段霞，王治鴻

作者單位：030001 山西 太原，1.山西醫(yī)科大學(xué)；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院生殖中心

1950年，張明覺先生研究家兔胚胎移植時發(fā)現(xiàn)了胚齡與子宮內(nèi)膜同步化的重要性，并首次提及子宮內(nèi)膜容受性(endometrial receptivity，ER)，指在特定時間子宮內(nèi)膜允許胚胎接觸、定位、黏附、植入的能力，而這一特定時間段被稱為“種植窗(window of implantation，WOI)”，WOI一般在正常月經(jīng)周期第20～24天或LH峰7～10天[1]。 近年來，ER越來越成為生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)的研究重點(diǎn)，但其評估和治療方法研究進(jìn)展甚微。目前，評估ER方法包括宏觀評估(陰道超聲檢查)、微觀評估(子宮內(nèi)膜活檢、基因、分子等)、內(nèi)分泌測定以及宮腔鏡檢查等。本文就評估ER的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為科學(xué)研究與臨床工作提供參考。

1 宏觀評估方法

在ER評估方法中，經(jīng)陰道多普勒超聲具有簡便廉價、分辨率高、無創(chuàng)傷以及可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床。目前ER超聲評估指標(biāo)包括子宮內(nèi)膜厚度(endometrial thickness，EMT)、容積、類型、血流動力學(xué)參數(shù)以及蠕動波。

1.1 子宮內(nèi)膜厚度

EMT是目前評估ER最常見的指標(biāo)。一項(xiàng)回顧性研究表明，在新鮮體外受精與胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)和凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer,FET)中誘導(dǎo)排卵日EMT分別≤8 mm、7 mm時，臨床妊娠率、活產(chǎn)率顯著下降[2]。同時一項(xiàng)Meta分析顯示EMT預(yù)測臨床妊娠準(zhǔn)確性較低，EMT >7 mm時靈敏度和特異度分別為99%和3%，受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線下面積為0.57(95%CI:0.52-0.61)，表明臨床妊娠與未妊娠婦女EMT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[3]。

1.2 子宮內(nèi)膜容積

一般認(rèn)為子宮內(nèi)膜容積(endometrial volume，EMV)評價ER較EMT更準(zhǔn)確。Maged AM等[4]研究發(fā)現(xiàn)取卵日和移植日妊娠組EMV較未妊娠組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一項(xiàng)前瞻性試驗(yàn)也表明EMV≥5 mL時預(yù)測ER的靈敏度較高，特異度較低，可作為排除指標(biāo)[5]。

1.3 子宮內(nèi)膜類型

根據(jù)不同回聲狀態(tài)子宮內(nèi)膜類型可分為A型(外層高回聲，內(nèi)層低回聲，宮腔線高回聲)、B型(內(nèi)層均勻高回聲，宮腔線清晰)、C型(均一高回聲或等回聲，宮腔線不明顯)3種。A型內(nèi)膜種植率和臨床妊娠率明顯高于B型和C型，而C型內(nèi)膜似乎不利于胚胎著床[6]。然而另有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜類型與活產(chǎn)率無顯著關(guān)聯(lián)，不應(yīng)單獨(dú)作為取消周期的決定性因素[3,7]。

1.4 子宮內(nèi)膜血流動力學(xué)參數(shù)

由于子宮動脈終末分支螺旋動脈血流主要供應(yīng)子宮內(nèi)膜，內(nèi)膜血流及血管化程度更適合評價ER，主要包括螺旋動脈阻力指數(shù)(resistance index，RI)和搏動指數(shù)(pulsatility index，PI)，子宮內(nèi)膜下血管化指數(shù)(vascularization index，VI)、血流指數(shù)(flow index，F(xiàn)I)、血管化血流指數(shù)(vascularized blood flow index，VFI)。 PI、RI越小，子宮和卵巢血流灌注越好。Li Z等[8]研究表明臨床妊娠結(jié)局與子宮內(nèi)膜下PI無相關(guān)性，與RI呈負(fù)相關(guān)，與內(nèi)膜下微血管分布呈正相關(guān)。一項(xiàng)Meta分析表明取卵日子宮內(nèi)膜下FI與高臨床妊娠率有關(guān)，新鮮胚胎移植日子宮內(nèi)膜下FI與高臨床妊娠率無關(guān)，而臨床妊娠婦女子宮內(nèi)膜VI、VFI高于非臨床妊娠婦女[9]，總之取卵日內(nèi)膜下FI和移植日VI、VFI可能與IVF-ET妊娠發(fā)生有關(guān)，有助于確定移植的合適時機(jī)。

1.5 子宮內(nèi)膜波狀活動(蠕動波)

正常女性月經(jīng)周期中子宮平滑肌受雌孕激素調(diào)節(jié)引起類似胃腸道蠕動的波動稱為子宮內(nèi)膜蠕動波，可控制胚胎移動與定位。一般蠕動波頻率≤2波/min時臨床妊娠率最高，≥3波/min時臨床妊娠率顯著降低。

2 微觀評估方法

2.1 胞飲突

胞飲突是子宮內(nèi)膜上皮頂端微絨毛水腫融合形成的突起，易受外源性雌孕激素影響，在種植窗口期參與囊胚與子宮內(nèi)膜黏附過程，是ER狀態(tài)的標(biāo)志。2017年Jin XY等[9]報道了126例接受FET婦女的胞飲突并形成發(fā)展中胞飲突(DP)和發(fā)育完全胞飲突(FDP)的百分?jǐn)?shù)評分系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)高胞飲突指數(shù)評分組胚胎著床率和妊娠率也較高。由于胞飲突結(jié)構(gòu)需要在掃描電子顯微鏡下觀察，且為侵入性檢查，價格昂貴，尚處于實(shí)驗(yàn)階段，目前缺乏統(tǒng)一評價標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 ER陣列

ER陣列(endometrial receptive array，ERA)是基于238個基因表達(dá)的定制陣列，與診斷功能容受性子宮內(nèi)膜的計(jì)算預(yù)測因子相結(jié)合，無論其組織學(xué)外觀如何，都可通過比較自然周期或激素替代治療周期測試樣本和對照樣本的轉(zhuǎn)錄圖譜來確定患者ER狀態(tài)，判斷患者的個體化種植窗，進(jìn)而進(jìn)行個體化胚胎移植(personalized embryo transfer，pET)[10]。ERA應(yīng)用的微陣列技術(shù)原理是將被檢測生物細(xì)胞或組織中大量標(biāo)記的核酸序列與已知序列的基因探針進(jìn)行雜交，通過檢測相應(yīng)位置的雜交探針來實(shí)現(xiàn)基因信息的快速檢測[11]。

ERA分子基因檢測技術(shù)的引入對不孕癥患者評估ER以及進(jìn)行pET具有較高的臨床指導(dǎo)價值。2013年Ruiz-alonso M等[10]在一項(xiàng)前瞻性多中心介入性臨床試驗(yàn)中，選取85例反復(fù)植入失敗(repeated implantation failure，RIF)患者作為研究組，25例普通育齡期婦女作為對照組，根據(jù)ERA指導(dǎo)提供“個性化胚胎移植”，導(dǎo)致研究組最終達(dá)到與對照組相似的妊娠率(50.0%)和著床率(38.5%)，表明如果胚胎和“容受性狀態(tài)”子宮內(nèi)膜之間實(shí)現(xiàn)同步，子宮內(nèi)膜源性RIF患者可以達(dá)到正常的著床率和妊娠率。2014年Ruiz-alonso R等[12]報告了一對7次IVF失敗夫婦經(jīng)過pET治療后隨即成功妊娠并足月分娩的個案，隨后進(jìn)行試點(diǎn)研究，17例接受卵母細(xì)胞捐獻(xiàn)的患者(常規(guī)胚胎移植失敗多達(dá)6次)經(jīng)pET治療后，臨床妊娠率達(dá)到了60%，而在ERA診斷的非接受性子宮內(nèi)膜中，常規(guī)ET后妊娠率只達(dá)到了19%。這些案例報告之后，研究者們開始使用ERA指導(dǎo)臨床實(shí)踐中的pET。2015年一項(xiàng)針對印度人群的回顧性研究收集并分析了3組人群[RIF組、一次周期失敗組和子宮內(nèi)膜萎縮(<6 mm)組]的ERA數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示27.5% RIF患者的WOI有移位，而一次周期失敗組只有15%移位[13]；RIF組經(jīng)過pET治療后的總持續(xù)妊娠率和著床率與一次周期失敗組相似。有趣的是，ERA測試顯示25%的萎縮子宮內(nèi)膜組出現(xiàn)了移位WOI，盡管EMT<6 mm，pET后妊娠率可達(dá)66.7%。據(jù)報道無反應(yīng)的4 mm子宮內(nèi)膜也出現(xiàn)類似的情況[14]。2017年一項(xiàng)回顧性分析評估了50例RIF患者中有24% WOI移位，pET后達(dá)到了50%妊娠率[15]，與先前研究結(jié)果類似。因此，ERA指導(dǎo)的pET似乎可顯著改善不明原因RIF患者妊娠率和著床率。

然而，即使上述研究肯定了ERA的臨床價值，仍有部分研究中心認(rèn)為ERA目前是一項(xiàng)不成熟的技術(shù)，否認(rèn)其臨床價值。2018年Tan J等[16]觀察到，和普通ET相比，經(jīng)pET后雖可得到較高的妊娠率和持續(xù)妊娠率(66.7%vs 44.4%，58.3% vs 33.3%)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2019年Cozzolino M等[17]進(jìn)行回顧性多中心隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，ERA測試的使用似乎沒有顯著改善RIF組的妊娠結(jié)局；其他回顧性研究也沒有發(fā)現(xiàn)RIF患者pET與ET之間的臨床差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[18]。以上研究樣本量均較少，且為回顧性研究，故仍需大型前瞻性研究來進(jìn)一步闡明ERA檢測技術(shù)在不孕癥患者中的作用?？傊?，ERA是目前診斷ER最客觀、最準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，同時引入了個體化WOI及pET概念，體現(xiàn)了未來精準(zhǔn)醫(yī)療在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要性，有望成為評估ER以及診斷不孕癥的金標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 子宮內(nèi)膜微生物組與免疫

近幾年研究發(fā)現(xiàn)微生物群落的平衡對器官生理功能發(fā)揮著重要作用。最新研究表明子宮內(nèi)膜存在常駐微生物群，與宮頸陰道菌群只有30%的一致性[19]。 基于測序技術(shù)發(fā)展微生物群落目前被定義為存在于子宮內(nèi)膜水平微生物及其基因組總和。Moreno I等[20]通過16S rRNA序列測定技術(shù)檢測了多達(dá)191個細(xì)菌屬分類單位，最后以乳酸桿菌為主和非乳酸桿菌為主微生物組進(jìn)行區(qū)分，發(fā)現(xiàn)非乳酸桿菌為主微生物組女性的著床率、妊娠率和持續(xù)妊娠率明顯較低。

隨著腸道微生物群及其代謝產(chǎn)物和宿主免疫相互作用的發(fā)現(xiàn)，研究者們開始探索在胚胎著床和胎盤形成過程中子宮內(nèi)膜微生物群與子宮免疫的相互作用[21]。人體子宮內(nèi)膜包含大量免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞，可分泌各種免疫分子和細(xì)胞因子，在胚胎著床、內(nèi)膜蛻膜化及維持妊娠中發(fā)揮重要作用[22]。越來越多的證據(jù)表明子宮內(nèi)膜免疫依賴于Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞、先天淋巴細(xì)胞與抑制性Foxp3+ Treg細(xì)胞的相互作用[23]。先天免疫系統(tǒng)通過模式識別受體感知病原體相關(guān)分子模式，如Toll樣受體、RIG-I樣受體以及NOD樣受體[24]。激活Toll樣受體可誘導(dǎo)核因子-κB信號通路，通過各種銜接蛋白啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)以產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)[25]。2021年Basatvat S等[26]通過定量實(shí)時PCR比較健康婦女接受前(LH+2)和接受性(LH+8)子宮內(nèi)膜活檢的基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)接受性子宮內(nèi)膜活檢(LH+8)中的Toll樣受體-5和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-β顯著下降；但RIF婦女子宮內(nèi)膜活檢組織中的Toll樣受體-9基因顯著上調(diào)。目前還需要研究來進(jìn)一步闡明子宮內(nèi)膜微生物群生物多樣性對生殖的影響、子宮內(nèi)膜環(huán)境中微生物定植和存活的機(jī)制以及微生物免疫潛在激活的所有信號通路等。

2.4 分子標(biāo)記物

2.4.1 同源盒基因A 同源盒基因A(Homeobox gene A， HOXA)是含有同源盒的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，具有高度保守的同源域結(jié)構(gòu)，其中HOXA10在月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜發(fā)育中起核心作用， HOXA10表達(dá)與雌激素和孕激素水平有關(guān)，黃體期表達(dá)增加，并在WOI達(dá)到峰值水平。HOXA10可改善ER，并接收胚泡信號，修飾子宮內(nèi)膜使其蛻膜化，使滋養(yǎng)層侵入和胎盤形成成為可能，可作為良好的ER標(biāo)志物。近年來HOXA10的上游調(diào)控得到了驗(yàn)證，S期激酶相關(guān)蛋白2 (S-phase kinase associated protein 2，SKP2)屬于F-box蛋白家族成員，SKP2通過促進(jìn)HOXA10的降解抑制HOXA10蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，進(jìn)而抑制子宮內(nèi)膜增殖和卵泡黏附，降低ER， SKP2也被定義為ER標(biāo)志物，并作為不孕癥診斷和治療靶點(diǎn)[27]。

2.4.2 白血病抑制因子 白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)在胚胎-子宮內(nèi)膜相互作用、基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化、滋養(yǎng)層侵襲、子宮白細(xì)胞浸潤、胚泡生長、前列腺素合成以及胚胎著床過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[28]。最新研究發(fā)現(xiàn)LIF基因在健康育齡婦女中接受期子宮內(nèi)膜活檢較接受前表達(dá)上調(diào)，然而尚未發(fā)現(xiàn)健康女性與IVF失敗個體子宮內(nèi)膜活檢LIF mRNA表達(dá)變化，與先前報道不孕婦女子宮沖洗液中LIF濃度明顯低于健康女性結(jié)果不同。LIF的具體作用機(jī)制需進(jìn)一步探討[26]。

2.4.3 整合素 整合素(integrin，ITG)是由α、β亞基非共價連接組成的跨膜糖蛋白家族，參與細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附，同時介導(dǎo)胚胎著床，決定胚胎侵入性。整合素αvβ3及其配體骨橋蛋白在整個正常月經(jīng)周期協(xié)同表達(dá)，且于分泌中期表達(dá)增多，與種植窗口期協(xié)同一致。相關(guān)研究表明不明原因不孕患者子宮內(nèi)膜整合素β3 mRNA表達(dá)水平明顯低于育齡婦女(P=0.043)[29]。分泌型磷酸蛋白-1，也稱骨橋蛋白，與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞表面整合素結(jié)合，與LIF、載脂蛋白D和瘦素相互作用，刺激細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的黏附和通訊，在胚胎著床過程中發(fā)揮重要作用，相關(guān)研究也證實(shí)各種生殖障礙婦女分泌中期子宮內(nèi)膜中骨橋蛋白失調(diào)[30]。近幾年ITGB8也在上皮細(xì)胞生長調(diào)控中被報道，ITGB8通過激活子宮下游信號分子黏著斑激酶促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的蛻膜化以及滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲進(jìn)而獲得胚胎著床[31]。

2.4.4 基質(zhì)金屬蛋白酶 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs )是一類可水解細(xì)胞間基質(zhì)與細(xì)胞膜的蛋白水解酶，與多種組織重建的生理和病理過程有關(guān)，如月經(jīng)發(fā)生、排卵、乳腺發(fā)育、腎臟炎癥、甲狀腺疾病及多種腫瘤發(fā)生。已證實(shí)MMP-9在子宮內(nèi)膜黃體中期特異性表達(dá)增加，有助于胚胎植入。目前MMPs研究尚少。

2.4.5 微小RNAs 微小RNAs是由細(xì)胞通過外泌體、凋亡小體、脂質(zhì)結(jié)合體或RNA結(jié)合復(fù)合蛋白分泌； Kuokkanen S等[32]研究發(fā)現(xiàn)，分泌中期子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞miR30b、miR-30d以及miR-31 較增殖后期表達(dá)上調(diào)[33]。近期Chen CH等[34]創(chuàng)新性通過panel chip多基因表達(dá)譜平臺并借助實(shí)時PCR技術(shù)來篩選可能成為種植窗標(biāo)記物的微小RNAs。該研究對36例不孕女性的子宮內(nèi)膜進(jìn)行活檢的同時進(jìn)行ERA測試，最終鑒定出6種在RIF組(n=8)和對照組(n=17)中差異表達(dá)的微小RNAs，分別是 hsa-mir-155-5p、hsa-mir-20b-5p、hsa-mir-330-5p、hsa200 mir-718、hsa-mir-940以及 hsa-mir-144-3p，與ERA測試結(jié)果一致，表明RIF組和對照組子宮內(nèi)膜表達(dá)具有差異性。研究中RIF定義為2次IVF失敗，而不是3次，只有極少數(shù)(13/36，36%)的受試婦女是因RIF接受IVF治療，其余(23/36，64%)為對照組，均為首次移植周期。

2.4.6 其他相關(guān)因子 集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 、細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)以及免疫球蛋白超家族(immunoglobin-super family,IG-SF)等也被認(rèn)為與ER相關(guān)，但其具體作用還須進(jìn)一步研究。

2.5 蛋白組學(xué)與脂質(zhì)組學(xué)

2020年Kasvandik S等[35]使用質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從6名健康育齡婦女分泌期子宮腔液中檢測到3 158種蛋白質(zhì)，其中367種在分泌早期子宮內(nèi)膜向中期轉(zhuǎn)變時發(fā)生了顯著的蛋白質(zhì)組學(xué)變化(P<0.05)；又用靶向技術(shù)發(fā)現(xiàn)21種蛋白質(zhì)在對照組早期和RIF組中期內(nèi)膜之間水平相似，表明RIF組WOI位移；也證明蛋白檢測能較好地評估ER。

胞外囊泡作為細(xì)胞間信號傳遞信使在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞與上皮細(xì)胞相互作用中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)胚胎著床。一項(xiàng)人類外泌體實(shí)驗(yàn)已證實(shí)胞外囊泡參與分泌中期子宮內(nèi)膜功能表達(dá)[36]。2019年一項(xiàng)病例對照研究從41例接受全冷凍周期治療的患者中收集子宮內(nèi)膜液樣本，通過分析內(nèi)膜液中脂質(zhì)成分，并構(gòu)建ROC曲線，曲線下面積為84.0%，表明子宮內(nèi)膜液脂質(zhì)組學(xué)特征可用于確定WOI確切時間，可有效降低反復(fù)種植失敗發(fā)生率[37]。

3 其他評估方法

3.1 內(nèi)分泌測定

雌激素(estrogen，E2)和孕激素(progestogen，P)通過相應(yīng)受體調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜，在胚胎植入中起主導(dǎo)作用，還涉及多種因子表達(dá)，如同源盒轉(zhuǎn)錄因子、前列腺素以及生長因子。E2與子宮基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞受體結(jié)合，通過旁分泌、自分泌調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。Ncoa6， 雌激素受體的輔激活劑，正常生理?xiàng)l件下可增強(qiáng)受體泛素化并加速其降解，減弱E2靈敏度，有助于子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)開放，目前E2靈敏度調(diào)節(jié)ER的潛在機(jī)制尚不清楚，相反，Ncoa6的缺失導(dǎo)致E2過度響應(yīng)誘發(fā)植入失敗[38]。孕激素受體在女性卵巢、子宮內(nèi)膜中均有表達(dá)，且受P、E2、胰島素、胰島素生長因子-1等激素調(diào)節(jié)，在生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。有研究表明不明原因不孕患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞孕激素受體呈低表達(dá)[39]?？傊瓻2、P及其受體是決定ER窗口期的關(guān)鍵因素，其具體分子機(jī)制尚未明晰。

3.2 宮腔鏡評估ER

宮腔鏡檢查目前常用于IVF-ET失敗、實(shí)驗(yàn)室可獲得優(yōu)質(zhì)胚胎卻不能成功妊娠的患者。當(dāng)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜肌瘤、息肉以及宮腔粘連時可予相應(yīng)處理，對于宮腔無明顯病變者可于種植窗口期進(jìn)行血管及腺體檢查來評估ER。然而近期一項(xiàng)研究提示常規(guī)宮腔鏡檢查并未改善超聲提示宮腔形態(tài)正常的不孕患者IVF妊娠結(jié)局[40]。Smit JG等[41]研究也表明超聲提示宮腔形態(tài)正常的RIF患者在IVF前進(jìn)行宮腔鏡檢查并不能顯著改善活產(chǎn)率。因此目前認(rèn)為單純宮腔鏡檢查并未改善ER，在臨床實(shí)踐中不常規(guī)使用。

綜上，如何提高臨床妊娠率一直是生殖領(lǐng)域研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，良好的ER依然是著床成功的關(guān)鍵。評價ER方法眾多，但仍缺乏評估金標(biāo)準(zhǔn)，各種無創(chuàng)和有創(chuàng)評估手段仍需更多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)來支持。