羅滿生，賴旭旺，鄧曉玲，曾艷梅

（1.南昌大學(xué) 附屬贛州醫(yī)院 檢驗科，江西 贛州 341000；2.南昌大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 第二臨床醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006；3.南昌大學(xué) 附屬贛州醫(yī)院 中心實驗室，江西 贛州 341000）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一類因某些基因突變而導(dǎo)致的造血系統(tǒng)惡性增殖性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康，其中FMS樣酪氨酸激酶3（FMS like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3）中間串聯(lián)重復(fù)（internal tandem duplication，ITD）突變在臨床初診AML患者中約占30%［1］?，F(xiàn)已知FLT3-ITD突變與AML耐藥、復(fù)發(fā)、完全緩解率低等不良預(yù)后密切相關(guān)［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)FLT3-ITD可通過激活下游系列信號通路如磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）／蛋白激酶B（Akt）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT5）等，誘發(fā)造血祖細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，從而具有致白血病作用［4］。目前已有第一、二代酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）用于FLT3-ITD突變AML的治療，但效果不理想［5-6］。因此，AML發(fā)病機制及其治療仍然是當(dāng)前AML研究領(lǐng)域的熱點。

ITD突變導(dǎo)致FLT3非配體依賴性二聚化，并持續(xù)激活，而酪氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)通常受控于一些蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphotase，PTPase）［7］。因此，在FLT3-ITD激活方面，PTPase可能具有一定調(diào)節(jié)功能。然而在諸多研究中，有關(guān)PTPase的確切作用觀點尚不一致［8-9］，而具有C1結(jié)構(gòu)域且與TENsin同源的磷酸酶（C1 domaincontaining phosphatase and TENsin homologue，C1-TEN）就是其中代表。

C1-TEN，亦稱作人張力蛋白2（tensin 2，TNS2），是tensin家族成員之一［10-11］。由于其C末端所特有的蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphotase，PTP）和Src同源結(jié)構(gòu)域（Src homology domain，SH2），C1-TEN因而可能具有酪氨酸殘基磷酸化活性［12-13］。雖然C1-TEN在一些腫瘤細(xì)胞中具有抗腫瘤功能［9］，但有學(xué)者則提示該磷酸酶可能具有致瘤作用［8］，而有關(guān)C1-TEN在AML細(xì)胞的表達及其功能目前尚無報道。本研究將首先揭示AML細(xì)胞中C1-TEN的表達情況，然后探討AML細(xì)胞中FLT3-ITD與C1-TEN的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

AML細(xì)胞系HL-60細(xì)胞、MV4-11細(xì)胞均由中科院（上海）干細(xì)胞庫饋贈。實驗細(xì)胞正常培養(yǎng)于含10%熱滅活胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)基，鋪板、藥物干預(yù)時懸浮于2% FBSRPMI-1640。

1.1.2 試劑與儀器

米朵妥林（Midostaurin，貨號：HY-10230）、索拉菲尼（Sorafenib，貨號：HY-10201）購自上海MCE公司；FBS、RPMI-1640購自Gibco公司；MTT試劑（貨號：298-93-1），購于上海生工生物科技有限公司；15，16-二氫丹參酮I（15，16-dihydrotanshinone I，DHTS，貨號：SLBX2742）、二甲基亞砜購自默克Sigma公司；組織細(xì)胞裂解液（貨號：R0010）購自索萊寶公司；0.45μm PVDF膜購自Millipore公司；蛋白酶／磷酸酶抑制劑混合物（貨號：4906845001）購自Roche公司；Tris／甘氨酸／SDS電泳緩沖液（貨號：PS105S）、轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號：PS109S）、TBST（貨號：PS103S）、快速封閉液（貨號：PS108P）、三色預(yù)染Mraker（貨號：WJ103）、ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑均購自上海雅酶生物科技有限公司；兔源FLT3抗體（貨號：3462S）、pFLT3抗體（貨號：3464S）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抗體（貨號：9661）、多聚ADP核糖體聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抗體（貨號：9532）、鼠源C1-TEN抗體（貨號：11990S）等均購自CST公司；兔源β-actin抗體（貨號：TA-09）、羊抗鼠IgG 抗體（貨號：ZB-2305）、羊抗兔IgG抗體（貨號：ZB-2301）等購自北京中杉金橋公司；兔源α-Tubulin抗體（貨號：11224-1-AP）購自Proteintech公司；CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒（貨號：N31213）購自北京Transgen公司；Annexin V-APC／7-AAD（E-CK-A218）購自武漢Elabscience生物科技有限公司。

KHB-ST-360酶標(biāo)儀購自上?？迫A生物工程股份有限公司，F(xiàn)ACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，F(xiàn)USION FX凝膠成像儀購自法國Vilber公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT檢測AML細(xì)胞活性

基于前期預(yù)實驗結(jié)果，本研究分別以不同濃度的索拉菲尼（0、10、20、40、80 nmol／L）、米朵妥林（0、250、1 000、4 000 nmol／L）干預(yù)MV4-11細(xì)胞；同樣，以不同濃度的索拉菲尼（0、400、800、1 600、3 200 nmol／L）、米朵妥林（0、250、1 000、4 000 nmol／L）干預(yù)HL-60細(xì)胞。利用MTT法檢測HL-60細(xì)胞、MV4-11細(xì)胞的活性，以分析兩者對TKI的敏感性。具體步驟參照文獻［14］。細(xì)胞經(jīng)PBS兩次洗滌后懸浮于2%FBS-RPMI-1640，于96孔板中每孔加入90μL細(xì)胞混懸液（含3.0×104個細(xì)胞），然后加入10μL RPMI-1640或不同濃度的米朵妥林或索拉菲尼，37℃、5% CO2孵育20 h。每孔加入20μL MTT試劑（5 mg／mL），4 h后加150μL二甲基亞砜，混勻后酶標(biāo)儀讀板，測定各孔吸光度D（490 nm），實驗設(shè)三復(fù)孔，取均值。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達

基于MTT實驗結(jié)果，確定HL-60細(xì)胞、MV4-11細(xì)胞的米朵妥林干預(yù)濃度和索拉菲尼干預(yù)濃度，同時以RPMI-1640、10%FBSRPMI-1640為實驗對照，于37℃、5%CO2條件下共育5 h。（1.5～2.0）×106個細(xì)胞經(jīng)1 200 r／min離心6min，細(xì)胞沉淀用預(yù)冷PBS洗滌2次，加100μL RIPA細(xì)胞裂解液，其中含蛋白酶／磷酸酶抑制劑混合物（1 mmol／L），充分吹打、渦旋混勻，100℃金屬浴10 min，12 000 r／m離心7 min，4℃保存?zhèn)溆谩?0% SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，快速封閉液室溫封閉1 h，經(jīng)TBST（含0.1%吐溫-20，下同）洗滌1次后分別4℃孵育一抗過夜，包括兔源FLT3抗體（V抗體∶V抗體稀釋液＝1∶1 000）、pFLT3抗體（V抗體∶V抗體稀釋液＝1∶1 000）、caspase-3抗體（V抗體∶V抗體稀釋液＝1∶1 000）、PARP抗體（V抗體∶V抗體稀釋液＝1∶1 000），鼠源C1-TEN抗體（V抗體∶V抗體稀釋液＝1∶1 000）、α-Tubulin抗體（V抗體∶V抗體稀釋液＝1∶50 000）、β-actin抗體（V抗體∶V抗體稀釋液＝1∶1 000）。TBST洗滌5次，5 min／次，再室溫孵育HRP標(biāo)記的二抗1 h，包括羊抗鼠IgG抗體（V抗體∶V抗體稀釋液＝1∶10 000）；羊抗兔IgG抗體（V抗體∶V抗體稀釋液＝1∶10 000）。TBST洗滌5次，5 min／次，ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑顯影，F(xiàn)USION FX凝膠成像儀曝光成像并分析灰度值。

1.2.3 CCK-8實驗檢測MV4-11細(xì)胞活性

MV4-11細(xì)胞鋪96孔板（每孔90μL細(xì)胞混懸液，含3.0×104個細(xì)胞），分別用不同濃度的DHTS（0、2.5、5、10μmol／L）于37℃、5% CO2條件下干預(yù)15 h，加入10μL CCK-8試劑后孵育3 h，利用酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度D（450 nm），每組設(shè)3復(fù)孔，取均值。

另外，基于預(yù)實驗結(jié)果，本研究還將通過檢測細(xì)胞活性探討DHTS（3.0μmol／L）與米朵妥林（50 nmol／L）或索拉菲尼（10 nmol／L）對MV4-11細(xì)胞的協(xié)同抑制作用，方法同上。

1.2.4 FACS、Western blot檢測MV4-11細(xì)胞凋亡

MV4-11細(xì)胞鋪24孔板（每孔900μL細(xì)胞混懸液，含3.5×105個細(xì)胞），分為陰性對照組（Con）和實驗組，分別加100μL RPMI-1640或DHTS（100μmol／L），37℃、5%CO2孵育5 h，依照試劑盒說明進行Annexin V-APC／7-AAD標(biāo)記，上機行流式細(xì)胞檢測（FACS）。caspase-3、PARP活化情況通過WB檢測相關(guān)蛋白表達進行分析，方法同1.2.2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)運用GraphPad Prism 7.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。計量資料多組間比較運用單因素方差分析（one-way ANOVA）分析，Bonferroni post-hoc法檢驗方差齊性；兩組間比較采用非配對t檢驗分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TKI對MV4-11細(xì)胞活性的影響

與之前報道［15］一致，本研究中兩種TKI（索拉菲尼、米朵妥林）均可有效抑制FLT3-ITD突變AML細(xì)胞系MV4-11細(xì)胞的增殖，而HL-60細(xì)胞則對其耐藥。如圖1A-B，兩種TKI均能顯著殺傷MV4-11細(xì)胞。與Con組（0 nmol／L）比較，TKI處理組細(xì)胞活性顯著降低，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F索拉菲尼＝99.34，P＜0.05；F米朵妥林＝68.37，P＜0.05），其中索拉菲尼處理組尤為明顯。而TKI對HL-60細(xì)胞則無明顯抑制、殺傷作用，與Con組（0 nmol／L）比較，TKI處理組細(xì)胞活性降低不明顯，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F索拉菲尼＝1.609，P＝0.2465；F米朵妥林＝2.959，P＝0.0977）（圖1C-D）。

圖1 TKI處理對AML細(xì)胞系活性的影響Figure 1 The effects of TKI treatment on the activity of AML cell lines

2.2 TKI對MV4-11細(xì)胞FLT3活化和C1-TEN表達的影響

采用WB法進一步分析FLT3磷酸化水平，以評價TKI對MV4-11細(xì)胞FLT3活化的影響，探討TKI抑制殺傷MV4-11細(xì)胞的可能機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TKI作用5 h后MV4-11細(xì)胞FLT3活化顯著下降（圖2A-B），組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝430.6，P＜0.05）；而HL-60細(xì)胞非但FLT3活化不明顯，而且FLT3表達（0 FBS RPMI-1640組、10%FBSRPMI-1640組）明顯低于同樣條件下的MV4-11細(xì)胞（圖2A）。

有研究報道，AML細(xì)胞FLT3-ITD突變可導(dǎo)致某些磷酸酶表達升高。本研究中，盡管未能分析FLT3-ITD的蛋白激酶活性，但通過WB法分析了AML細(xì)胞在TKI（50 nmol／L米朵妥林或10 nmol／L索拉菲尼）作用條件下C1-TEN的表達情況。如圖2A，0 FBS RPMI-1640組、10% FBS RPMI-1640組MV4-11細(xì)胞C1-TEN表達水平明顯高于HL-60細(xì)胞。而且，與0 FBS RPMI-1640組、10%FBS RPMI-1640組比較，TKI組C1-TEN表達顯著降低（圖2A、C），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝163.3，P＜0.05），同等條件下HL-60細(xì)胞則變化不明顯（圖2A）。

圖2 TKI作用條件下AML細(xì)胞系FLT3磷酸化及C1-TEN表達情況Figure 2 FLT3 phosphorylation and C1-TEN expression in AML cell lines treated with TKI

2.3 C1-TEN抑制對MV4-11活性的影響及與TK I的協(xié)同作用

此外，本研究還探討了C1-TEN抑制對FLT3-ITD突變AML細(xì)胞的影響。CCK-8結(jié)果顯示，經(jīng)C1-TEN抑制劑DHTS作用15 h后MV4-11活性顯著降低（F＝1613，P＜0.05），效應(yīng)呈明顯劑量依賴性（圖3A）。而且，DHTS能協(xié)同TKI抑制MV4-11細(xì)胞增殖（F米朵妥林＝390，P＜0.05；F索拉菲尼＝211.7，P＜0.05），但是DHTS單獨作用時其抑制作用遜色于TKI單獨處理組（P＜0.05，圖3B-C）。然而，上述現(xiàn)象在HL-60細(xì)胞中并未觀察到（數(shù)據(jù)未列出）。

圖3 DHTS單獨處理或聯(lián)合TKI對MV4-11細(xì)胞活性的影響Figure 3 The effects of DHTS treating alone or combined with TKIon the activity of MV4-11 cells

2.4 DHST對MV4-11細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

為探討DHTS對MV4-11細(xì)胞的作用機制，本研究還分析了各組細(xì)胞的凋亡情況。如圖4A，DHTS組caspase-3活性片段的灰度值（0.614±0.027）顯著高于陰性對照（0.027±0.003），經(jīng)單因素方差分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與caspase-3活化情況類似，DHTS處理組另一凋亡標(biāo)記分子PARP活化也顯著高于陰性對照（圖4B）。FACS結(jié)果顯示，DHTS組細(xì)胞凋亡率（45.58±0.308）較Con組（20.53±1.8）顯著升高，經(jīng)非配對t檢驗分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 DHTS處理誘導(dǎo)MV4-11細(xì)胞凋亡的情況Figure 4 The apoptosis of MV4-11 cells treated by DHTS

3 討論

AML細(xì)胞FLT3-ITD突變可引發(fā)其自身非配體依賴性、持續(xù)性活化，并與AML患者的一些不良預(yù)后密切相關(guān)［16］。一般諸如FLT3在內(nèi)的一些受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）的活化受PTPase調(diào)節(jié)，因為后者具有去酪氨酸殘基磷酸化功能［7，17］。作為一種報道較少的蛋白磷酸酶，雖然研究顯示C1-TEN在一些實體瘤中表達下降［8］，但是它在AML細(xì)胞的表達目前尚不清楚。本研究顯示AML細(xì)胞表達C1-TEN，尤其FLT3-ITD突變的AML細(xì)胞。本研究還揭示FLT3-ITD被抑制后，AML細(xì)胞C1-TEN分子表達下調(diào)，但機制有待進一步研究；而拮抗C1-TEN卻能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，殺傷FLT3-ITD突變的AML細(xì)胞。

前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，在5份臨床AML骨髓標(biāo)本中，僅有1份FLT3-ITD突變AML細(xì)胞高表達C1-TEN，而其他4份FLT3-WT AML細(xì)胞C1-TEN表達不明顯（數(shù)據(jù)未列出），是否提示C1-TEN在FLT3-ITD突變AML細(xì)胞高表達而在FLT3-WT AML細(xì)胞低表達？考慮到短時間內(nèi)臨床樣本有限，本研究利用兩種代表性AML細(xì)胞系用于研究AML細(xì)胞C1-TEN表達，并進一步探究FLT3-ITD與C1-TEN的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果表明，兩種TKI（米朵妥林、索拉菲尼）都具有明顯抑制FLT3-ITD突變AML細(xì)胞的作用，而對FLT3-WT AML細(xì)胞的抑制效應(yīng)一般，這一結(jié)果與以往報道一致［18］。同樣，TKI處理組MV4-11細(xì)胞FLT3活化相比HL-60細(xì)胞也被顯著抑制，再次證明FLT3-ITD活化對AML細(xì)胞成瘤性的促進作用。本研究還提示，與MV4-11細(xì)胞相比，HL-60細(xì)胞的FLT3表達明顯較低，這一差異是否與這兩種AML細(xì)胞系的來源背景不同有關(guān)目前還不清楚。研究已明確，F(xiàn)LT3-ITD能正向調(diào)節(jié)AML細(xì)胞一些下游信號通路如PI3K／Akt、janus激酶（janus kinase，JAK2）、ERK、STAT5等［19］，促進AML細(xì)胞增殖、抗凋亡、抗分化等病理過程，其中STAT5尤為重要。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，STAT5是AML細(xì)胞FLT3下游信號通路中的重要靶分子，而FLT3-ITD／STAT5抗凋亡信號通路又是該類細(xì)胞的重要特征［20］。因此，調(diào)控FLT3-ITD活化是目前有關(guān)FLT3-ITD突變AML治療研究的熱點。

鑒于PTPase對FLT3在內(nèi)的一些RTK的重要調(diào)節(jié)作用，本研究還進一步探討了FLT3-ITD被抑制條件下AML細(xì)胞中與PTEN同源的蛋白磷酸酶C1-TEN的表達情況。PTEN通常被稱為腫瘤抑制因子，是一種蛋白質(zhì)脂質(zhì)雙特異性磷酸酶，包括AML在內(nèi)的很多腫瘤細(xì)胞中該因子表達下降［21］。本研究發(fā)現(xiàn)FLT3-ITD突變AML細(xì)胞系MV4-11非但相對高表達C1-TEN，而且在抑制FLT3-ITD條件下該磷酸酶分子的表達也被下調(diào)，而經(jīng)C1-TEN抑制劑DHTS作用后FLT3變化不明顯。考慮到這兩種TKI以及DHTS作用的相對靶向性，因此推測FLT3-ITD可能通過某種機制調(diào)控下游C1-TEN分子。這一假設(shè)或許可從其他相關(guān)研究結(jié)果初見端倪，Arora等［14］報道在MV4-11細(xì)胞FLT3-ITD能上調(diào)另一種雙特異性磷酸酶PTPase的表達但無磷酸酶活性。有研究證實可能機制是FLT3-ITD通過促進活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生而抑制其磷酸酶活性［22］，但這一機制能否解釋本研究的相關(guān)發(fā)現(xiàn)有待證實。

為進一步證實在促進AML細(xì)胞生長、存活等方面與FLT3-ITD的同向性，本研究還分析了MV4-11細(xì)胞分別在C1-TEN抑制劑DHTS、TKI及兩者聯(lián)合作用條件下的存活、增殖情況。結(jié)果表明，DHTS能有效抑制MV4-11細(xì)胞，盡管其效果不如TKI。并且在對MV4-11細(xì)胞的抑制方面，DHTS與TKI具有協(xié)同性。抑制機制方面，DHTS可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制MV4-11細(xì)胞，提示DHTS可能逆轉(zhuǎn)FLT3-ITD突變AML細(xì)胞特征性的“FLT3-ITD／STAT5”抗凋亡通路，具體機制還需深入探討。據(jù)此推斷，蛋白磷酸酶C1-TEN不但表達于AML細(xì)胞，而且還可能是FLT3-ITD的重要下游分子，與其他相關(guān)分子共同參與AML細(xì)胞致瘤作用。

綜上，本研究首次報道了AML細(xì)胞蛋白磷酸酶C1-TEN的表達情況，并揭示該分子可能作為FLT3-ITD下游重要分子共同參與AML細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化等病理生理過程，因而有望成為AML治療的新靶點。但是，由于本研究為體外細(xì)胞實驗，相關(guān)結(jié)論尚需在接下來的臨床AML細(xì)胞樣本及動物實驗研究中進一步證實，并對相關(guān)機制進行深入探討。

作者貢獻聲明

羅滿生：提出研究思路和框架，修改論文；羅滿生、賴旭旺：設(shè)計實驗、統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，撰寫論文；賴旭旺、鄧曉玲：實驗操作、數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。