石秀珍，高瑋，徐萍[上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬松江醫(yī)院（籌）消化內(nèi)科，上海201600]

混合譜系白血病5（mixed lineage leukemia 5,MIL5）基因?qū)儆赥rxG基因家族，是重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控基因和人急性髓細胞性白血病的重要致病基因[1]。MLL5誘導(dǎo)組蛋白H3K4轉(zhuǎn)移酶參與腫瘤的廣泛生物學(xué)過程[2]。有研究結(jié)果[3-5]表明，MLL5基因缺失的小鼠會導(dǎo)致造血干細胞（hemopoietic stem cell，HSC）的自我更新能力受損，并引起HSC中DNA損傷和活性氧積累[6]。此外，MLL5在固有免疫中也起重要作用，參與視黃酸誘導(dǎo)基因1（retinoic acid inducible gene-1，RIG-1）蛋白和E3泛素連接酶STUB1之間的相互作用，MLL5基因缺失直接減弱RIG-1和STUB1的相互作用，降低RIG-1泛素化，增加RIG-1蛋白表達水平[7]。有趣的是，RIG-1在結(jié)腸癌的腫瘤免疫中起重要作用，DDX58基因缺失后的黑色素瘤B16細胞和結(jié)腸癌CT26細胞抵抗CTLA-4單抗治療作用，而激活RIG-1可以顯著縮小B16和CT26細胞移植瘤體積并延長荷瘤小鼠總生存期（OS）[8-10]。然而，MLL5在結(jié)腸癌中的作用及其機制尚未明了。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建MLL5基因缺失及MLL5和DDX58雙基因缺失的結(jié)腸癌CT26細胞模型，并將其接種到野生型BALB/c小鼠和免疫缺陷型NSG小鼠皮下，觀察移植瘤的生長及荷瘤小鼠的OS，以期確定MLL5在小鼠結(jié)腸癌及腫瘤免疫中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系、實驗動物及主要試劑

人胚腎上皮細胞系293T 和小鼠結(jié)腸癌細胞系CT26購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。6 周齡、雄性野生型BALB/c 小鼠和NSG 小鼠（動物合格證：20170005023369）購于上海斯萊克公司。

PBS緩沖液、DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清和青霉素-鏈霉素溶液均購于美國Gibco公司，F(xiàn)astDigestEsp3Ⅰ、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于美國Thermo公司，助慢病毒感染試劑聚凝胺polybrene購于美國Sigma公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒購于天根生化科技有限公司，pSPAX、pMD2.G、lentiCRISPRv2 和lentiGuide-BSD質(zhì)粒購于美國Addgene公司，Stbl3感受態(tài)購于唯地生物公司，兔抗鼠RIG-1購于Proteintech公司，兔抗鼠MLL5 購于美國Active Motif公司，兔抗鼠β-actin購于Abclonal公司，熒光羊抗兔IgG二抗購于美國LI-COR公司。

1.2 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建、包裝和慢病毒合成及感染

利用http://crispr.mit.edu/網(wǎng)站在線工具，設(shè)計靶向MLL5和DDX58的sgRNA。MLL5-sgRNA1#引物序列：上游為5'-CACCGATGTAACCAGGTGCATATG-3'，下游為5'-AAACCATATGCACCTGGTTACATC-3'；MLL5-sgRNA2# 引物序列：上游為5'-CACCGATGC TCATGACGTTCGCCTC-3'，下游為 5'-AAACGA GGCGAACGTCATGAGCATC-3'；DDX58-sgRNA1#引物序列：上游為5'-CACCGCGTTGGAGATGCT AAGACCG-3'，下游為5'-AAACCGGTCTTAGCA TCTCCAACGC-3'；DDX58-sgRNA2#引物序列：上游為5'-CACCGTCCGCCAGAGATGAACGAAG-3'，下游為5'-AAACCTTCGTTCATCTCTGGCGGAC-3'；NTCsgRNA 引物序列：上游為5'-CACCGGCGAGGTATT CGGCTCCGCG-3'，下游為5'-AAACCGCGGAGCCGA ATACCTCGCC-3'。

LentiCRISPRv2和lentiGuide-BSD慢病毒質(zhì)粒經(jīng)Esp3Ⅰ酶切后瓊脂糖凝膠電泳回收，磷酸化退火引物，將退火后的MLL5-sgRNA、DDX58-sgRNA 和NTC-sgRNA DNA片段連接到lentiCRISPRv2 或lentiGuide-BSD 載體上。連接反應(yīng)體系如下：50 ngEsp3Ⅰ酶切的lentiCRISPRv2 或lentiGuide-BSD 線性化質(zhì)粒、0.1 pmol/L 磷酸化退火片段、5 μL 2×Quick DNA ligase（DNA連接酶）Buffer、1 μL Quick DNA ligase 在室溫連接10 min[11]。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stbl3 大腸桿菌感受態(tài)細胞并挑選陽性克隆測序驗證。按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒說明書抽提質(zhì)粒。

將293T細胞接種到100 mm培養(yǎng)皿（3×106個/皿），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜。按照Lipofectamine 2000說明書進行轉(zhuǎn)染，每個培養(yǎng)皿的質(zhì)粒用量為7.5 μg lentiCRISPRv2 sgRNA或lentiGuide-BSD sgRNA質(zhì)粒、5 μg pSPAX2和2.5 μg pMD2.G，Lipofectamine 2000∶質(zhì)粒為2∶1。轉(zhuǎn)染24 h時更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后收集含有慢病毒的上清液。

1.3 基因敲除CT26細胞系的建立

將小鼠結(jié)腸癌CT26細胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的CT26 細胞消化后，接種到24 孔板（3×104個/孔）中，第2 天吸去培養(yǎng)液，加入用RPMI 1640 完全培養(yǎng)基1∶1 稀釋的lentiCRISPRv2-MLL5 sgRNA 或lentiCRISPRv2-NTC sgRNA慢病毒，并加入終質(zhì)量濃度8 μg/mL慢病毒助感染試劑polybrene，混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h時換新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)基。感染48 h時，加入含有20 μg/mL 嘌呤霉素的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，篩選被感染的細胞。篩選48 h后未感染病毒的對照組細胞全部死亡，消化細胞并利用稀釋法接種到96孔板，標(biāo)記單細胞孔，待單克隆細胞擴增后檢測MLL5蛋白的表達，另外提取單克隆細胞株基因組通過PCR 擴增MLL5 sgRNA 靶向基因區(qū)域序列進行Sanger測序。

利用MLL5 sgRNA1#克隆系同上述步驟感染lentiGuide-BSD-DDX58 sgRNA1#、lentiGuide-BSDDDX58 sgRNA2#或lentiGuide-BSD-NTC sgRNA 病毒，挑取MLL5和RIG-1雙基因缺失的克隆細胞系用于MLL5調(diào)控RIG-1的研究。

1.4 WB法檢測CT26細胞中MLL5、RIG-1蛋白表達

收集各組細胞，加入RIPA裂解液裂解細胞，4 ℃、12 000×g離心15 min后取上清，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。用10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入MLL5（1∶1 000）、RIG-1（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）一抗4 ℃過夜。TBST洗滌3次（10 min/次），加入羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室溫下處理1 h，洗膜后用CLX Odyssey LICOR雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描并成像，利用Image Studio軟件分析蛋白條帶的灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.5 結(jié)腸癌CT26細胞移植瘤小鼠模型的建立和觀察

BALB/c 小鼠和NSG 小鼠飼養(yǎng)于SPF（無特定病原體）級動物房，溫度維持22 ℃，相對濕度30%～70%，人工照明，晝夜明暗12 h 交替。所有實驗動物相關(guān)的操作均經(jīng)上海市松江區(qū)中心醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核并批準(zhǔn)。

將NSG小鼠和BALB/c小鼠分別隨機分成3組：Control sgRNA 組、MLL5 sgRNA1# 組 和MLL5 sgRNA2#組，8只/組。將24只BALB/c小鼠隨機分為3 組：Control sgRNA 組、MLL5 sgRNA1#+DDX58 sgRNA1#組和MLL5 sgRNA1#+DDX58 sgRNA2#組。將處于對數(shù)生長期的CT26 細胞消化制備成細胞懸液，用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為2×106個/mL。取100 μL細胞懸液接種到小鼠背部皮下，每只小鼠細胞接種量為2×105個。從接種第7 天起，每3 d 監(jiān)測腫瘤塊體積一次，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤塊最長和最短直徑，計算腫瘤體積。腫瘤體積=（瘤體長徑×瘤體短徑2）/2。當(dāng)最長徑達到15 mm 時達到倫理終點，將小鼠安樂死，以獲取移植瘤標(biāo)本。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Origin 9 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05或P<0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建敲除MLL5基因的CT26細胞系

Sanger 測序檢測結(jié)果（圖1A）顯示，MLL5 sgRNA1#單克隆CT26細胞系基因組中MLL5基因分別缺失2 bp和插入1 bp；MLL5 sgRNA2#單克隆分別缺失4 bp 和1 bp。WB 法檢測結(jié)果（圖1B）顯示，MLL5 sgRNA1#和MLL5 sgRNA2#單克隆細胞均不表達MLL5蛋白。結(jié)果表明，成功構(gòu)建MLL5基因敲除的結(jié)腸癌CT26細胞系，可以用于后續(xù)實驗。

圖1 Sanger測序（A）和WB法（B）驗證MLL5基因敲除效果

2.2 MLL5基因缺失上調(diào)CT26細胞中RIG-1表達水平

WB實驗結(jié)果（圖2）顯示，MLL5 sgRNA1#和MLL5 sgRNA2#組CT26細胞中RIG-1水平顯著高于Control sgRNA組CT26細胞（均P<0.01）。結(jié)果表明，MLL5基因敲除可顯著上調(diào)CT26細胞中RIG-1蛋白的表達水平。

圖2 WB法檢測MLL5基因敲除后CT26細胞中RIG-1蛋白的表達

2.3 MLL5 基因敲除抑制野生型小鼠CT26 細胞移植瘤的生長并延長OS

小鼠荷瘤實驗結(jié)果顯示，在免疫缺陷NSG 小鼠中Control sgRNA 和MLL5 sgRNA CT26 細胞移植瘤體積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3A），而在野生型BALB/c小鼠中MLL5 sgRNA1#和MLL5 sgRNA2#組CT26 細胞移植瘤的體積顯著小于Control sgRNA 組（均P<0.01，圖3B）。同樣，MLL5 基因敲除對種植CT26 細胞的NSG 小鼠的OS 無顯著影響（圖3C），而在野生型小鼠中CT26細胞敲除MLL5基因可以顯著延長荷瘤小鼠的OS率（圖3D）。實驗結(jié)果表明，在小鼠結(jié)腸癌CT26 細胞移植瘤模型中，MLL5 基因敲除可增強野生型小鼠對CT26細胞移植瘤的免疫作用。

圖3 MLL5基因敲除對各組裸鼠CT26細胞移植瘤體積（A、B）和荷瘤小鼠OS率（C、D）的影響

2.4 CT26細胞缺失MLL5增強腫瘤免疫依賴于RIG-1

MLL5 基因敲除可增強腫瘤免疫而顯著抑制野生型BALB/c小鼠CT26細胞移植瘤的生長和延長荷瘤小鼠的OS。為驗證MLL5基因敲除是否通過提高RIG-1 表達水平而增強腫瘤免疫，在MLL5 sgRNA1#CT26 細胞中同時敲除DDX58 基因后，WB法檢測結(jié)果（圖4A）顯示，DDX58 sgRNA1#和DDX58 sgRNA2#敲除成功。將Control sgRNA、MLL5 和DDX58 雙基因缺失的CT26 細胞接種于野生型BALB/c 小鼠，結(jié)果顯示Control sgRNA、MLL5 sgRNA1# +DDX58 sgRNA1# 和MLL5 sgRNA1# +DDX58 sgRNA2#三組小鼠CT26 細胞移植瘤體積和小鼠的OS 差異比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05，圖4B、C）。實驗結(jié)果表明，MLL5基因敲除增強腫瘤免疫依賴于RIG-1。

圖4 同時敲除MLL5和DDX58基因?qū)IG-1表達（A）、CT26細胞移植瘤體積（B）和荷瘤小鼠OS率（C）的影響

3 討論

結(jié)腸癌是消化道中常見的惡性腫瘤之一，在中國以41～65歲人群發(fā)病率最高，其發(fā)病率和病死率均呈逐年上升趨勢[12]。目前結(jié)腸癌仍以手術(shù)為主，但復(fù)發(fā)率高，初診已是轉(zhuǎn)移患者的5年OS率不到10%[13]。近年來，免疫治療已成為腫瘤治療的重要手段，其中靶向免疫檢查點程序性死亡蛋白-1（PD-1）和細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4）已經(jīng)被證明是一種有效的治療方法[14-15]。臨床上，抗PD-1單抗納武單抗和派姆單抗被用于治療結(jié)直腸癌患者，在部分結(jié)直腸癌亞型患者中具有較高的免疫應(yīng)答率[16-17]。但是單純的抑制免疫檢查點療法僅對部分結(jié)直腸癌亞型患者表現(xiàn)出良好的免疫應(yīng)答率，而大部分患者免疫應(yīng)答率仍然較低，因此仍需要研究新的免疫治療靶點以降低癌細胞的免疫逃逸和免疫耐受。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠結(jié)腸癌CT26 細胞中MLL5 基因后可以上調(diào)RIG-1 水平，提高移植瘤的腫瘤免疫，提示MLL5可能成為結(jié)腸癌免疫治療的新靶點。

MLL5 通過促進RIG-1 降解而加強在宿主抗病毒免疫反應(yīng)中的負調(diào)控作用，位于細胞質(zhì)中的MLL5通過與RIG-1 和RIG-1 的E3 連接酶STUB1 結(jié)合，促進K48 連接多泛素化和RIG-1 的蛋白酶體降解[7,18]。MLL5 基因缺失減弱了RIG-1 和STUB1 之間的相互作用并減少了K48連接的多泛素化，從而增加細胞中RIG-1 的積累。MLL5 基因缺失促進體內(nèi)外INF-α、促炎細胞因子的產(chǎn)生以及對RNA病毒的天然抗病毒免疫應(yīng)答[19]；在病毒感染后，MLL5 從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中，以誘導(dǎo)STUB1 介導(dǎo)的RIG-I 降解[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MLL5 基因缺失后小鼠結(jié)腸癌CT26 細胞中RIG-1水平顯著提高，其通過增強腫瘤免疫而抑制CT26細胞移植瘤的生長。

在NSG小鼠中，MLL5基因缺失和野生型小鼠結(jié)腸癌CT26 細胞移植瘤的生長速度以及荷瘤小鼠的OS 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明MLL5 基因缺失對CT26細胞的增殖沒有顯著性影響。在免疫系統(tǒng)正常的野生型小鼠中，MLL5 基因缺失的結(jié)腸癌CT26 細胞移植瘤的生長速度顯著低于野生型細胞移植瘤，同樣MLL5 基因缺失的CT26 細胞荷瘤小鼠的OS 顯著延長，說明MLL5基因缺失的抗腫瘤作用依賴于小鼠免疫系統(tǒng)。然而，MLL5 和RIG-1雙基因缺失后又顯著逆轉(zhuǎn)MLL5基因缺失的作用，因此MLL5基因缺失通過上調(diào)RIG-1水平而增強野生型小鼠對CT26細胞移植瘤的免疫作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MLL5基因缺失可上調(diào)結(jié)腸癌CT26 細胞中RIG-1 水平，增強野生型小鼠腫瘤免疫、抑制移植瘤生長并延長荷瘤小鼠OS。本研究采用的MLL5 基因缺失的CT26 細胞僅在NSG 小鼠和BALB/c 野生型小鼠中驗證，未能在MLL5 基因缺失的小鼠中驗證。因此MLL5 能否成為結(jié)腸癌治療的新靶點還需進一步研究。