牛強 王瀟懿 張周陽 寧小娜 郭維維 張羽博翰 呂前欣 王樂 劉富偉 張浚睿

骨結合效果是牙種植體遠期成功率的重要決定因素[1]。天然骨組織是由納米級尺度的膠原纖維、礦物鹽結晶等逐步組裝成微米級尺度的骨小梁、哈佛式系統(tǒng)，進而形成宏觀尺度的松質骨、皮質骨[2]。因此，僅從仿生學的角度，在種植體表面構建具有微米級、納米級的梯度仿生形貌，將有助于促進骨結合效果。

基于上述理念，多種表面形貌改性技術已應運而生，如噴砂、陽極氧化、等離子沉積、水熱處理、激光蝕刻等，可構建出納米管、突、刺、溝槽等多種形貌。研究報道，表面形貌改性可提升鈦及鈦合金表面親水性，減低骨組織剪切力，并有利于細胞粘附、成骨分化以促進骨結合效果[3]。然而，臨床上牙種植體在植入與長期應用過程中，材料與周圍骨組織間界面將產(chǎn)生較大應力，易造成材料破壞、涂層脫落。而脫落的材料顆粒將可能通過激活巨噬細胞炎癥小體等機制引發(fā)界面慢性炎癥，不利于新骨形成，并造成種植體溶骨性松動。這種由涂層強度不足造成的生物安全性問題成為制約表面改性技術臨床應用的關鍵[4]。

本研究將通過聯(lián)用酸蝕、磁控濺射技術，旨在構建一種兼顧涂層強度與生物安全性雙重要求的，微米級、納米級梯度仿生形貌涂層，以滿足臨床應用。

1 材料與方法

1.1 涂層構建及形態(tài)觀察

鈦片(? 15 mm×1 mm, 西安中邦生物鈦科技有限公司)；鈦酸鍶靶材(? 75 mm×10 mm，北京匯方圓科技有限公司)；丙酮、 無水乙醇(天津富宇化學試劑有限公司)； 去離子水、氫氟酸(HF，天津致遠化學試劑有限公司)。砂紙打磨，直至鈦片表面光如鏡面，得到光滑組鈦片。在此基礎上，將制備好的光滑鈦片浸泡于2.5%濃度氫氟酸中3 min，對表面進行酸蝕，得到微米級形貌。隨后以鈦酸鍶為靶材通過磁控濺射技術(功率80 W，濺射時間7 200 s，基靶間距10 cm，室溫)在微米級形貌表面進一步構建納米粒形貌，形成微米級、納米級梯度仿生形貌。最后通過場發(fā)掃描電鏡(FE-SEM， S-4800，日立公司， 日本)對該表面進行形貌觀察。

1.2 涂層強度檢測

采用納米劃痕試驗對該新型涂層強度進行檢測。對照組選擇經(jīng)典形貌納米管，制備方法如下：微米級形貌制備如前，隨后在0.5% HF電解液中陽極氧化處理30 min(電壓20 V，金屬鉑作為陰極)；處理完畢后，依次經(jīng)丙酮、無水乙醇、蒸餾水超聲振蕩清洗，烘干塑封，鈷-60照射消毒。

納米劃痕試驗：將鈦片置于劃痕儀上，通過聲發(fā)射法檢測壓頭在不斷加力過程中涂層劃破或剝落時的臨界載荷，由此得到涂層與基體的臨界載荷，于掃描電鏡下觀察記錄。

1.3 實驗動物

8周齡雄性SD大鼠， 體重260～300 g(空軍軍醫(yī)大學動物實驗中心)。

1.4 涂層生物安全性檢測

1.4.1 皮膚刺激與遲發(fā)性超敏試驗 浸提液的制備：根據(jù)國家標準(GB/T 16886.12-2017)中浸提液體積計算公式，以每個鈦片對應1.178 mL PBS， 在(37±1) ℃， (24±2) h條件下完成浸提液制備。

皮膚刺激試驗：SD大鼠10 只，分籠飼養(yǎng)，分為光滑鈦片組(對照組，n=5)和新型涂層組(實驗組，n=5)，在同等條件下自由飲食，適應性飼養(yǎng)1 周。

根據(jù)國家標準(GB/T 16886.10-2017)，大鼠背部備皮消毒后，在相應皮膚部位放置2.5 cm×2.5 cm大小的貼敷片，將0.5 mL光滑鈦片或新型涂層浸提液滴到觀察部位貼敷片中，對照部位滴浸提溶劑(PBS)。用繃帶固定4 h后墨水標記，除去敷貼片后1、 24、 48、 72 h記錄接觸部位情況。

遲發(fā)型超敏反應：SD大鼠10 只，分為光滑鈦片組(對照組，n=5)和新型涂層組(實驗組，n=5)，同等條件自由飲食，適應性飼養(yǎng)1 周。

誘導階段：將2.5 cm×2.5 cm大小的敷貼片浸透新型涂層浸提液，局部貼敷于動物左上背部位，繃帶包扎， 6 h后除去包扎帶和敷貼片。 1 周中連續(xù)3 d重復該步驟，同法操作3 周。貼敷光滑鈦片浸提液組大鼠作為對照。

激發(fā)階段：最后一次誘導貼敷后14 d(±1 d)，分別用光滑鈦片或新型涂層發(fā)浸提液對對照動物和試驗動物進行激發(fā)，將2.5 cm×2.5 cm大小的敷貼片浸透浸提液，貼敷于每只動物去毛的未試部位(誘導階段未貼敷部位)，包扎固定。6 h后除去固定器、包扎帶和貼敷片。激發(fā)24 h后，用溫水徹底清洗脫毛區(qū)，毛巾擦干后放回籠中，2 h后觀察動物試驗部位皮膚有無紅斑及水腫等，再過24 h(即激發(fā)后48 h)，再觀察一次并記錄。

1.4.2 全身毒性試驗 根據(jù)國家標準(GB/T 16886.11-2011)，SD雄性大鼠15 只，分籠飼養(yǎng)，分為正常健康組(空白組，n=5)，光滑鈦片組(對照組，n=5)和新型涂層組(實驗組，n=5)，在同等條件下自由飲食，適應性飼養(yǎng)1 周。

從籠內(nèi)將大鼠取出，根據(jù)體表標記識別動物編號。用16#灌胃注射器抽取相應組別浸提液3 mL，排空注射器內(nèi)的空氣，將灌胃針頭由大鼠左側口角，順著上顎后壁插入咽部，沿著平行于動物的縱軸，把灌胃針頭插入胃部，穩(wěn)定推動針芯，慢慢注入受試物。大鼠給藥后前3 d每天測量體重并記錄；給藥2 周后取材，取大鼠心、肝、脾、肺、腎組織固定包埋成蠟塊，行切片及HE染色，觀察評價各組織臟器病理表現(xiàn)。

1.4.3 溶血試驗 根據(jù)國家標準(GB/T 16886.4-2016)，采用正常大鼠外周血溶血實驗評價種植體血液相容性。首先取5 mL大鼠外周血1 500 r/min離心15 min，取下層紅細胞，用生理鹽水離心洗滌紅細胞3 次，隨后，用 PBS 溶液將紅細胞稀釋10 倍。然后，取 0.3 mL 稀釋后的紅細胞懸浮液，分別加入 1.2 mL 的 PBS(-)和 1.2 mL 的0.1% Triton X-100(破膜液，溶血率≈100%)作為陰性對照和陽性對照。另外取光滑鈦片浸提液和新型涂層浸提液1.2 mL，分別加入0.3 mL稀釋后的紅細胞。2 h 后，1 500 r/min離心15 min，取上清液，通過 UV-vis 分光光度計測試上層清液的吸光值。使用下面的公式計算紅細胞的溶血百分率：溶血率(100%)=[(樣本吸光值-陰性對照吸光值)/(陽性對照吸光值-陰性對照吸光值)]×100%。

1.4.4 血清生化參數(shù)分析 選取空白組及實驗組大鼠各10 只，通過眼球取血法取1 mL外周血6 000 r/min離心5 min,吸出上層血清，于西京醫(yī)院檢驗科檢測血清ALT、AST、CK-MB及BUN水平，通過SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 高強度仿生形貌涂層構建

掃描電鏡結果顯示，通過聯(lián)用酸蝕、磁控濺射技術，可在光滑純鈦基底表面(圖 1)制備具有微米級、納米級梯度結構的仿生形貌(圖 1)。其中， 1 000 倍下可見溝壑樣微米結構； 30 000 倍下可見以圓頓的凸起為主納米結構，均勻分布。

圖 1 高強度仿生形貌涂層構建及觀察

2.2 涂層強度檢測

納米劃痕試驗顯示，鈦表面經(jīng)典形貌納米管，在0～100 N逐漸加力的過程中(從左至右)，在28 N附近發(fā)生明顯的涂層斷裂、剝落現(xiàn)象(圖 2)。而新型高強度仿生形貌涂層在0～100 N逐漸加力的過程中，其形成劃痕較納米管組淺，表明該新型涂層表面硬度高，且僅在接近100 N處出現(xiàn)少量的涂層斷裂、剝落現(xiàn)象，表明該新型涂層與基底結合強度好，可以滿足臨床應用需要(圖 2)。

圖 2 新型高強度仿生形貌涂層與經(jīng)典形貌納米管的涂層強度對比

2.3 生物安全性檢測

在大鼠背部所示相應部位(圖 3A)，貼敷光滑鈦片(對照組)或新型涂層(實驗組)浸提液14 d后，大體觀察可見，大鼠未出現(xiàn)皮膚刺激癥狀(圖 3B)；同時與對照組大鼠相比，實驗組未出現(xiàn)遲發(fā)性超敏反應(圖 3C)；進行灌胃后，新型涂層浸提液組大鼠體重變化情況與光滑鈦片浸提液組無顯著差異(423.3±11.2 gvs. (429±10.07) g,P>0.05， 圖 3D)；通過HE染色檢測新型涂層浸提液對大鼠全身重要臟器的影響，結果顯示，實驗組大鼠與健康對照大鼠無明顯差異，具體表現(xiàn)為：心肌排列整齊，無壞死及炎性細胞浸潤等；肝小葉結構清晰完整，肝索排列整齊，肝細胞均勻致密，形態(tài)正常且無壞死,無明顯炎性細胞浸潤現(xiàn)象；脾臟組織結構正常，紅、白髓分界清晰，脾小結較多，大小較為一致；肺臟組織完整，無水腫、出血、透明膜形成及上皮細胞損傷等；腎小球體積正常，系膜細胞和上皮細胞無壞死、水腫，無透明管型等；表明該新型涂層浸提液不會對心、肝、脾、肺、腎這些重要臟器產(chǎn)生毒性作用(圖 3F)，溶血試驗是植入材料必須檢測的指標，發(fā)現(xiàn)實驗組溶血率(3.51%±1.04%)與正常組(2.90%±0.65%)間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖 3E)。血清生化分析結果顯示，實驗組大鼠較正常組大鼠ALT〔(45.00±2.74) U/Lvs.(48.89±19.14) U/L〕、 AST〔(92.50±4.98) U/Lvs.(104.11±31.52) U/L〕、 BUN〔(7.74±0.45) mmol/Lvs.(6.00±0.60) mmol/L〕及CK-MB〔(408.80±42.17) U/Lvs.(516.44±33.24) U/L〕水平均無統(tǒng)計學差異(表 1)。

表 1 血清生化檢測

3 討 論

自骨結合理論提出開始，基于鈦及鈦合金等生物材料的替代重建技術已被廣泛應用于口腔缺牙種植修復、贗復體固定、骨缺損修復等多種領域[5]。僅以口腔種植為例，我國種植牙已超過200 萬顆，成為全球種植牙增速最快的市場[6]。骨結合效果是牙種植體長期行使功能的重要決定因素，如何又快、又好的實現(xiàn)骨結合是生物植入材料領域關心的重要問題。

天然骨組織在微觀上具有微米級、納米級的梯度結構，基于仿生學理念，在種植體表面構建出近似天然骨組織微觀梯度形貌將有助于骨結合效果[7-8]。其中，微米級形貌在尺度上與天然骨組織中骨小梁、哈佛式系統(tǒng)等相近，可以有效增加種植體與骨組織的接觸面積，使二者形成機械嵌合，并降低界面處骨組織在咀嚼運動時受到的剪切力，從而促進種植體穩(wěn)定[9-11]。同時，微米級形貌也可改善植入材料親水性，吸引蛋白粘附以促進骨結合。納米級形貌在尺度上與天然骨組織中膠原纖維、礦物鹽顆粒等細胞外基質成分相近[12]。研究顯示，納米級形貌在對細胞影響上較微米級形貌更直接，可顯著促進成骨細胞、骨髓間充質干細胞等成骨相關細胞的粘附，并通過整合素介導的細胞骨架力學傳遞通路，或黏著癍激酶相關通路促進細胞增殖及分化[13-16]。同時，隨著骨免疫學的發(fā)展，納米級形貌對巨噬細胞等免疫細胞及相關炎癥反應的調控作用也越來越受到人們重視。由此研究者開發(fā)了多種技術以制備上述形貌。

現(xiàn)階段，能夠在以鈦及鈦合金為代表的金屬植入材料表面構建微米級形貌的主要方法有噴砂、酸蝕等，這也是目前臨床種植體主要的形貌制備方法[17]。而在納米級形貌構建上，陽極氧化、等離子沉積、水熱處理等是常用方法，可以構建出納米管、突、刺等多種形貌，具有良好的促成骨效果。然而臨床上牙種植體在植入與長期應用過程中，材料與周圍骨組織間界面將產(chǎn)生較大應力，上述工藝方法制備涂層的強度難以滿足該要求，涂層易破壞、脫落。巨噬細胞在吞噬這些脫落的涂層顆粒時將大量釋放促炎因子，造成界面過度炎癥反應，不利于新骨形成，甚至破壞周圍骨質。同時多轉為慢性炎癥，造成溶骨性松動，是種植體遠期失敗的重要因素[18-19]。近年來，激光蝕刻等新型技術被引入金屬材料形貌構建上，具有強度高、可控性強、精細度高等優(yōu)勢，但此類技術制備成本高昂，不利于產(chǎn)業(yè)化推廣[20]。

為解決上述問題，本研究通過聯(lián)用酸蝕、磁控濺射技術，在鈦表面構建了一種兼顧涂層強度與生物安全性雙重要求的，具有微米級、納米級梯度仿生形貌的新型涂層。形成的納米結構主要為圓頓的凸起，均一、穩(wěn)定、可控性高。與經(jīng)典的納米形貌，納米管相比，新型涂層具有顯著的表面硬度及界面結合強度優(yōu)勢，能夠滿足臨床應用需求。同時，基于國家標準，對該新型涂層的生物安全性進行系統(tǒng)檢測，證實其在體生物安全性高，與純鈦無統(tǒng)計學差異，有望快速轉化。此外，該涂層由于選擇了鈦酸鍶作為磁控濺射靶材，其表面中也添加入了鍶元素，鑒于雷尼酸鍶等鍶鹽類藥物在骨質疏松等疾病中的積極治療作用，該新型涂層也勢必具有一定的藥物促成骨效果。

綜上所述，本研究構建了一種微米級、納米級梯度仿生形貌的新型涂層，該涂層具有高強度、高生物安全性的特點，具有良好的臨床轉化應用前景。