桑嘉玘,辜青青,徐玉娟,劉昊澄,彭健,溫靖*,余元善,田文妮,陳樹(shù)鵬

1(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,江西 南昌,330045) 2(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)部 功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州,510610) 3(廣東佳寶集團(tuán)有限公司,廣東 潮州,515638)

柚子,屬于蕓香科柑橘屬,因其酸甜、涼潤(rùn)的口感且集藥食為一體的特點(diǎn)深受人們喜愛(ài)[1]。隨著柚子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,產(chǎn)生了大量的加工副產(chǎn)品,其中大部分被當(dāng)作廢棄物處理。研究發(fā)現(xiàn),柚子中含有幾十種對(duì)人體有益的生理活性成分,如果能將廢棄物作為功能原料被綜合利用,既可以減少資源浪費(fèi),又可以保護(hù)環(huán)境[2]。

近年來(lái),由于膳食纖維具有降低血脂和血糖水平,減少心血管和結(jié)直腸癌疾病的功效[3],受到了研究人員、食品行業(yè)和消費(fèi)者的廣泛關(guān)注。膳食纖維根據(jù)溶解性不同,劃分為不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber,IDF)和水溶性膳食纖維(soluble dietary fiber,SDF)[4]。與谷物相比,來(lái)自柚子皮的膳食纖維的主要優(yōu)勢(shì)在于其含有更多的酚類物質(zhì)[5]。這對(duì)于開(kāi)發(fā)含纖維產(chǎn)品非常重要,因?yàn)楣δ苄陨攀忱w維更有利于人體吸收。與SDF相比,IDF不僅占據(jù)天然纖維的2/3,還在預(yù)防和緩解便秘、糖尿病、結(jié)腸癌、肥胖、高血壓等有方面發(fā)揮了重要的作用[6-7]。

研究表明,不同的提取方法會(huì)影響IDF的結(jié)構(gòu)、功能和理化活性。蔣緯等[8]認(rèn)為微波法所提取的野木瓜IDF和SDF能夠較好保持其還原能力和抗氧化能力；王曦璠等[9]認(rèn)為,堿提取法的香菇膳食纖維平均產(chǎn)率高于酶解法；孟怡璠等[10]認(rèn)為,堿提取法的南瓜膳食纖維的陽(yáng)離子交換能力和水合性質(zhì)更強(qiáng)。物理方法在一定程度上不能完全提取出膳食纖維,堿法在提取的過(guò)程中會(huì)增加環(huán)境的二次污染[11]。因此,亟待開(kāi)發(fā)高效、綠色的柚皮海綿層IDF提取工藝。

因此,本文采用超聲法、復(fù)酶法、酶堿法和超聲輔助復(fù)酶法提取柚皮海綿層中的IDF,比較IDF的表觀結(jié)構(gòu)、理化特性和體外抗氧化能力的差異,以期為柚子皮的精深加工及功能性食品添加劑的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將新鮮柚子去皮,留下海綿層,切成均勻的(3±0.5)cm小塊,經(jīng)鼓風(fēng)干燥機(jī)60 ℃完全干燥后,粉碎過(guò)80目篩,存于4 ℃冰箱備用。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉(均為分析純)、α-淀粉酶(4 000 U/g)、糖化酶(100 000 U/g)、中性蛋白酶(100 000 U/g),上海源葉生物科技有限公司；ABTS法和鐵離子還原能力(ferric reducing ability of plasma,FRAP)法總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒,南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

Mx5百萬(wàn)分之一電子天平,Mettler Toledo；UV-1800型紫外分光光度計(jì),日本島津公司；PB-10型pH計(jì),Sartorius公司；Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀,瑞士TECAN公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 膳食纖維提取方法

1.3.1.1 復(fù)合酶法工藝流程

柚皮海綿層粉末2 g→加入20倍體積水→調(diào)pH 6.0→1.5%混合酶[m(α-淀粉酶)∶m(糖化酶)=1∶1]70 ℃酶解60 min→滅酶10 min→冷卻→調(diào)pH 7.0→1%中性蛋白酶50 ℃酶解60 min→滅酶→5 000 r/min離心10 min→過(guò)濾→濾渣→干燥→IDF。

1.3.1.2 酶堿法工藝流程

柚皮海綿層粉末2 g→加入20倍體積水→調(diào)pH 6.0→0.4%混合酶[m(α-淀粉酶)∶m(糖化酶)=1∶1]→60 ℃酶解50 min→滅酶10 min→冷卻至60 ℃→5% NaoH溶液(NaOH濃度1 mol/L)→60 ℃堿解30 min→5 000 r/min離心10 min→過(guò)濾→濾渣→干燥→IDF。

1.3.1.3 超聲法工藝流程

柚皮海綿層粉末2 g→加入20倍體積水→調(diào)pH 6.0→超聲30 min、40 ℃、400 W→5 000 r/min離心10 min→過(guò)濾→濾渣→干燥→IDF。

1.3.1.4 超聲輔助復(fù)酶法工藝流程

柚皮海綿層粉末2 g→加入20倍體積水→調(diào)pH 6.0→超聲30 min、40 ℃、400 W→1.5%混合酶[m(α-淀粉酶)∶m(糖化酶)=1∶1]70 ℃酶解60 min→滅酶10 min→冷卻→調(diào)pH 7.0→1%中性蛋白酶50 ℃酶解60 min→滅酶→5 000 r/min離心10 min→過(guò)濾→濾渣→干燥→IDF。

1.3.2 柚皮海綿層IDF物化性質(zhì)的測(cè)定

1.3.2.1 持水力

參考LI等[12]的研究方法略作修改。將0.5 g樣品與25 mL蒸餾水混合1 h后,于4 000 r/min下離心10 min,除去上清液,稱重沉淀物。持水力計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：m1,沉淀物減去樣品的質(zhì)量,g；m,樣品的質(zhì)量,g。

1.3.2.2 持油力

根據(jù)KUREK等[13]的研究方法略作修改。將0.5 g樣品和25 mL葵花籽油混合1 h后,于5 000 r/min下離心10 min。棄去上清液,稱重殘余物。持油性計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：m1,樣品濕重,g；m2,樣品干重,g。

1.3.2.3 膨脹性

參考ROBERTSON等[14]的研究方法略作修改。將0.3 g樣品轉(zhuǎn)入量筒中,記下樣品初始體積。將5 mL的蒸餾水倒入量筒內(nèi),混合24 h,讀取樣品最終的體積。膨脹性計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：V1,樣品最終的體積,mL；V2,樣品初始的體積,mL；m,樣品的質(zhì)量,g。

1.3.2.4 陽(yáng)離子交換能力的測(cè)定

參照BENITEZ等[15]的研究方法略作修改。0.5 g樣品和10 mL 0.1 mol/L的HCl溶液混合,放置24 h后過(guò)濾,將殘?jiān)c100 mL 15%NaCl溶液混合,用0.1 mol/L的NaOH溶液進(jìn)行滴定,測(cè)定樣品消耗NaOH溶液體積,同時(shí)用蒸餾水代替HCl溶液,測(cè)定空白樣品消耗NaOH溶液體積。陽(yáng)離子交換能力計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

式中：V1,測(cè)定樣品消耗NaOH溶液體積,mL；V0,測(cè)定空白樣品消耗NaOH溶液體積,mL。

1.3.3 掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)分析

將微量樣品固定于導(dǎo)電膠帶觀察臺(tái)上,用離子濺射的方法進(jìn)行噴金處理,以5.00 kV的加速電壓于SEM觀察臺(tái)上收集并觀察圖像,放大倍數(shù)為800倍。

1.3.4 生物活性化合物溶出的測(cè)定

1.3.4.1 總酚、總黃酮的提取

根據(jù)莊遠(yuǎn)紅等[16]的研究方法略作修改。取0.5 g樣品,加入10 mL 60%乙醇于室溫下超聲10 min,在4 000 r/min下離心10 min,收集上清液,再加10 mL 60%乙醇重復(fù)提取2次,合并上清液并定容至25 mL,于-20 ℃貯存。

1.3.4.2 總黃酮、總酚含量的測(cè)定

膳食纖維的黃酮和總酚含量用分光光度儀測(cè)定,具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[17-18]。

1.3.5 體外抗氧化性分析

1.3.5.1 ABTS陽(yáng)離子自由基的清除作用

采用總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(ABTS法)測(cè)定樣品的自由基清除能力。在室溫條件下取待測(cè)樣品溶液10 μL加入20 μL的酶溶液和170 μL ABTS工作液中。室溫孵育6 min后于405 nm處測(cè)定吸光度,以蒸餾水作空白對(duì)照。

1.3.5.2 FRAP的測(cè)定

采用總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(FRAP法)測(cè)定樣品的FRAP。在室溫條件下取待測(cè)樣品溶液5 μL加入180 μL FRAP工作液中。37 ℃孵育5 min后于593 nm處測(cè)定吸光度,以蒸餾水作空白對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行,計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,數(shù)據(jù)以平均值±SD的形式表示；采用Origin 20.0,SPSS 16.0等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖以及ANOVA差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)分析

持水性與膨脹性可以反映膳食纖維水合性質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo),其與IDF的表面積、質(zhì)量分?jǐn)?shù)和分子間的結(jié)構(gòu)有關(guān)[10]。4種不同方法提取的柚皮海綿層IDF的水合性質(zhì)如圖1所示。在持水性方面,樣品的持水性值為9.85～12.70 g/g,以酶堿法(12.70 g/g)最佳,超聲輔助復(fù)酶法(10.64 g/g)和超聲法(10.52 g/g)次之,復(fù)酶法(9.85 g/g)最差；膨脹性上,4種提取方法的柚皮海綿層IDF具有顯著性差異(P<0.05)。超聲輔助復(fù)酶法>酶堿法>復(fù)酶法>超聲法。酶堿法和超聲輔助復(fù)酶法提取IDF水合性質(zhì)較好,可能與堿和超聲對(duì)纖維結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)?？傊?高持水性和膨脹性的膳食纖維更有利于食物的膨脹,增加人體的飽腹感。

膳食纖維分子表面的活性基團(tuán)不僅可以吸附人體的油脂,還可以在烘焙中防止脂肪流失。持油性又與水膠體的表面性質(zhì)和分子間空隙的結(jié)合度有關(guān)。如圖1所示,超聲輔助復(fù)酶法提取IDF持油性含量最高(8.92 g/g),復(fù)酶法(5.78 g/g)和酶堿法(4.97 g/g)次之,超聲法(3.24 g/g)最低。

超聲輔助復(fù)酶法的IDF持油性和膨脹性都優(yōu)于其他3個(gè)樣品,這可能是該方法下IDF的結(jié)構(gòu)更松散。酶堿法提取的IDF持水性高,但是由于強(qiáng)堿在某種程度上破壞了IDF的結(jié)構(gòu),使其持油性較差。

圖1 不同提取方法的IDF的持水性、持油性、膨脹性Fig.1 The water-holding,oil-holding and expansion of IDF in different extracted methods注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 陽(yáng)離子交換能力

膳食纖維分子結(jié)構(gòu)中存在氨基、羥基等活性基團(tuán)。這些基團(tuán)與Zn2+、Cu2+等離子進(jìn)行交換時(shí),可以改變?nèi)梭w消化道的pH和滲透壓,降低Na+/K+比值,產(chǎn)生降血壓作用[19]。由圖2可知,4種提取方法下的陽(yáng)離子交換能力由大到小依次為：酶堿法>超聲輔助復(fù)酶法>復(fù)酶法>超聲法,其中酶堿法與復(fù)酶法、超聲法存在顯著性差異(P<0.05)。酶堿法和超聲輔助復(fù)酶法提取的IDF的陽(yáng)離子交換能力高,其原因可能與蛋白質(zhì)、淀粉的清除率有關(guān)。

2.3 SEM分析

本研究采用SEM研究不同提取方法下的IDF的顯微結(jié)構(gòu)。由圖3可知,4種IDF顆粒表面有皺褶,呈疏松的海綿狀且網(wǎng)眼較大,沒(méi)有球形顆粒結(jié)構(gòu),說(shuō)明4種IDF產(chǎn)品中不含淀粉等雜質(zhì)[20]。酶堿法表面孔隙比復(fù)酶法多,這可能是因?yàn)闅溲趸c在提取過(guò)程中使IDF的微觀結(jié)構(gòu)和粒徑大小發(fā)生改變,導(dǎo)致聚合度下降；復(fù)酶法的結(jié)構(gòu)比超聲法更平坦,可能是超聲波的空化作用使膳食纖維的結(jié)構(gòu)完整性被破壞,呈現(xiàn)帶有裂縫的片狀結(jié)構(gòu)[3]。超聲輔助復(fù)酶法的孔隙比酶堿法更致密、更規(guī)則,可能是超聲波與酶結(jié)合,使IDF的結(jié)構(gòu)更為疏松,提高IDF理化特性,使其發(fā)揮更好的生理功能。復(fù)酶法、酶堿法和超聲法均影響了IDF的微觀結(jié)構(gòu)?？臻g結(jié)構(gòu)較松散的IDF與其持水性和膨脹性等理化指標(biāo)有相關(guān)關(guān)系。因此,SEM結(jié)果表明,提取方法可能會(huì)改變柚皮海綿層膳食纖維樣品的功能特性。

a-超聲法；b-復(fù)酶法；c-酶堿法；d-超聲輔助復(fù)酶法圖3 不同提取方法下IDF的SEM圖Fig.3 The SEM of IDF under different extraction methods

2.4 柚皮海綿層IDF生物活性物質(zhì)溶出量

有研究發(fā)現(xiàn),膳食纖維的抗氧化性、降血糖、減肥、減少慢性胃腸道紊亂等功效與其中含有的酚類和黃酮類密切相關(guān)。黃酮類和酚類化合物分別是通過(guò)自由基和細(xì)胞的氧化能力來(lái)實(shí)現(xiàn)抗氧化作用[21-22]。如圖4所示,4種方法提取的柚皮海綿層IDF黃酮含量為4.04～6.62 mg/g,其中復(fù)酶法、酶堿法和超聲輔助復(fù)酶法提取的黃酮含量沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),而超聲法下IDF黃酮含量(4.04 mg/g)最少。4種方法提取柚皮海綿層的IDF總酚含量為2.34～2.80 mg/g,酶堿法和超聲輔助復(fù)酶法提取IDF的總酚含量高于復(fù)酶法和超聲法提取IDF的總酚含量。由以上結(jié)果可知,總酚和總黃酮含量因提取方法的不同而有所差異,酶堿法和超聲輔助復(fù)酶法提取的生物活性物質(zhì)高可能與其有效去除原料中淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)有關(guān)[23]。

圖4 不同提取方法的IDF的總酚和總黃酮含量測(cè)定Fig.4 The total phenols and total flavones of IDF in different extraction methods

2.5 不同提取方法對(duì)IDF抗氧化活性的影響

本文通過(guò)測(cè)定FRAP和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力,分析了4種提取方式下IDF體外抗氧化活性的差異。由圖5可知,4種IDF的FRAP為20.52～29.84 mmol/L,其中酶堿法(29.84 mmo/L)最高,超聲輔助復(fù)酶法(24.38 mmo/L)和復(fù)酶法(22.57 mmol/L)次之,超聲法(20.52 mmol/L)最低；超聲輔助復(fù)酶法的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力(42.98 mmol/L)顯著高于其他3種提取方法(P<0.05)。2種抗氧化方法所測(cè)出4種IDF抗氧化順序存在一定的差異,可能與其自由基和反應(yīng)離子有關(guān)。

雖然2種抗氧化能力所測(cè)結(jié)果存在差異,但不影響柚皮海綿層IDF抗氧化能力的總體趨勢(shì),即酶堿法和超聲輔助復(fù)酶法>復(fù)酶法和超聲法。酶堿法和超聲輔助復(fù)酶法有較強(qiáng)的抗氧化能力,這可能是因?yàn)檫@2種提取方法下的IDF結(jié)構(gòu)疏松,空隙較大,更有利于提供電子和氫原子,這與之前的研究具有一致性[24]。

圖5 不同提取方法下IDF的FRAP和ABTS 陽(yáng)離子自由基清除能力Fig.5 The FRAP and ABTS cationic free radical scavenging ability of IDF in different extraction methods

2.6 IDF抗氧化活性與總酚、黃酮之間的相關(guān)性

酚類物質(zhì)是膳食纖維中主要活性成分,是膳食纖維品質(zhì)及生物學(xué)活性評(píng)價(jià)的主要指標(biāo),柚皮抗氧化活性與總酚含量密切相關(guān)[25]。結(jié)果如表1所示,2種抗氧化能力均與總酚含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；與黃酮呈正相關(guān),相關(guān)性不顯著(P>0.05)；且不同提取方法下IDF的抗氧化活性與總酚的含量趨勢(shì)相同,即抗氧化能力隨著總酚含量的多少而變化。

表1 抗氧化能力與多酚、黃酮類物質(zhì)相關(guān)性Table 1 Correlation of antioxidant capacity with polyphenols and flavonoids

3 結(jié)論

本文對(duì)比研究了超聲法、復(fù)酶法、酶堿法和超聲輔助復(fù)酶法4種提取方法對(duì)柚皮海綿層IDF的理化性質(zhì)、功能和結(jié)構(gòu)的差異。在理化性質(zhì)方面,超聲波輔助復(fù)酶法提取IDF的持油性(8.92 g/g)和膨脹性(16.89 mL/g)含量最高,而酶堿法提取IDF以持水性(12.70 g/g)含量和陽(yáng)離子交換能力最高。結(jié)構(gòu)上,超聲輔助復(fù)酶法提取的IDF表面的空隙更小、更緊密。提取方式不僅影響IDF的結(jié)構(gòu)表征,還會(huì)影響其功能特性。酶堿法提取的柚皮海綿層中IDF的總酚含量(2.80 g/g)和FRAP(39.18 mmol/L)最高；超聲輔助復(fù)酶法以黃酮含量(6.62 mg/g)和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力(42.98 mmo/L)最高。因此,超聲輔助復(fù)酶法可作為一種綠色的提取膳食纖維的工藝,對(duì)功能性膳食纖維的開(kāi)發(fā)和柚皮產(chǎn)業(yè)的附加值利用提供科學(xué)依據(jù)。