萬(wàn)仁強(qiáng)，劉敏婷，翁澤平，裴娜娜*

（1.廣東省第二人民醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510317；2.暨南大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 病理科，廣東廣州 510630）

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）是內(nèi)源性的血壓、體液平衡和細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控系統(tǒng)，其母體化合物血管緊張素原主要于肝臟產(chǎn)生，由腎素（Renin）降解形成一種10肽—血管緊張素Ⅰ（AngⅠ），AngⅠ被蛋白水解酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）和肽鏈內(nèi)切酶催化生成8肽的血管緊張素2（AngⅡ）和7肽的血管緊張素1-7［Ang-（1-7）］。AngⅡ也可通過(guò)ACE2作用生成Ang-（1-7）［1］。RAS成分通過(guò)不同的受體發(fā)揮不同的作用。AngⅡ通過(guò)其1型受體（AT1R）可介導(dǎo)血管收縮、細(xì)胞增殖、心肌肥大、纖維化、炎癥等反應(yīng)，而AngⅡ通過(guò)其2型受體（AT2R）則會(huì)產(chǎn)生相反的作用。

ACE2是ACE的同系物，ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸可拮抗經(jīng)典的AngⅡ／AT1R途徑以發(fā)揮抗增殖、血管擴(kuò)張和抗轉(zhuǎn)移等效應(yīng)。研究顯示，ACE2在多種腫瘤中表達(dá)降低［2-3］，與乳腺癌的轉(zhuǎn)移能力和腫瘤的分期呈負(fù)相關(guān)［3］，并且在肝細(xì)胞癌［3］和透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中［4］，ACE2高表達(dá)較低表達(dá)的患者有更好的預(yù)后。ACE2過(guò)表達(dá)或Ang-（1-7）治療可抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［5］和前列腺癌的轉(zhuǎn)移［6］。我們前期研究表明，Ang-（1-7）過(guò)表達(dá)能抑制腫瘤生長(zhǎng)，包括肺癌［7］、鼻咽癌［8］和肝癌［9］。但是ACE2在鼻咽癌中的表達(dá)以及對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響，尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，在本研究旨在初步探討ACE2在鼻咽癌中的表達(dá)及對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2019至2021年存檔，組織較大的鼻咽癌標(biāo)本88例，組織學(xué)類(lèi)型為非角化性癌，其中分化型6例，未分化型82例，男性66例，女性22例，年齡25～80歲，平均年齡50.3歲。對(duì)照組為確診為鼻咽黏膜慢性炎的組織175例。

1.1.2 細(xì)胞株

鼻咽癌細(xì)胞及永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69由南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院生物治療研究所李紅衛(wèi)教授惠贈(zèng)。

1.1.3 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶溶液、胎牛血清和青霉素-鏈霉素（10 000 U／mL）均購(gòu)自Gibco公司；總RNA提取試劑盒Qiagen RNeasy Mini kit購(gòu)自 Qiagen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit和SYBR Premix Ex TaqTM均購(gòu)自Takara公司；二乙酰胺三氮脒（diminazene aceturate，DIZE）購(gòu)自MedChemExpress公司；Ang-（1-7）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Bachem公司；ACE2抗體和人AngⅡELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Abcam公司；表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）一抗購(gòu)自基因科技公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma公司。

1.1.4 儀器設(shè)備

超凈臺(tái)購(gòu)自蘇凈集團(tuán)·蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、高速離心機(jī)均購(gòu)自ThermoFisher公司；分光光度計(jì)購(gòu)自Biorad公司；Prism? 7500熒光定量PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems（ABI）公司。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組化檢測(cè)鼻咽癌組織中ACE2及EGFR的表達(dá)

免疫組化染色采用EnVision兩步法，每例標(biāo)本3μm，切片經(jīng)脫蠟，水化；以EDTA 9.0修復(fù)液97℃修復(fù)40min；FLEX Peroxidase Block（DAKO）孵育10 min；蒸餾水沖洗；PBS浸泡15 min；滴加一抗，室溫孵育60 min，PBS浸泡20 min；二抗孵育，室溫25min，PBS浸泡20min；DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染。陽(yáng)性對(duì)照采用腎組織切片。ACE2蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞膜，呈棕色，ACE2結(jié)果判讀由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師閱片。判斷標(biāo)準(zhǔn)參照以下方法［9-10］，綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例積分，對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，不著色為0分，淺棕色為1分，棕色為2分，深棕色為3分；再對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞的比例進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞≤1%為0分，2%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分。以上兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)相乘后分4級(jí)，0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為中等陽(yáng)性（++），9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。EGFR表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，對(duì)著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估，不著色為陰性（-），淺棕色判為弱陽(yáng)性表達(dá)（+），棕色判為中等陽(yáng)性（++），深棕色判為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1、CNE-2、SUNE-1、5-8F、6-10B、HONE-1置于RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 熒光定量RT-PCR檢測(cè)ACE2的表達(dá)

依RNA試劑盒的操作步驟提取腫瘤細(xì)胞及DIZE處理的CNE-1及5-8F細(xì)胞的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80℃保存。熒光定量RT-PCR檢測(cè)ACE2的相對(duì)表達(dá)。qPCR 的反應(yīng)條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。ACE2上游引物5’-gtgcacaaaggtgacaatgg-3’，下游引物5’-ggctgcagaaagtgacatga-3’；EGFR上游引物5’-gcaaattccgagacgaagcc-3’，下游引物 5’-ctgtatttgccctcggggtt-3’；18 s 上游引物 5’-gtaacccgttgaaccccatt-3’，下游引物 5’-ccatccaatcggtagtagcg-3’。采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-1和5-8F細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后鋪至96孔板內(nèi)，1×103個(gè)細(xì)胞／孔，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加入含DIZE（100μmol／L）或PBS的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3和4 d，后吸棄培養(yǎng)基，在每孔中加入含MTT 20μL（5mg／mL）的培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150μL DMSO溶液，570 nm處讀取OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

CNE-1和5-8F細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶作用后，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞接種于24孔板上，每孔200個(gè)細(xì)胞，每天更換含DIZE（100μmol／L）或PBS的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2周。棄生長(zhǎng)液，PBS漂洗2次，甲醇5 mL固定15 min，Giemsa染液染色20min。在100倍鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞集落（集落標(biāo)準(zhǔn)：含有50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞團(tuán)為一個(gè)集落）。

1.2.6 ELISA檢測(cè)AngⅡ與Ang-（1-7）含量

CNE-1和5-8F鋪至24孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，加入DIZE（100μmol／L），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液儲(chǔ)存在-20℃。用ELISA測(cè)定血漿中AngⅡ與Ang-（1-7）的水平，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。于450 nm波長(zhǎng)上讀取OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算AngⅡ與Ang-（1-7）的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism V5.0分析，采取t檢驗(yàn)，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACE2在鼻咽癌組織中的表達(dá)

通過(guò)免疫組化法檢測(cè)ACE2在鼻咽癌組織及黏膜慢性炎組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，在66例鼻咽癌標(biāo)本中，均未觀察到ACE2的表達(dá)，而在黏膜慢性炎標(biāo)本中，ACE2表達(dá)的陽(yáng)性率為69.7%（圖1）。

2.2 ACE2在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)

采用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)6種鼻咽癌細(xì)胞中ACE2的表達(dá)，結(jié)果顯示，永生化鼻咽上皮細(xì)胞相比鼻咽癌細(xì)胞中ACE2的表達(dá)顯著降低，在高分化的CNE-1細(xì)胞中的表達(dá)最高，明顯高于低分化的鼻咽癌細(xì)胞（圖2）。

圖2 ACE2在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)Figure 2 Expression of ACE2 in NPC cells

2.3 EGFR在鼻咽癌組織中的表達(dá)

免疫組化檢測(cè)EGFR在88例鼻咽癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，EGFR在鼻咽癌組織中高表達(dá)，陽(yáng)性率為97.7%（圖3）。

圖3 EGFR在鼻咽癌組織中的表達(dá)Figure 3 Expression of EGFR in nasopharyngeal carcinoma

2.4 DIZE對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

DIZE作用于鼻咽癌細(xì)胞后，可抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-1和5-8F的生長(zhǎng)（圖4）。

圖4 ACE2激動(dòng)劑DIZE對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Figure 4 Effect of ACE2 agonist DIZE on the growth of NPC cells

MTT結(jié)果顯示，DIZE處理CNE-1細(xì)胞24、48 h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值為（0.17±0.04）、（0.36±0.04），對(duì)照組細(xì)胞的OD值為（0.19±0.03）、（0.32±0.02），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），DIZE作用72、96 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值為（0.64±0.04）、（1.12±0.05），對(duì)照組細(xì)胞的OD值為（0.86±0.04）、（1.42±0.06），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3A。

DIZE處理5-8F細(xì)胞24、48、72 h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值為（0.27±0.04）、（0.50±0.03）、（0.86±0.06），對(duì)照組細(xì)胞的OD值為（0.26±0.02）、（0.48±0.03）、（0.83±0.04），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），DIZE作用96 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值為（1.20±0.04），對(duì)照組細(xì)胞的OD值為（1.48±0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3B。

2.5 DIZE對(duì)鼻咽癌細(xì)胞克隆形成的影響

與PBS處理后的對(duì)照組相比，加DIZE培養(yǎng)2周后的鼻咽癌細(xì)胞5-8F及CNE-1增殖細(xì)胞明顯減少，增殖受到抑制作用；進(jìn)一步在100倍顯微鏡下計(jì)細(xì)胞集落數(shù)，DIZE作用后的鼻咽癌細(xì)胞株克隆數(shù)明顯減少，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.01，可見(jiàn)，DIZE可抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-1和5-8F的克隆形成（圖5）。

圖5 ACE2激動(dòng)劑DIZE對(duì)鼻咽癌細(xì)胞克隆形成的影響Figure 5 Effect of ACE2 agonist DIZE on the colony formation of NPC cells

2.6 DIZE處理鼻咽癌細(xì)胞后對(duì)ACE2、AngⅡ、Ang-（1-7）及EGFR表達(dá)的影響

DIZE處理鼻咽癌細(xì)胞24 h后，用RT-qPCR檢測(cè)ACE2與EGFR的表達(dá)，采用ELISA法檢測(cè)AngⅡ及Ang-（1-7）的表達(dá)，結(jié)果顯示，DIZE可升高鼻咽癌細(xì)胞中ACE2及Ang-（1-7）的表達(dá)（圖6A、D），降低AngⅡ及EGFR的表達(dá)（圖6B、C）。

圖6 DIZE對(duì)鼻咽癌細(xì)胞ACE2、AngⅡ、Ang-（1-7）及EGFR表達(dá)的影響Figure 6 Effects of DIZE on the expression of ACE2，AngⅡ，Ang-（1-7）and EGFR in NPC cells

3 討論

鼻咽癌是我國(guó)南方以及東南亞地區(qū)常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，其中我國(guó)華南及港澳地區(qū)發(fā)病率最高（萬(wàn)分之二以上），因此，鼻咽癌也被稱(chēng)為“廣東瘤”［10］。由于其發(fā)病部位隱匿，分化程度差，惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，致使60%以上的患者在早期無(wú)明顯臨床癥狀而發(fā)展到進(jìn)展期且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［11］。近年來(lái)，隨著在診斷和治療方面取得的突破性進(jìn)展，鼻咽癌的總體生存率顯著提高［12］，然而其轉(zhuǎn)移率仍高居不下，成為鼻咽癌治療失敗最主要的原因，因此，探索其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)更多的治療靶點(diǎn)及多靶點(diǎn)聯(lián)合治療，對(duì)于治療及預(yù)防鼻咽癌轉(zhuǎn)移、延長(zhǎng)患者的生存期和提高生存質(zhì)量具有非常重要的意義。

RAS不僅存在于所有已研究的組織、器官中，而且廣泛存在于幾乎所有的腫瘤細(xì)胞［13］，并且某些成分的表達(dá)還與腫瘤的預(yù)后相關(guān)［14］。ACE2在多種腫瘤中表達(dá)降低［2-3］，且與腫瘤的分級(jí)和預(yù)后相關(guān)。在本研究發(fā)現(xiàn)，ACE2在鼻咽癌中不表達(dá)，而在約69.7%鼻黏膜慢性炎標(biāo)本中表達(dá)；在鼻咽癌細(xì)胞中ACE2的表達(dá)降低，并且在高分化的CNE-1細(xì)胞中的表達(dá)高于低分化的鼻咽癌細(xì)胞，本研究結(jié)果提示ACE2的表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞的分化相關(guān)，或許可作為一個(gè)可能的鼻咽癌標(biāo)記物。

研究顯示ACE2可抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，包括乳腺癌［2］、肝癌［3］、前列腺癌［6］和肺癌［5，15-16］。另有研究顯示，ACE2-Ang-（1-7）-Mas以依賴(lài)于MasR誘導(dǎo)的AKT激活的方式促進(jìn)腎細(xì)胞癌的遷移和侵襲［17］?？梢?jiàn)ACE2-Ang-（1-7）-Mas在不同腫瘤中介導(dǎo)不同甚至相反的生物學(xué)作用。DIZE是ACE2的激動(dòng)劑，可升高ACE2的活性［18-19］，本研究中用DIZE處理鼻咽癌細(xì)胞，結(jié)果顯示在DIZE作用后，鼻咽癌細(xì)胞中ACE2的表達(dá)升高。由于ACE2主要將AngⅡ切割成Ang-（1-7）［1］，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，另外也檢測(cè)了DIZE作用后，AngⅡ與Ang-（1-7）的表達(dá)，結(jié)果顯示Ang-（1-7）的表達(dá)升高，但AngⅡ的表達(dá)降低，同時(shí)抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖，這與Ang-（1-7）在鼻咽癌中的作用相似［9］，說(shuō)明ACE2通過(guò)Ang-（1-7）發(fā)揮生物學(xué)作用。

EGFR是一種很有前景的癌癥治療新靶點(diǎn)，在大多數(shù)腫瘤中高度表達(dá)，并與更具侵襲性的表型、治療抵抗和不良預(yù)后相關(guān)［20］。有研究指出EGFR在85%以上的鼻咽癌患者中表達(dá)。本研究檢測(cè)了88例鼻咽癌組織中EGFR的表達(dá)，顯示EGFR陽(yáng)性率為99.97%，這與他人的研究結(jié)果相一致。本研究中ACE2的激動(dòng)劑DIZE作用鼻咽癌細(xì)胞后可降低鼻咽癌細(xì)胞EGFR的表達(dá)，提示ACE2的作用可能與抑制EGFR的表達(dá)有關(guān)，但是具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

雖然靶向治療鼻咽癌有很好的應(yīng)用前景，但其效率不高、生存期延長(zhǎng)時(shí)間短等問(wèn)題仍有待進(jìn)一步解決。因此，探尋新的靶點(diǎn)、多靶點(diǎn)聯(lián)合治療有效避免上述缺陷是目前分子靶向治療的主要研究方向。有研究顯示，ACEI聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)化療或TKIs對(duì)一線治療后肺癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期或總生存期均有積極的效果［21］。最近一項(xiàng)研究顯示，在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌，聯(lián)合應(yīng)用Sunitinib（VEGFR-TKI）和Ang-（1-7），與單用Sunitinib相比，聯(lián)合治療可產(chǎn)生更加明顯的腫瘤生長(zhǎng)抑制效應(yīng)［4］，說(shuō)明Ang-（1-7）增強(qiáng)了舒尼替尼的治療作用?？笶GFR靶向治療，如西妥昔單抗（CTX）和尼莫單抗（NTZ），已成為鼻咽癌的潛在治療方法。今后我們將在本研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索ACE2與抗EGFR聯(lián)合作用對(duì)鼻咽癌的治療效果，本研究為ACE2與抗EGFR的雙靶點(diǎn)協(xié)同治療鼻咽癌奠定基礎(chǔ)。

在本研究中用IHC法未觀察到ACE2在鼻咽癌標(biāo)本中的表達(dá)，未能進(jìn)一步分析其與臨床病理特征的關(guān)系，在接下來(lái)的研究中，將在進(jìn)一步擴(kuò)大研究病例數(shù)的前提下，同時(shí)使用熒光定量RTPCR及Western blot進(jìn)一步檢測(cè)ACE2在鼻咽癌標(biāo)本中的表達(dá)以及鼻咽癌患者血清中ACE2的表達(dá)情況，以探討ACE2與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，這具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，ACE2在鼻咽癌中表達(dá)降低，DIZE作為ACE2的激動(dòng)劑，可升高ACE2的表達(dá)，并且抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖及EGFR的表達(dá)，本研究為尋找鼻咽癌治療靶點(diǎn)提供新思路和方向，但其具體的分子機(jī)制以及ACE2與抗EGFR雙靶點(diǎn)對(duì)鼻咽癌的作用仍需進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)聲明

萬(wàn)仁強(qiáng)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究執(zhí)行，數(shù)據(jù)分析，撰寫(xiě)論文；劉敏婷：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究執(zhí)行，數(shù)據(jù)分析；翁澤平：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)分析；裴娜娜：項(xiàng)目的構(gòu)思，修改論文。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。