夏秋菊，練佳儀，胡向國，李莉，查顯豐

（暨南大學 附屬第一醫(yī)院 臨床醫(yī)學檢驗中心，廣東 廣州 510632）

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏癥是X染色體連鎖不完全顯性遺傳病，俗稱“蠶豆病”，是新生兒高膽紅素血癥常見和重要的危險因素之一［1］。G6PD缺乏癥是世界上最常見的單基因遺傳病之一，全球約有4億人受累，我國以廣東及廣西發(fā)生率最高。在某些誘因如藥物、感染、食物、圍產(chǎn)等因素的作用下G6PD缺乏患者可以引起急慢性溶血［2］。G6PD存在于人體紅細胞內(nèi)，是磷酸戊糖途徑的限速酶，它能催化產(chǎn)生還原型輔酶Ⅱ（NADPH），NADPH是谷胱甘肽還原酶的輔酶，其能夠保護紅細胞免受氧化物質(zhì)的威脅。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是機體清除自由基的首要物質(zhì)，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用，與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展密不可分，血清SOD活性高低可反應機體清除自由基的能力［3］。它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫（H2O2），產(chǎn)生的H2O2再由過氧化氫酶、過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化氫酶分解成水和對機體無害的物質(zhì)。理論上G6PD缺乏導致紅細胞不能夠有效地清除由SOD產(chǎn)生的過氧化氫，從而導致紅細胞膜和血紅蛋白的損傷，因此，G6PD缺乏與SOD之間存在密切的關(guān)系，但目前國內(nèi)有關(guān)G6PD缺乏癥患者SOD的表達及其與膽紅素的相關(guān)性少有研究。因此，探討G6PD缺乏癥患者SOD的表達是否存在差異以及其與膽紅素是否存在相關(guān)性，對G6PD缺乏癥疾病狀態(tài)有一定的臨床指導意義。

本研究通過對2016年至2021年2月暨南大學附屬第一醫(yī)院G6PD缺乏癥病例進行回顧性研究與描述性分析，旨在分析G6PD缺乏癥患者中SOD活性以及其與膽紅素的相關(guān)性，并初步探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

所有樣本均來自暨南大學附屬第一醫(yī)院，收集2016年至2021年2月共3 086例，其中包含946例G6PD重度缺乏患者（男499例，女447例，中位年齡50歲），1 272例G6PD中度缺乏患者（男198例，女1 074例，中位年齡33歲）和868例正常對照組標本。正常對照組來自于體檢人群，排除慢性疾病、肝功能異常及地中海貧血；病例組排除了肝功能異常、地中海貧血。本研究經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會審核通過，倫理審批號：KY-2023-018。

1.2 分組標準

采用定量法測定紅細胞G-6-PD／6-PGD比值，操作按試劑盒說明書，＜1.0即確診為G-6-PD缺乏癥。G-6-PD／6-PGD比值為≤0.6為重度缺乏，0.6～1.0為中度缺乏，≥1.0為正常。

1.3 主要試劑與儀器

SOD、膽紅素及G-6-PD的檢測，采用日本產(chǎn)日立7600型全自動生化分析儀。釩酸氧化法膽紅素測定試劑盒為日本和光純藥工業(yè)株式會社生產(chǎn)；G-6-PD定量測定試劑盒購自廣州科方生物技術(shù)有限公司；SOD測定試劑購自福建福緣生物科技有限公司。

1.4 檢測方法

1.4.1 G6PD活性檢測方法

根據(jù)試劑盒說明采用速率法在全自動生化分析儀上分別測定紅細胞中G-6-PD與6-PGD的活性，然后計算G-6-PD／6-PGD比值。其中，成人G-6-PD／6-PGD參考區(qū)間：1.00～2.30（0.95～1.05為可疑）；新生兒（靜脈血，臍帶血）G-6-PD／6-PGD參考區(qū)間：1.10～2.50（1.05～1.15為可疑）。

1.4.2 SOD活性檢測方法

在全自動生化分析儀上采用鄰苯三酚自氧化法進行檢測。在堿性工作液中，鄰苯三酚會產(chǎn)生自氧化顯色反應，其強度與釋放出超氧陰離子自由基的濃度正相關(guān)。當SOD活性降低時，催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應被抑制，超氧陰離子自由基濃度就升高，即樣本中鄰苯三酚自氧化的顯色反應強度與SOD的活性呈正相關(guān)關(guān)系。SOD酶活性參考區(qū)間為129～216 U／mL。

1.4.3 TBIL檢測方法

本檢測在全自動生化分析上進行。在pH值在3附近時，使用樣品中的表面活性劑與釩酸互相作用，則樣品中的總膽紅素會被氧化為膽綠素。這時膽紅素特有的黃色就會減少，因此只要測定釩酸作用前后的吸光度差，即可得出總膽紅素的濃度，參考區(qū)間為0.2～1.2μmol／L。

1.5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。將分組后的數(shù)據(jù)，兩兩配對用SPSS 20.0做正態(tài)分布分析和方差齊性分析，計量資料采用（ˉx±SE）表示，兩組間顯著性比較采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用Graphpad Prism 7.0繪得相應散點分布圖。

2 結(jié)果

2.1 G6PD缺乏組與正常組血清TBIL、DBIL、IBIL濃度及SOD活性比較

G6PD缺乏癥組年齡、TBIL、DBIL及IBIL濃度明顯高于正常對照組，而G6PD缺乏癥病例組SOD活性低于正常對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，表1）。

表1 G6PD缺乏癥組與正常組各項指標水平的比較Table 1 Com parison of index levels between the case group and the normal group

2.2 不同程度G6PD缺乏組TBIL、DBIL、IBIL濃度及SOD活性變化

根據(jù)G6PD比值將病人分為正常對照組、G6PD中度缺乏組及G6PD重度缺乏組3組，3組各項指標結(jié)果顯示：（1）重度缺乏組血清TBIL、DBIL及IBIL濃度顯著高于正常對照組，而SOD活性低于正常對照組（P＜0.01）；（2）中度缺乏組血清TBIL及IBIL濃度顯著高于正常對照組（P＜0.05），而SOD活性低于正常對照組（P＜0.01）。中度缺乏組與正常對照組血清DBIL濃度差異無統(tǒng)計學意義（表2，圖1）。

圖1 不同程度G6PD缺乏癥患者血清TBIL、DBIL和IBIL濃度及SOD活性比較Figure 1 Comparison of serum TBIL，DBIL and IBIL levels and SOD activity in patients with different degrees of G6PD deficiency

表2 正常組、G6PD中度缺乏組及重度缺乏組各指標的水平比較Tab le 2 Com parison of indicators am ong three observation groups

2.3 不同程度G6PD缺乏組各項指標與年齡的關(guān)系

本研究按納入研究人群的年齡分布，將研究人員分為30歲以下、30～44歲、45歲及以上3類，分析各個年齡段中不同程度的G6PD缺乏癥患者的血清TBIL、DBIL、IBIL濃度及SOD活性水平的變化情況。結(jié)果見表3：（1）年齡段在30歲以下，中度缺乏組血清TBIL及IBIL濃度高于正常對照組，而血清DBIL濃度及SOD酶活性水平低于正常對照組；在重度缺乏癥患者中，血清TBIL、DBIL、IBIL濃度及SOD活性水平均明顯高于中度缺乏組及正常對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（2）年齡段在30～44歲之間，中度缺乏組血清TBIL、DBIL、IBIL濃度及SOD酶活性均低于正常對照組，重度缺乏組血清TBIL、DBIL和IBIL濃度明顯高于正常對照組和中度缺乏組，而SOD活性低于正常對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中度缺乏組與重度缺乏組SOD活性差異無統(tǒng)計學意義。（3）大于45歲及以上人員，重度缺乏組及中度缺乏組SOD活性水平低于正常對照組（P＜0.05），且中度缺乏組與重度缺乏組血清TBIL、IBIL濃度及SOD活性水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其余各項指標水平比較差異均無統(tǒng)計學意義。

表3 各組在不同年齡段各項指標水平比較Table 3 Comparison of indicators among the three observation groups in different age groups

2.4 G6PD缺乏組SOD的相關(guān)性研究

SOD的活性與年齡、血清TBIL、DBIL及IBIL濃度之間的相關(guān)性如圖2、表4。30歲以下G6PD中度缺乏組、重度缺乏組血清SOD酶活性與血清TBIL、DBIL及IBIL濃度呈顯著正相關(guān)（P＜0.01）且與血清TBIL相關(guān)度最強，而與年齡呈負相關(guān)（P＜0.01），而正常人血清SOD酶活性與年齡呈正相關(guān)（P＝0.1440，圖2），皮爾森相關(guān)系數(shù)r見表4。

圖2 G6PD缺乏病人SOD與年齡、血清TBIL、DBIL及IBIL的相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis of SOD with age，serum TBIL，DBIL and IBIL in G6PD deficiency patients

表4 G6PD缺乏病人SOD與年齡、血清TBIL、DBIL及IBIL濃度的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of SOD w ith age，serum TBIL，DBIL and IBIL in G6PD deficiency patients

3 討論

G6PD缺乏癥是一種因X染色體連鎖不完全而導致溶血的疾病，是常見的顯性遺傳代謝性疾病。據(jù)文獻報道，全球G6PD缺乏癥的患者可達4億，多分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國的海南、廣西、廣東、云南、貴州、福建等南方各省份發(fā)病率較高［4］。本研究發(fā)現(xiàn)G6PD缺乏癥患者血清TBIL、DBIL及IBIL濃度與正常對照者相比明顯升高，且不同程度的G6PD缺乏患者血清TBIL、DBIL、IBIL濃度不同，G6PD重度缺乏組血清膽紅素水平顯著高于G6PD中度缺乏組及正常對照組，進一步說明了G6PD活性缺乏是高膽紅素血癥的風險因素，且G6PD活性缺乏程度越高，其膽紅素值越高［9］。

G6PD缺乏引起血清膽紅素升高與超氧離子損傷紅細胞有關(guān)。機體在代謝過程中會產(chǎn)生超氧離子（O2-），可使磷脂分子中的不飽和脂肪酸氧化生成過氧化脂質(zhì)。過多的過氧化脂質(zhì)會損傷生物膜，并與蛋白質(zhì)結(jié)合形成脂褐素促進組織老化。SOD是人體防御內(nèi)外環(huán)境中這些超氧離子損傷的重要酶，能夠催化超氧離子生成氧氣和H2O2，然而后者比超氧陰離子具有更強的細胞毒性，需要機體迅速的清除。在紅細胞中存在一種谷胱甘肽過氧化物酶，它催化H2O2或者過氧化物與還原型谷胱甘肽反應，生成的氧化型谷胱甘肽，再由NADPH供氫使得氧化型谷胱甘肽重新變成還原型谷胱甘肽。NADPH是通過磷酸戊糖代謝唯一途徑產(chǎn)生的，而G6PD是磷酸戊糖代謝途徑的關(guān)鍵酶。G6PD缺乏會導致NADPH合成減少，進而影響還原型谷胱甘肽的生成，血紅蛋白和細胞膜易于發(fā)生氧化性損傷［5-8］。目前已知血清SOD活性與高血壓、冠心病和糖尿病等多種疾病相關(guān)，在這些疾病中血清SOD活性都較正常人減低，并且與疾病的嚴重程度相關(guān)［10-11］。而關(guān)于G6PD缺乏癥患者血清SOD 表達情況報道較少。Bilmen等［12］報道了30例G6PD缺乏癥患者和30例正常人的SOD表達情況，發(fā)現(xiàn)它們之間SOD活性沒有差異，而劉東成等［6］報道了30例G6PD缺陷新生兒高膽紅素血癥患兒的SOD活性情況，在患兒中SOD活性比正常新生兒顯著減低。在本研究中發(fā)現(xiàn)G6PD缺乏者血清SOD活性要比正常組顯著減低，而且SOD活性與血清膽紅素呈明顯相關(guān)，與劉東成等［6］報道一致。G6PD缺乏癥患者SOD活性降低原因可能是G6PD缺乏者合成還原型谷胱甘肽減少，導致紅細胞對H2O2的清除能力較正常人減低，過多的H2O2通過負反饋機制導致SOD活性減低，從而減少H2O2的生成，同時過多H2O2會引起紅細胞膜的損傷，從而導致G6PD缺乏者的血清膽紅素增高。

血清SOD活性還與年齡有關(guān)，血清SOD活性隨著年齡增加而遞減［13］。本研究也觀察了不同年齡段SOD酶活性及血清膽紅素濃度與G6PD缺乏癥之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)G6PD 缺乏者血清TBIL、DBIL、IBIL和SOD濃度隨年齡的增加而降低，這與部分研究結(jié)果相似［13-14］，進一步提示機體合成血紅蛋白等膽紅素前體物質(zhì)及抗氧化能力隨年齡增加呈下降趨勢。另外，發(fā)現(xiàn)30歲以下中度G6PD缺乏者血清SOD活性低于正常對照組，而重度G6PD缺乏者卻顯著高于正常對照組。不同程度G6PD缺乏引起SOD活性不一致的原因可能是G6PD重度缺乏者體內(nèi)自由基產(chǎn)生處于激增狀態(tài)，在自由基的誘導及機體代償應激下，細胞或機體會誘導性地增強抗氧化能力，出現(xiàn)SOD水平增高現(xiàn)象；而G6PD中度缺乏患者血清SOD酶活性低于正常組，推測是在正常的生理條件下，殘留的G6PD與其他抗氧化酶的結(jié)合也可能足以應付天然存在的氧化劑并防止明顯的氧化和溶血。但是，在氧化應激條件下，殘留的G6PD和其他互補的抗氧化劑機制可能不足以中和大量的氧自由基［15］。在Vanella等［16］的研究中提到，與無G6PD缺乏癥的白內(nèi)障患者相比，G6PD缺損的5名白內(nèi)障男性顯示其晶體中G6PD活性檢測不到，谷胱甘肽水平低；但發(fā)現(xiàn)晶狀體中總SOD的活性顯著增加。

對30歲以下的G6PD缺乏患者相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)G6PD缺乏患者SOD活性與TBIL、DBIL和IBIL濃度呈正相關(guān)，與年齡呈負相關(guān)。表明SOD活性水平確隨年齡增加而下降，且G6PD缺乏能引起膽紅素升高和SOD活性升高。

綜上所述，G6PD缺乏癥患者TBIL、DBIL和IBIL濃度顯著高于正常人群，SOD活性則明顯降低，但是在年齡30歲以下，重度G6PD缺乏者SOD卻明顯高于正常對照組，與TBIL、DBIL和IBIL濃度有正相關(guān)關(guān)系，與年齡呈負相關(guān)。因此，G6PD作為體內(nèi)戊糖磷酸途徑中重要的酶，其缺乏時可導致高膽紅素血癥的發(fā)生，且對機體氧化應激過程有一定的影響。

作者貢獻聲明

夏秋菊、練佳儀：數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，論文撰寫；胡向國、李莉：提供檢測樣本及檢測結(jié)果；查顯豐：研究指導，論文修改。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。