王 微，王 巖，王超君，盧芳芳，凌 靜

0 引 言

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs，lncRNA)與癌癥發(fā)生、血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病過程均有一定的相關(guān)性[1-5]，并通過多種不同機(jī)制調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的功能[6-8]。機(jī)體缺氧可能導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、系統(tǒng)性炎癥及氧化應(yīng)激等，進(jìn)而產(chǎn)生的氧自由基能夠介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化損傷，是血管內(nèi)皮損傷的主要誘因之一。為探討lncRNA在缺氧后血管內(nèi)皮損傷及修復(fù)過程中的機(jī)制，通過原代培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)建立氧糖剝奪模型，篩選95種lncRNA在缺糖缺氧后的含量變化情況。其中長鏈非編碼RNA缺氧誘導(dǎo)因子-1alpha-反義鏈1(long non-coding RNA hypoxia-inducible factor-1alpha-antisense RNA-1，lncRNA HIF-1α-AS1)表達(dá)量上升最為顯著。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在與缺氧相關(guān)的心血管疾病、癌癥等發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[9-12]。有研究表明，高水平的HIF1α提示機(jī)體處于缺氧應(yīng)激狀態(tài)[13]，HIF-1α表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化性炎癥斑塊表型相關(guān)，并在活化的巨噬細(xì)胞中上調(diào)[14]。而LncRNA HIF-1α-AS1在缺氧相關(guān)疾病中的報(bào)道較少，本研究選擇lncRNA HIF1α-AS1作為缺氧應(yīng)激的目標(biāo)基因開展研究，旨在探索lncRNA HIF-1α-AS1與血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧應(yīng)激損傷的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑①細(xì)胞來源：在無菌條件下，取健康產(chǎn)婦胎兒新鮮臍帶(產(chǎn)婦知情同意并自愿捐獻(xiàn))，長約 20 cm，浸泡在添加抗生素的 M199 培養(yǎng)基中，4 ℃保存，在2 h 內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。②試劑：胎牛血清(Gibco BRL 公司)，胰蛋白酶(Hyclone 公司)，M199高糖培養(yǎng)基(Gibco BRL公司)，DAB 試劑盒(中山公司)，PrimeScriptTMRT Master Mix(RR036A TaKaRa)，Premix Taq(RR901A TaKaRa)，UltraSYBR Mixture(CW0956 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，BCA蛋白測定試劑盒(P0010 碧云天生物技術(shù)研究所)，RIPALysis buffer(sc-364162 美國Santa Cruz公司)，HIF-1α一抗(sc-13515美國Santa Cruz公司)，超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase1，SOD1)一抗(sc-8636美國Santa Cruz公司)，β-actin 一抗(4967 美國CST公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(A0545 Sigma)，ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(BU-WB-03 南京鉑優(yōu)生物技術(shù)有限公司)。

1.2 HUVEC培養(yǎng)原代培養(yǎng)將臍帶剪去兩端(約2 cm)，注入1×PBS反復(fù)沖洗臍靜脈數(shù)次，注入15 mL的 0.125%胰蛋白酶，待臍靜脈充盈，使內(nèi)膜與胰蛋白酶充分接觸，輕柔擠壓管壁，將含有內(nèi)皮細(xì)胞的胰蛋白酶注入50 mL離心管，加入 M199 高糖培養(yǎng)基5 mL終止酶反應(yīng)，再以10 mL 1×PBS沖洗管腔，流出液倒入離心管，離心半徑13.5 cm,1400 r/min 離心10 min，棄上清，加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞數(shù)，以1×105/mL 接種至纖維連接蛋白預(yù)包被的培養(yǎng)皿中。置于5% CO2，37 ℃靜止培養(yǎng) 4 h，更換培養(yǎng)液，除去未貼壁的細(xì)胞。每隔2天換液1次，以維持細(xì)胞營養(yǎng)及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。傳代培養(yǎng)：細(xì)胞長至單層融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液，1×HEPES洗滌，加入1 mL 0.125%胰蛋白酶消化，將液體棄去，加入培養(yǎng)液5 mL吹打細(xì)胞至懸浮，在新的培養(yǎng)板中加入1 mL細(xì)胞懸液和4 mL HUVEC培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)。

1.3 氧糖剝奪模型(oxygen-glucose deprivation，OGD)和細(xì)胞凋亡檢測HUVEC細(xì)胞上清液更換為無糖培養(yǎng)基，并置于三氣培養(yǎng)箱(5% CO2/1% O2/94% N2)中。以無氧糖剝奪組作為對照，OGD 24，48，72 h的血管內(nèi)皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，分別用Hochest/Tunel形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞儀Annexin V/PI檢測其凋亡水平。因48 h細(xì)胞凋亡率顯著，后續(xù)試驗(yàn)均采用OGD 48 h。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選OGD后95種lncRNA的相對表達(dá)量細(xì)胞經(jīng)OGD 48 h處理后棄去上清液，TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，檢測A260/280，調(diào)整濃度并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)95種lncRNA序列分別設(shè)計(jì)引物并合成，采用ABI公司的StepOnePlus Real-time PCR System進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，篩選OGD后基因表達(dá)差異。RT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，每循環(huán)一次溶解曲線分析一次，最后60 ℃ 15 s。數(shù)據(jù)處理以β-actin為內(nèi)參，采用Ct值法(2-△△Ct法)分析目的基因的相對表達(dá)差異。

1.5 HIF-1α siRNA序列干擾根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的人HIF-1α全長基因(No.nm_001530)設(shè)計(jì)合成的靶序列mRNA有4條，從5′-3′分別為：GGACACAGAUUUAGACUUG、GAUGGAAGCACUAGACAAA、CGUGUUAUCUGUCGCUUUG和GAUGAAAGAAUUACCGAAU。siRNA在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索，僅與人HIF-1α序列相配。轉(zhuǎn)染前24 h接種細(xì)胞六孔板和96孔板(培養(yǎng)液中不加抗生素)。24 h后吸棄上清，六孔板加入2 mL的轉(zhuǎn)染混合物(含10%胎牛血清的HUVEC培養(yǎng)液+2 μmoL/L的siRNA+ Dharma FECT轉(zhuǎn)染試劑+無抗生素HUVEC以一定比例混合)；熒光標(biāo)志的陰性對照用以評價(jià)轉(zhuǎn)染率。96孔板加入100 μL轉(zhuǎn)染混合物。置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。棄去上清液，加入無血清HUVEC培養(yǎng)液(體積分?jǐn)?shù)95% N2和5% CO2條件下培養(yǎng))。取對數(shù)生長期且生長良好細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分成：陰性對照組(無任何靶基因的siRNA，并經(jīng)缺氧處理)和3個(gè)lncRNA HIF-1α-AS1 siRNA干擾組(細(xì)胞經(jīng)siRNA作用，并經(jīng)缺氧處理)。含有熒光物質(zhì)的siRNA轉(zhuǎn)染后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，經(jīng)RT-PCR檢測靶基因判定是否干擾成功。

1.6 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)漏出率評價(jià)細(xì)胞損傷LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色，通過比色可計(jì)算出酶活性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染并OGD預(yù)處理后，每個(gè)樣品收集培養(yǎng)液100 μL，加入基質(zhì)溶液500 μL、輔酶I 100 μL，混勻后在37 ℃下水浴20 min。加入0.4 mol/L NaOH 5 mL，混勻，室溫放置3 min，于440 nm處測定OD值，根據(jù)公式計(jì)算培養(yǎng)液LDH活性；將待測培養(yǎng)孔內(nèi)細(xì)胞加入等量PBS，刮板刮取細(xì)胞并收集到管中，超聲破碎后進(jìn)行細(xì)胞勻漿液的LDH活性測定，方法與培養(yǎng)液測定方法相同。根據(jù)公式：LDH漏出率(%)=培養(yǎng)液LDH活性/(培養(yǎng)液LDH活性+細(xì)胞勻漿液LDH活性)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 缺氧誘導(dǎo)臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷Hochest/Tunel檢測，與對照組4.86%±0.91%(0 h)相比，OGD 24 h細(xì)胞無明顯凋亡，48 h、72 h細(xì)胞凋亡率顯著增加，分別為5.98%±1.08%(24 h，P>0.05), 11.76%±1.59%(48 h，P<0.01)及19.39%±1.25%(72 h，P<0.01)，見圖1a。流式細(xì)胞儀(PI/Annexin V染色)檢測結(jié)果與形態(tài)學(xué)檢測趨勢相同，與對照組3.37%±0.87%(0 h)相比，缺氧細(xì)胞凋亡率分別為5.97%±1.88%(24 h，P>0.05), 9.62%±2.63%(48 h，P<0.01)，10.74%±2.56%(72 h，P<0.01)，見圖1b。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用OGD 48 h。

a: Hochest/Tunel檢測細(xì)胞凋亡(×200)；b:流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

2.2 RT-PCR篩選缺氧調(diào)控的lncRNAHUVEC細(xì)胞OGD 48 h后，RT-PCR檢測出HIF1α-AS1、CDKN2B-AS5、BPESC1、CRB3-AS1、Fendrr等5個(gè)lncRNA上調(diào)表達(dá)，其中HIF1α-AS1上調(diào)1.98倍(P<0.05)，見表1。

表1 RT-PCR篩選氧糖剝奪敏感的

2.3 HIF1a-AS1經(jīng)siRNA處理后，HUVEC損傷減輕熒光標(biāo)記的陰性對照提示同批次siRNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率約為75%。RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于陰性對照組，siRNA1、siRNA2、siRNA3組siRNA干擾后相對表達(dá)水平有顯著差異，分別為81.04%±8.98%(P<0.05)，56.81%±4.97%(P<0.01)，44.70%±2.12%(P<0.01)，其中siRNA2和siRNA3干擾效果較好，見圖2a。進(jìn)一步檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的LDH漏出率，干擾內(nèi)源lncRNA HIF1α-AS1后，與模型組26.17%±1.69%相比，siRNA1、siRNA2、siRNA3組LDH漏出率明顯降低，分別為20.84%±2.64%(P<0.05)，19.82%±1.61%(P<0.01)，17.01%±0.24%(P<0.01)，見圖2b。

a: siRNA干擾后LncRNA HIF-1α-AS1的表達(dá); b:siRNA干擾后LDH漏出率

2.4 siRNA 干擾lncRNA HIF-1α-AS1增加SOD1的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平與對照組相比，siRNA2和siRNA3對lncRNA HIF-1α-AS1進(jìn)行干擾后，2組SOD1基因mRNA水平顯著上調(diào)，siRNA2組(P<0.01)，siRNA3組(P<0.01)，見圖3a；2組SOD1蛋白表達(dá)量也明顯上升，siRNA2(P<0.05)，siRNA3(P<0.01)，見圖3b。

a:RT-PCR方法檢測SOD1基因mRNA水平; b:Western blot方法檢測SOD1蛋白水平

3 討 論

lncRNA可多層面調(diào)控基因表達(dá)。本研究篩選出缺氧后差異表達(dá)上調(diào)的 lncRNA共5個(gè)，BPESC1與常染色體顯性遺傳病小眼瞼綜合征相關(guān)研究有見報(bào)道[15]；CDKN2B-AS5是一種抑癌基因，在人類腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常[16]；而Fendrr則是在控制胚胎中胚層分化成心臟和體壁過程中的特異性lncRNA[17]；CRB3-AS1在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，同時(shí)調(diào)控細(xì)胞凋亡[18]；其中HIF-1α-AS1上調(diào)1.98倍(P<0.05)，其對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α與缺氧相關(guān)疾病有關(guān)且研究熱度較高，故選擇其非編碼RNA作為目標(biāo)基因，深入探究其與缺氧細(xì)胞損傷之間的關(guān)系。

細(xì)胞缺氧后轉(zhuǎn)向無氧代謝，導(dǎo)致乳酸聚積而發(fā)生損傷，LDH會(huì)由細(xì)胞內(nèi)漏出至培養(yǎng)液中，通過測定LDH漏出率能夠比較客觀地反映細(xì)胞受損情況，如有藥物或基因干預(yù)，則可進(jìn)一步評價(jià)干預(yù)因素的作用。SOD1又稱Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)，廣泛分布于整個(gè)細(xì)胞，包括溶酶體，線粒體的膜間空間和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，構(gòu)成了對抗氧化應(yīng)激的前線防御機(jī)制，能夠通過氧化還原反應(yīng)將機(jī)體產(chǎn)生的自由基如超氧化物轉(zhuǎn)化為分子氧和過氧化氫，以減輕細(xì)胞損傷[19]。在大量氧化應(yīng)激下，缺乏SOD1的小鼠會(huì)表現(xiàn)出多種病理癥狀，包括肝細(xì)胞癌，壽命縮短等[20]。除了作為抗氧化酶，SOD1的新功能，包括暴露于氧化應(yīng)激后核基因轉(zhuǎn)錄的激活，RNA代謝的調(diào)節(jié)等也有報(bào)道[21-22]。HUVEC缺氧后lncRNA HIF1α-AS1增加，細(xì)胞凋亡率升高、損傷加重。用siRNA干擾lncRNA HIF1α-AS1后，3個(gè)干擾組LDH 漏出率顯著下降，siRNA2組和siRNA3組的SOD1基因mRNA水平顯著上調(diào)，其SOD1蛋白表達(dá)量也明顯上升，細(xì)胞損傷減輕，而siRNA1組干擾效率較低，細(xì)胞損傷雖然有所緩解，但 SOD1的蛋白量沒有變化。提示lncRNA HIF1a-AS1含量變化幅度的大小對于細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)是有一定差異的。干擾lncRNA HIF1α-AS1后，通過上調(diào)SOD1表達(dá)而提高細(xì)胞的抗缺氧能力，減輕缺氧應(yīng)激損傷，這是一種反向調(diào)節(jié)作用。

HIF-1α在常氧條件下通過蛋白酶體途徑快速降解，而缺氧條件下，可通過調(diào)節(jié)糖酵解酶、乳酸脫氫酶和丙酮酸脫氫酶激酶的表達(dá)來下調(diào)線粒體的氧氣消耗，使細(xì)胞轉(zhuǎn)為無氧糖酵解途徑。本研究通過構(gòu)建lncRNA HIF1α-AS1沉默模型，檢測缺氧條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、損傷及細(xì)胞活力等狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)lncRNA HIF1α-AS1的高表達(dá)與細(xì)胞的凋亡率升高相關(guān)，而低表達(dá)時(shí)細(xì)胞活力增加。LncRNA并不編碼蛋白，而是以RNA形式在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)水平，參與細(xì)胞分化和發(fā)育[23]。結(jié)果提示缺氧誘導(dǎo)因子對于細(xì)胞低氧損傷的調(diào)節(jié)過程也可以通過lncRNA的形式參與，證實(shí)了lncRNA HIF1α-AS1可以作為防治缺氧內(nèi)皮細(xì)胞損傷的靶標(biāo)，但具體是在轉(zhuǎn)錄的哪個(gè)階段調(diào)控還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

基于本研究結(jié)果，下步實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步探究凋亡相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路，即有更加充分的分子生物學(xué)證據(jù)支持上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。另外，在動(dòng)物模型上進(jìn)行低壓氧艙模擬上述各類缺氧環(huán)境，對比lncRNA HIF1α-AS1的基因敲除前后缺氧癥狀的差異，為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷相關(guān)疾病(動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成等)的分子調(diào)控和藥物治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。