劉洋 孫榮 戰(zhàn)德松 張文潔 權(quán)慧欣

舌癌是口腔癌中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其預(yù)后與臨床分期密切相關(guān)[1-2]。舌癌的早期臨床表現(xiàn)不典型，常被患者忽視，大部分患者就診時(shí)已是中晚期，延誤了治療時(shí)機(jī)，預(yù)后較差。目前舌癌的診斷主要依靠組織活檢及病理學(xué)檢測(cè)，病理活檢給患者造成了手術(shù)創(chuàng)傷，對(duì)于隱蔽且較小的病損容易遺漏靶組織，且有可能造成腫瘤細(xì)胞的種植和轉(zhuǎn)移。因此，臨床上需要一種微創(chuàng)而靈敏的舌癌早期診斷技術(shù)，既可以早發(fā)現(xiàn)診斷、又能減小手術(shù)創(chuàng)傷，對(duì)患者接受程度和預(yù)后效果均有很大幫助。

拉曼光譜(Raman spectrum)是入射光照射到物質(zhì)上產(chǎn)生的一種散射光譜，光譜中的拉曼位移代表了被測(cè)物質(zhì)中分子振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)頻率，與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，幾乎每種物質(zhì)都有其特定的拉曼光譜[3]。表面增強(qiáng)激光拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectrum，SERS)技術(shù)，是利用激光與樣品內(nèi)部粒子(如分子、原子、電子等)相互作用后產(chǎn)生的特征性峰譜來(lái)鑒別樣品的一門光譜技術(shù)，它具有高分辨率、高靈敏度以及無(wú)損、快速等優(yōu)點(diǎn)[4]。表面增強(qiáng)激光拉曼光譜檢測(cè)不受檢測(cè)樣品形態(tài)的限制，適于含水生物樣品的檢測(cè)，樣品需求量小。目前，血清的表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)在腫瘤學(xué)診斷的研究中已被廣泛應(yīng)用[5-7]。

1 材料與方法

1.1 血清樣本制備

通過(guò)4NQO飲水法[8]建立舌癌動(dòng)物模型，選擇18 只經(jīng)病理診斷確診為舌癌的SD大鼠(27 周，雄性，舌癌組)和15 只正常健康SD大鼠(27 周，雄性，對(duì)照組)，禁食水12 h后，頸椎脫位法處死，經(jīng)心臟采血2～4 mL， 3 000 r/min離心10 min，提取上清液獲得血清樣本。按1∶1體積比加入增強(qiáng)表面活性的銀膠溶液，4 ℃震蕩10 s混合均勻，玻璃毛細(xì)管吸取待測(cè)血清至管內(nèi)約2 cm長(zhǎng)，平置于拉曼光譜儀檢測(cè)平臺(tái)上。

1.2 儀器和軟件

共焦顯微拉曼光譜儀(LabRAM HR800，HORIBA Jobin Yvon， 法國(guó))，激發(fā)光源為波長(zhǎng)632.8 nm的He-Ne激發(fā)光，功率20 mW，分辨率0.65 cm-1；繪圖與數(shù)據(jù)處理軟件(Origin 8.0， OriginLab， 美國(guó))。拉曼光譜儀系統(tǒng)設(shè)置：拉曼光譜系統(tǒng)在測(cè)量前使用標(biāo)準(zhǔn)硅片的 520 cm-1進(jìn)行定標(biāo)，設(shè)置曝光時(shí)間10 s，積分4 次，掃描范圍450～1 750 cm-1， 50×物鏡聚焦。每個(gè)樣本測(cè)試3 個(gè)點(diǎn)。

1.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理

應(yīng)用Origin 8.0軟件對(duì)所有表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑、基線校正和歸一化預(yù)處理。其中平滑處理選用Savitzky-Golay 算法的3 次多項(xiàng)式9 點(diǎn)平滑。將每個(gè)樣本的3點(diǎn)測(cè)得的表面增強(qiáng)拉曼光譜值取均值，以代表其拉曼光譜信號(hào)大小。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)、線性判別分析(LDA)和受試者操作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線分析。

2 結(jié) 果

2.1 表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)的檢測(cè)結(jié)果

2 組血清SERS的外形和譜峰位置基本相似，相對(duì)峰值強(qiáng)度略有差別。對(duì)照組各樣本SERS較為一致，舌癌組各樣本間SERS離散程度較大(圖 1)。

圖 1 2 組血清的SERS

2 組血清平均SERS比較見(jiàn)圖 2。 2 組血清的平均表面增強(qiáng)拉曼光譜形狀和譜峰位置基本相似，主要在a(490～630 cm-1)和 c(950～1 120 cm-1)波段內(nèi)，舌癌組血清SERS的譜峰強(qiáng)度高于對(duì)照組，而在b(880～940 cm-1)和d(1 200～1 310 cm-1)波段內(nèi)，舌癌組血清SERS的譜峰強(qiáng)度則低于對(duì)照組。在峰位725 cm-1和815 cm-1兩處的峰強(qiáng)比較可見(jiàn)，舌癌組明顯低于正常對(duì)照組。

圖 2 舌癌血清和正常血清平均SERS比較和差異圖

2.2 SERS主成分(PC)分析結(jié)果

PC分析是從多個(gè)數(shù)值變量(指標(biāo))之間的相互關(guān)系入手，通過(guò)降維思路，將多個(gè)變量(指標(biāo))化為少數(shù)幾個(gè)互不相關(guān)的綜合變量(指標(biāo))的統(tǒng)計(jì)方法[9]。通常采用累計(jì)方差貢獻(xiàn)率大于85%來(lái)確定主成分個(gè)數(shù)。對(duì)2 組血清SERS進(jìn)行PC分析，共得到9 個(gè)PC，各PC得分見(jiàn)表 1。

表 1 2 組血清主成分(PC)得分

其中，根據(jù)累計(jì)方差貢獻(xiàn)率大于85%，確定了兩組血清的第一、 二、 三主成分(PC1、PC2、PC3)來(lái)代表兩組血清的成分特征， 這三個(gè)主成分得分的方差累計(jì)貢獻(xiàn)率為90.45%(表 2)。利用PC1、PC2、PC3得分繪制二維和三維散點(diǎn)圖(圖 3)。可以直觀的看出PC1、PC2、PC3區(qū)分舌癌血清和正常血清。

表 2 各主成分特征值、方差貢獻(xiàn)率及累積方差貢獻(xiàn)率

圖 3 2 組血清PC1、PC2和PC3得分2D和3D散點(diǎn)圖

2.3 SERS靈敏度分析

根據(jù)第一、二、三主成分得分對(duì)2 組血清SERS進(jìn)行線性判別分析，結(jié)果顯示SERS對(duì)于舌癌血清的判別靈敏性為94.4%，特異性為100%，對(duì)判別效果采用交叉驗(yàn)證得到判別靈敏性94.4%(17/18)，特異性93.3%(14/15)，見(jiàn)表 3。同時(shí)，以兩組血清的判別得分來(lái)構(gòu)建ROC曲線，橫座標(biāo)為1-特異度，縱座標(biāo)為靈敏度。ROC曲線下面積為： 0.996，提示判別分析結(jié)果準(zhǔn)確性較高(圖 4)。

表 3 2 組血清SERS判別分析和交叉驗(yàn)證結(jié)果 [n(%)]

圖 4 ROC 曲線圖

3 討 論

血清學(xué)檢測(cè)在癌癥診斷中的應(yīng)用日趨廣泛[10-13]，但目前的血清學(xué)檢測(cè)多使用生物化學(xué)方法，這需要腫瘤標(biāo)志物在血清中達(dá)到一定濃度時(shí)才顯示有效， 特異度和靈敏性較低。拉曼光譜被稱為物質(zhì)的“指紋性振動(dòng)譜”，可以從分子水平上提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能信息[14]。 Králová等[15]對(duì)結(jié)直腸癌患者的血清進(jìn)行了SERS檢測(cè)，經(jīng)主成分分析，診斷靈敏度100%，特異度94%。Lin 等[16]對(duì)鼻咽癌患者血清進(jìn)行了表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)，經(jīng)多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到判別靈敏度為89.3%，特異性為71.4%。Chen 等[17]采用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)對(duì)膀胱癌患者進(jìn)行血清學(xué)檢查，得到判別準(zhǔn)確率97.8%。以上臨床研究均說(shuō)明表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)對(duì)癌癥患者血清和正常血清或不同階段癌癥患者間的血清均能進(jìn)行有效區(qū)分，并且具有較高的判別靈敏性和特異性。

通常一條拉曼光譜所包含的物質(zhì)成分信息可通過(guò)對(duì)譜峰的組成、峰位、峰寬及峰強(qiáng)等變化表現(xiàn)出來(lái)，譜峰組成及強(qiáng)度高低一般與樣品內(nèi)成分的性質(zhì)與含量多少密切相關(guān)[18]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)舌癌血清與對(duì)照血清拉曼光譜形狀及譜峰位置大體上相似(圖 1所示)，未發(fā)現(xiàn)能鑒別二者的特征峰，說(shuō)明兩組血清所含的成分基本相似。對(duì)本研究中測(cè)得的SERS譜峰進(jìn)行歸屬指認(rèn)發(fā)現(xiàn)，這些特征峰主要來(lái)自蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、碳水化合物、脂類、堿基和維生素中各種化學(xué)鍵不同振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)模式，包括伸縮振動(dòng)、彎曲振動(dòng)、環(huán)振動(dòng)、對(duì)稱伸縮和α-螺旋[19-22]。癌癥組血清SERS較為離散，可能是由于其樣本來(lái)自于癌變的不同階段，血清中物質(zhì)含量有所差別所致；而對(duì)照組均為正常血清樣本，血清中各成分較為穩(wěn)定，因此對(duì)照組SERS比較一致。通過(guò)對(duì)兩組血清表面增強(qiáng)拉曼光譜的均值比較發(fā)現(xiàn)，舌癌血清和正常血清的表面增強(qiáng)拉曼光譜的外形和譜峰位置雖基本相似，但在大約490～630 cm-1和 950～1 120 cm-1波段內(nèi)，舌癌組血清表面增強(qiáng)拉曼光譜的譜峰強(qiáng)度高于對(duì)照組，而在880～940 cm-1和1 200～1 310 cm-1波段內(nèi)，舌癌組血清表面增強(qiáng)拉曼光譜的譜峰強(qiáng)度則低于對(duì)照組(圖 2)。 其中725 cm-1和815 cm-1波段分別是由腺嘌呤、輔酶A的C-H鍵彎曲振動(dòng)和L-絲氨酸、谷胱甘肽的C-C-O鍵伸縮振動(dòng)產(chǎn)生[21]，這兩處譜峰強(qiáng)度的比較可見(jiàn)，舌癌組的峰值強(qiáng)度明顯低于正常對(duì)照組。提示兩組血清雖然主要成分相似，但各成分的含量存在差異。因此，本研究進(jìn)一步通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)表面增強(qiáng)拉曼光譜數(shù)據(jù)中的主成分分子進(jìn)行判別分析。通過(guò)主成分分析方法尋找出九個(gè)能夠代表兩組血清SERS的全部信息的指標(biāo)作為特征性成分，選取累計(jì)貢獻(xiàn)率為90.45%的前三個(gè)主成分，繪制二維和三維散點(diǎn)圖(圖 3)，從而將兩組血清特性很好的區(qū)分出來(lái)。在此基礎(chǔ)上采用Fisher判別分析，結(jié)果顯示表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)對(duì)于舌癌血清的判別靈敏性和特異性分別為94.4%和100%。但本研究樣本量較小，為防止判別偏移，采用了交叉驗(yàn)證法進(jìn)一步評(píng)價(jià)該技術(shù)對(duì)于舌癌血清的判別效果。經(jīng)交叉驗(yàn)證后，得到表面增強(qiáng)拉曼光譜對(duì)于舌癌血清的判別靈敏性和特異性分別為94.4%和93.3%，診斷準(zhǔn)確率為94%，判別效果較好。根據(jù)兩組判別分析得分繪制ROC曲線，得到曲線下面積為0.996，同樣說(shuō)明了表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)對(duì)于舌癌血清的診斷準(zhǔn)確性較高。

本研究表明，表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)可以很好的區(qū)分舌癌血清及正常血清，且具有較高的判別靈敏度和特異度，診斷準(zhǔn)確率較高，有望成為舌癌早期診斷的重要方法，值得深入研究其臨床價(jià)值并不斷完善其應(yīng)用技術(shù)。