力，通過AKT-mTOR通路誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞周期阻滯，還可以抑制PD-L1介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸；BIN1 通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯而抑制食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell cancer，ESCC）細(xì)胞的增殖。然而，目前尚少見BIN1 在EOC 中的研究報(bào)道。本研究檢測(cè)BIN1在EOC組織中的表達(dá)，明確其表達(dá)與EOC 患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)聯(lián)，并觀察過表達(dá)BIN1 對(duì)卵巢癌A2780 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，旨在為闡明BIN1在EOC發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017 年7 月至2018 年1 月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院手術(shù)切除的67例EOC患者的腫瘤組織，所有腫瘤組織均經(jīng)2 名以上病理醫(yī)師確診為EOC。患者年齡22～70 歲。術(shù)后病理分期：Ⅰ+Ⅱ期20 例，Ⅲ+Ⅳ期47 例；組織學(xué)分級(jí)：中、高分化25 例，低分化42例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：43 例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，24 例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；腹膜轉(zhuǎn)移：27例有腹膜轉(zhuǎn)移，40例無腹膜轉(zhuǎn)移。同期收集了因其他婦科疾病而手術(shù)切除的30例非腫瘤卵巢組織作為對(duì)照組。所有組織離體后迅速置于液氮中，-80 ℃保存。患者術(shù)前均被告知并簽署知情同意書。本研究方案征得所在醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞系及主要試劑

人EOC 細(xì)胞A2780、SKOV3 和人卵巢上皮細(xì)胞IOSE80均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。胎牛血清購自美國Gemini 公司，DMEM 培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自美國Gibco 公司，TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑和SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑均購自美國Thermo Fisher 公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司，Transwell小室購自美國康寧公司，CCK-8試劑盒購自北京索萊寶公司，引物由上海生物工程有限公司合成，質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，真核表達(dá)重組質(zhì)粒CMV-MCS-GFPSV40-Neomycin-BIN1 和空載體質(zhì)粒CMV-MCSGFP-SV40-Neomycin 均購自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，鼠抗人BIN1 單克隆抗體購自Merck Millipore 公司，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗鼠二抗購自美國Abcam公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組

SKOV3、A2780 細(xì)胞和IOSE80 細(xì)胞均在含1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取生長狀況良好的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書的步驟，將BIN1過表達(dá)質(zhì)粒CMV-MCS-GFPSV40-Neomycin-BIN1(CMV-BIN1）和空載體質(zhì)粒CMV-MCS-GFP-SV40-Neomycin（CMV-NC）轉(zhuǎn)染至A2780 細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組（NC 組）、BIN1過表達(dá)組（CMV-BIN1組）和空載體質(zhì)粒組（CMV-NC組）。培養(yǎng)6～8 h 后，更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)EOC 組織及非腫瘤卵巢組織中BIN1陽性表達(dá)率

將石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，加入BIN1（1∶200）抗體4 ℃過夜。次日，加入二抗工作液和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，復(fù)染，脫水，封片。每個(gè)標(biāo)本均隨機(jī)選擇5個(gè)視野（×200）計(jì)算：（1）陽性細(xì)胞百分率計(jì)分：<25%為0 分，25%～<50%為1 分，50%～<75%為2 分，≥75%為3分；（2）按照陽性細(xì)胞染色程度計(jì)分：無顯色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述2項(xiàng)得分相加，0分為“-”，1～2分為“+”，3～4分為“++”，5～6 分為“+++”，將“++”和“+++”判定為陽性表達(dá)，將“-”和“+”判定為陰性表達(dá)。

1.5 qPCR 法檢測(cè)EOC 細(xì)胞中BIN1 mRNA 的表達(dá)水平

用TRIzol提取EOC細(xì)胞的總RNA。將RNA濃度稀釋至500 ng/mL，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA作為模板擴(kuò)增BIN1 及內(nèi)參。引物序列：BIN1 上游為5'-CAAGTCCCCATCTCAGCCAG-3'，下游為5'-GGATCA CCAGCACCACATCA-3'；GAPDH 上游為5'-GTCACC TTCACCGTTCCAGTTTT-3'，下游為 5'-CTTAGT TGCGTTACACCCTTTCTT-3'。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃10 min；95 ℃15 s，59 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)。根據(jù)每孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)作為Ct 值，以2-ΔΔCt法計(jì)算BIN1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 WB法檢測(cè)EOC細(xì)胞中BIN1蛋白的表達(dá)水平

取A2780、SKOV3 細(xì)胞及IOSE80 細(xì)胞分別加入細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑，提取總蛋白。BCA 法定量蛋白后，進(jìn)行SDS-PAGE 分離蛋白，以濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF 膜，在5%脫脂牛奶中 在室溫下封閉60 min。加入抗BIN1（1∶2 000）、抗GAPDH（1∶2 500）抗體，4 ℃過夜。TBST清洗膜3次（15 min/次），加入HRP 標(biāo)記的兔抗鼠二抗（1∶1 000），室溫處理60 min；TBST清洗膜后滴加ECL發(fā)光液顯影，以GAPDH 為內(nèi)參，用ImageJ 軟件分析蛋白條帶的灰度值，并計(jì)算BIN1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 CCK-8 法檢測(cè)過表達(dá)BIN1 對(duì)A2780 細(xì)胞增殖的影響

將各組A2780細(xì)胞消化后按照每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72、96 h后，向每孔加入10 μL CCK-8試劑，4 h后上酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔波長450 nm處的光密度（D）值，并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.8 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)BIN1 對(duì)A2780 細(xì)胞遷移能力的影響

將各組A2780 細(xì)胞接種于6 孔板（5×105/孔），在培養(yǎng)板背面畫5 條平行線作為標(biāo)記，24 h 后用200 μL 無菌移液器吸頭在細(xì)胞層中劃2 條垂直于背面平行線的直線，用PBS洗3次，加入2 mL無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于0、24 h 在倒置顯微鏡下觀察測(cè)量細(xì)胞向劃痕區(qū)域的遷移距離并拍照。

1.9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)BIN1對(duì)A2780 細(xì)胞侵襲能力的影響

將各組A2780細(xì)胞按照每孔2×105個(gè)細(xì)胞加入預(yù)鋪人工基膜的Transwell小室的上室，下室加入700 μL含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后取出小室，經(jīng)過PBS沖洗后，用棉簽將上室中殘存的細(xì)胞擦去，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS 清洗3 次后，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS沖洗后風(fēng)干，在高倍顯微鏡（×200）下拍照并隨機(jī)選取10 個(gè)視野計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上主要實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采取t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)分析BIN1 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，Kaplan-Meier 法分析BIN1 表達(dá)與患者無病生存（DFS）和總生存（OS）的關(guān)系，以P<0.05或P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BIN1在EOC組織中呈低表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖1）顯示，BIN1表達(dá)定位在細(xì)胞核中。EOC 組織中BIN1 陽性表達(dá)率明顯低于非腫瘤卵巢組織[32.84%（22/67）vs80.00%（24/30），χ2=15.105，P<0.01]。

圖1 EOC組織及非腫瘤卵巢組織中BIN1的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色，×200）

2.2 BIN1表達(dá)與EOC患者臨床病理特征的關(guān)系

χ2檢驗(yàn)分析BIN1表達(dá)與EOC患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果（表1）發(fā)現(xiàn)，BIN1低表達(dá)與EOC患者較晚的術(shù)后病理分期、較差的組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腹膜轉(zhuǎn)移存在正向關(guān)聯(lián)（均P<0.05），而與年齡無關(guān)聯(lián)（P>0.05）。

表1 EOC組織中BIN1表達(dá)水平及其與患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 BIN1表達(dá)與EOC患者預(yù)后的關(guān)系

中位隨訪時(shí)間為39 個(gè)月，隨訪終止時(shí)間點(diǎn)為2021 年4 月30 日。在隨訪期間，獲訪患者中有26 例死亡。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果（圖2）顯示，BIN1低表達(dá)患者的DFS和OS均顯著短于BIN1高表達(dá)患者（均P<0.05）。

圖2 Kaplan-Meier法分析BIN1表達(dá)對(duì)EOC患者DFS和OS的影響

2.4 EOC細(xì)胞中BIN1 mRNA和蛋白均低表達(dá)

qPCR 法檢測(cè)結(jié)果（圖3A）顯示，EOC 細(xì)胞SKOV3 和A2780 中BIN1 mRNA 表達(dá)水平均顯著低于正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80（均P<0.01）。WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3B）顯示，SKOV3 和A2780 細(xì)胞中BIN1 蛋白表達(dá)水平均顯著低于IOSE80 細(xì)胞（均P<0.01）。結(jié)果提示，EOC細(xì)胞中BIN1 mRNA和蛋白均呈低表達(dá)。相較于SKOV3細(xì)胞，A2780細(xì)胞中BIN1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平更低（均P<0.05），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用A2780細(xì)胞。

圖3 不同EOC細(xì)胞中BIN1 mRNA（A）和蛋白（B）的表達(dá)

2.5 過表達(dá)BIN1顯著抑制A2780細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力

轉(zhuǎn)染BIN1 后，qPCR 和WB 法檢測(cè)結(jié)果（圖4A、B）顯示，與NC 組和CMV-BIN1 組相比，CMV-BIN1組A2780 細(xì)胞中BIN1 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（均P<0.01）。結(jié)果提示，成功建立BIN1 過表達(dá)的A2780 細(xì)胞系。過表達(dá)BIN1 后，CCK-8 法實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4C）顯示，在48、72 和96 h 時(shí)A2780 細(xì)胞的增殖能力顯著降低（P<0.05 或P<0.01）；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4D）顯示，A2780 細(xì)胞的遷移能力顯著降低（P<0.01）；Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4E）顯示，A2780 細(xì)胞的侵襲能力顯著降低（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)BIN1 可顯著抑制卵巢癌A2780 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

圖4 過表達(dá)BIN1對(duì)A2780細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

3 討論

EOC是國內(nèi)外發(fā)病率和病死率較高的婦科惡性腫瘤之一，其侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是預(yù)后不佳的主要原因；缺乏有效的治療靶點(diǎn)也是臨床治療過程中制約EOC 患者預(yù)后改善的主要瓶頸之一。因此，亟須深入研究EOC 進(jìn)展過程中的相關(guān)分子機(jī)制，為尋找其新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

腫瘤細(xì)胞的無限增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力是腫瘤致死的主要原因。BIN1是機(jī)體中具有抑癌作用的配體蛋白，已被證實(shí)在多種類型腫瘤中表達(dá)缺失。BIN1 基因缺失可加速誘導(dǎo)RAS 介導(dǎo)的小鼠惡性腫瘤的形成，且用Cre-Lox 技術(shù)敲除BIN1 基因，18～20個(gè)月后50%的小鼠自發(fā)性地發(fā)生肺癌，10%的小鼠自發(fā)性地發(fā)生肝癌[18]。ZHOU等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中BIN1 蛋白水平受miR-744 的負(fù)向調(diào)控，且BIN1 過表達(dá)可以抑制miR-744 誘導(dǎo)的奧沙利鉑耐藥，提示miR-744 可能通過抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中BIN1 表達(dá)而誘導(dǎo)奧沙利鉑的耐藥。HU 等[20]研究結(jié)果證實(shí)，在肝癌中BIN1 基因異常剪接可導(dǎo)致其喪失抑癌功能，而HX9-NONO-SFPQ 復(fù)合物是導(dǎo)致BIN1異常剪接的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究結(jié)果[21]表明，在BIN1 缺失的腫瘤細(xì)胞中，E2F1 激活A(yù)TM 從而導(dǎo)致順鉑耐藥。多項(xiàng)研究結(jié)果[8-9,22]顯示，BIN1可以通過直接與c-MYC結(jié)合逆轉(zhuǎn)c-MYC介導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力。MULLER等[23]通過皮膚癌模型發(fā)現(xiàn)，BIN1 缺失可以通過影響STAT1 和NF-κB通路促進(jìn)IDO表達(dá)，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著減少，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。本課題組在前期的研究[15,24-26]中發(fā)現(xiàn)，BIN1在ESCC及NSCLC中呈低表達(dá)，且其低表達(dá)與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和OS呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步研究BIN1在腫瘤細(xì)胞中的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BIN1 缺失能夠提高腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

鑒于目前BIN1 在EOC 中的表達(dá)及其生物學(xué)功能尚未明了，本研究著重探討了BIN1 對(duì)EOC 的影響。首先，通過免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)EOC 組織和非腫瘤卵巢組織中BIN1表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EOC組織中BIN1 的表達(dá)水平顯著低于非腫瘤卵巢組織，提示BIN1 在EOC 發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌作用。為明確BIN1在EOC中的臨床意義，本研究進(jìn)一步對(duì)BIN1 表達(dá)與EOC 患者臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BIN1 低表達(dá)與患者較晚的術(shù)后病理分期、較差的組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹膜轉(zhuǎn)移有關(guān)；Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果表明，BIN1 高表達(dá)EOC患者的術(shù)后DFS和OS顯著長于BIN1低表達(dá)患者，提示BIN1低表達(dá)可獨(dú)立作為EOC患者不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。

為了進(jìn)一步研究BIN1在EOC中的生物學(xué)功能，本研究針對(duì)BIN1 在EOC 中的抑癌作用開展體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，過表達(dá)BIN1 能夠顯著降低EOC A2780 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。由于EOC 細(xì)胞的異常增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素，本研究結(jié)果提示，BIN1 可能通過抑制EOC 細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為而改善患者的預(yù)后。但BIN1是通過何種具體的分子機(jī)制來發(fā)揮抑癌作用有待深入研究。

綜上所述，BIN1 在EOC 組織和細(xì)胞中低表達(dá)，且與EOC 患者的多個(gè)臨床病理特征有關(guān)。過表達(dá)BIN1 能夠顯著抑制EOC 細(xì)胞A2780的增殖、遷移和侵襲，說明BIN1在EOC的惡性進(jìn)展過程中發(fā)揮了抑癌作用。本課題組后續(xù)將繼續(xù)深入研究BIN1 在EOC 中發(fā)揮抑癌作用的具體機(jī)制，為尋找EOC 的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。