李凱龍,徐文泱,向俊,孫桂芳,王芳斌,陳同強*

1(湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,湖南 長沙,410111) 2(湖南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,湖南 長沙,410125)

由多糖、蛋白質(zhì)和脂類等制作的可食用涂層可以作為微生物、氧氣和水汽的屏障以此來延長食品的保質(zhì)期。殼聚糖(chitosan,Ch)由甲殼素(chitin)經(jīng)脫乙酰作用生成,具有無毒、可降解、成膜性和生物相容性等生物功能[1-2],同時具有廣譜抑菌性[3]、抗氧化[4]和保鮮作用[5],在食品工業(yè)中有著廣泛的應用[6]。鮮魚的生物成分變化,如脂質(zhì)的氧化、自身酶活性變化、微生物的代謝活動等導致其極易發(fā)生腐爛,使得魚類比其他水產(chǎn)品的保質(zhì)期短?；跉ぞ厶堑谋姸鄡?yōu)點,通過殼聚糖涂膜解決水產(chǎn)品易腐敗的問題已成為當前水產(chǎn)品保鮮研究的熱點,很多研究表明,可通過使用殼聚糖涂膜來抑制魚和魚產(chǎn)品的脂質(zhì)氧化、微生物生長、風味變差、色澤劣化等問題是可行的[7-8]。

植物精油由于抗菌活性高,抗菌范圍廣而成為眾多科研者青睞的研究對象,植物精油具有良好的防腐抗菌作用,廣泛應用于食品、藥品等領域[9-10]。一些研究表明,將植物精油添加到殼聚糖中可大大增強殼聚糖的抗菌和抗氧化作用[11-12]。肉桂精油(CIN),富含肉桂醛、石竹烯、芳樟醇等萜類化合物。肉桂精油的主要活性成分是肉桂醛,具有與肉桂相關的獨特氣味和風味。肉桂醛在世界范圍內(nèi)被用作食品添加劑和調(diào)味劑[13],美國食品和藥物管理局將其列為“公認為安全的添加劑”[14]。研究表明,肉桂精油和肉桂醛都具有良好的抗氧化和抗菌潛力[15-16]。在殼聚糖薄膜或涂層中加入精油不僅可以增強殼聚糖膜的抗菌和抗氧化性能,而且還可以降低薄膜產(chǎn)品的水蒸氣通透性和脂質(zhì)氧化,開發(fā)具有高抗氧化、抗菌活性的天然防腐劑涂層或膜,延長鮮食魚和魚產(chǎn)品的保質(zhì)期是可行的。本研究旨在探討殼聚糖和含肉桂精油的殼聚糖涂層在草魚片保鮮中的應用潛力。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

鮮活健康草魚,長沙步步高超市；殼聚糖(脫乙酰度>95%),上海藍季生物試劑有限公司；食品級肉桂精油、乙酸、甘油、三氯酸、高氯酸、氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氧化鎂、碳酸鉀、甲醛、甲苯、氨水、甲基紅、溴甲酚綠、硫代巴比妥酸、三氯乙酸,國藥集團化學試劑有限公司；平板計數(shù)瓊脂(生化試劑),青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器和設備

UV-1000 紫外可見分光光度計,上海天美科學儀器有限公司；4K15高速冷凍離心機,德國 Sigma 公司；EL-20 pH 計,上海 Mettler Toledo 儀器有限公司；KDN-103F蒸餾器,上海纖檢儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司；T10 高速分散機、C-MAG HS4磁力攪拌器,德國 IKA 公司；生化培養(yǎng)箱、恒溫恒濕箱,上海一恒儀器有限公司；BCD-610 WkM冰箱,美的集團股份有限公司。

1.3 樣品制備

鮮活健康草魚,每尾質(zhì)量約550～600 g。鮮活草魚買回后,立即去鱗,剖殺,去內(nèi)臟,無菌水清洗,分段切片(寬5 cm×長12 cm),稱質(zhì)量,裝袋(刀具與案板均用75%乙醇溶液消毒,整個過程在無菌環(huán)境下進行),將所有樣品組置于(4±1) ℃條件貯藏。

1.4 魚片涂層液的制備及魚片的處理

根據(jù)前期預實驗結果,3%殼聚糖溶液較為黏稠,不再適合進行魚片涂膜保鮮。因此,后續(xù)的實驗選擇的殼聚糖涂膜溶液為 1%、2%和2.5%。將一定量的殼聚糖溶解于1%(體積分數(shù))乙酸溶液中,添加質(zhì)量濃度5 g/L的甘油作為塑化劑,混合溶液在室溫環(huán)境下磁力攪拌4 h至殼聚糖完全溶解。溶液在4 ℃、10 000×g條件下離心15 min,去除不溶性顆粒,加入一定量的乳化劑吐溫-80有助于肉桂精油在殼聚糖溶液中的分散,混合攪拌30 min,接著將不同體積分數(shù)(0.5%、1%、1.5%、2%)肉桂精油加入殼聚糖膜液中,混合攪拌30 min形成殼聚糖-肉桂溶液,只含殼聚糖的涂層溶液作為對照用于魚片涂膜處理。通過前期預實驗發(fā)現(xiàn),肉桂精油體積分數(shù)<1.0%時涂層不能均勻分布在樣品表面上,而肉桂精油體積分數(shù)>1.5%時,涂層劑的黏度非常高。而通過涂層液的穩(wěn)定性試驗表明殼聚糖含量為2%時,涂層液的穩(wěn)定性最好。因此,最終形成的處理涂層溶液配方為：2%殼聚糖、1%乙酸、0.75%甘油、0.2%吐溫-80和1.5%肉桂精油,涂層溶液的使用性和穩(wěn)定性最佳,所以選取這一配方的殼聚糖-肉桂精油涂膜溶液作為后續(xù)冷藏草魚片抗菌保鮮研究的涂層保鮮劑。

將魚片樣本隨機分配為3個樣品組,包括1個空白對照組(未涂覆)和2個處理組：殼聚糖(Ch)處理和殼聚糖+肉桂精油(Ch+CIN)處理。每個樣品組重復3次。對于每個涂覆的樣品組,大約20條草魚片在500 mL涂層溶液中浸漬30 s,取出晾置2 min,然后再重復1次。在涂層溶液中浸漬30 s,然后在10 ℃下取出魚片并置于滅菌后的生物密閉罩中的金屬網(wǎng)上放置5 h,以便形成食用涂層,然后儲存在4 ℃條件下用于后續(xù)質(zhì)量評估。分別在冷藏0、4、8、12和16 d進行化學、微生物和感官分析,以確定冷藏魚片的總體質(zhì)量。

1.5 基本成分分析

冷藏魚片的水分含量、灰分含量、粗蛋白含量和總脂肪含量分別參照GB 5009.3—2016中的直接干燥法、GB 5009.4—2016、GB 5009.5—2016和GB 5009.6—2016中的第一法進行測定。

1.6 微生物分析

根據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》,稱取切碎后的約10 g樣品置于無菌均質(zhì)袋中,加入90 mL 0.85%的無菌生理鹽水,均質(zhì)拍打4 min,吸取1 mL均質(zhì)液進行連續(xù)10倍梯度稀釋,選取3個合適的濃度對微生物進行傾注平板法培養(yǎng)計數(shù),所有操作在無菌條件下進行。菌落總數(shù)和嗜冷菌總數(shù)采用平板計數(shù)瓊脂,分別在30和10 ℃條件下培養(yǎng)3和7 d,微生物計數(shù)單位為lg CFU/g,每個處理3次重復。

1.7 化學分析

1.7.1 揮發(fā)性鹽基總氮值(total volatile basic nitrogen,TVB-N) 含量的測定

參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》第一法進行測定,單位以 mg/100 g樣品表示。

1.7.2 TBARS的測定

用比色法測定硫代巴比妥酸的值,取約2 g攪碎樣品放入離心管中,加入 20 mL 100 mg/mL三氯乙酸溶液均質(zhì) 2 min,過濾后取上清液 5.0 mL 加入到裝有 5.0 mL 0.02 mol/L 硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid,TBA)溶液的具塞玻璃試管中。混合溶液在沸水浴中加熱 20 min,冷卻至室溫后在 532 nm 處測吸光值,并做空白試驗。吸光值帶入1,1,3,3-四乙氧基丙烷標準曲線進行計算,單位以 mg MDA/kg樣品表示。

1.7.3 過氧化物值(peroxide value,POV)測定

不同貯藏時間魚片中的過氧化值采用GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》中的第一法滴定法進行測定。

1.7.4 汁液流失率測定

通過比較魚片在貯藏一段時間后質(zhì)量變化得到汁液流失率,如公式(1)所示：

(1)

式中：P,汁液流失率,%；m0,魚片初始質(zhì)量,g；mt,魚片貯藏后質(zhì)量,g。

1.7.5 魚片感官評價

魚片感官評價參照黃曉春等[17]的方法并做適當修改,感官評價人員對魚片色澤、氣味、可接受性方面進行考察并給出喜好性打分。感官評價分為好、較好、一般、較差和差,對應的分值分別是10、8、6、4、2分,其中剛宰殺的新鮮草魚肉感官評分為10分。所有樣品以3位數(shù)字進行標號,再送樣評價,感官評價人員由13人組成,均為研究室資深理化檢驗員。

1.7.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗分析均重復3次,數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示。用SPSS19.0和Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析和作圖,采用Duncan’s多重比較進行顯著性分析(P<0.05表示具有顯著性差異)。

2 結果與分析

2.1 基本成分分析

鮮切草魚片中水分、蛋白質(zhì)、脂肪和灰分[g/(100 g魚肌)]的平均值分別為(69.70±2.13)、(23.21±0.36)、(2.20±0.37)和(4.12±0.3),這與其他研究中魚片的一些基本成分有一些差異,特別是脂類含量,這類化學成分的變化主要與魚類營養(yǎng)、捕撈季節(jié)(產(chǎn)卵周期)、性別變化、魚類大小、生活區(qū)以及其他環(huán)境條件密切相關。

草魚肉中水分主要分為2種：分布于結締組織間游離狀態(tài)的自由水和與蛋白質(zhì)、糖類中羥基、氨基、羧基等結合的結合水。魚肉在貯藏過程中會因微生物、酶等作用發(fā)生生理變化,導致水分的流失,因此通過持水率變化情況可反映魚肉在貯藏中水分與蛋白結合的狀態(tài)以及魚肉品質(zhì)的變化。通過對生魚片持水率的研究發(fā)現(xiàn),涂層處理可以減少魚片中的水分流失,從而使魚片的觀感更新鮮、色澤更鮮艷。由圖1可知,鮮切草魚片在貯藏過程中,魚肉的持水率呈不斷下降的趨勢,其中貯藏前4 d,各組持水率均下降平緩；第4天后,對照組持水率下降速率加快,且明顯快于其他處理組；第12天開始,對照組與Ch和Ch+CIN涂布魚片的持水率差異顯著(P<0.05)；第16天對照組持水率下降至71.2%,而同天Ch和Ch+CIN處理組的持水率分別為88.5%和91.4%。結果表明,添加抗菌涂層,魚肉持水能力得到了提高,且Ch+CIN的效果較Ch好,這說明殼聚糖涂層能增加草魚片的持水能力,這可能是因為殼聚糖涂層能夠減少魚片表面水分蒸發(fā)和重吸收流失的水分。JEON等[18]也報道了類似的研究結果,冷藏期間殼聚糖涂膜處理的鯡魚和大西洋鱈魚的汁液流失率顯著低于對照組。周然等[19]的研究發(fā)現(xiàn)一些微生物可以分泌一種裂解肌纖維細胞的酶致使肌肉中的水分流失。而Ch+CIN這2種抗菌保鮮成分聯(lián)合起來,能有效抑制裂解魚肉肌纖維微生物的繁殖,更好地提高了魚片的持水能力。

圖1 草魚片冷藏期間持水率的變化Fig.1 Changes in water retention ratio of grass carp fillets during cold storage

2.2 微生物分析

圖2-a分析了冷藏過程中總活菌數(shù)(total viable count,TVC)的變化,結果表明,Ch和Ch+CIN處理草魚片中的初始TVC分別為3.18和3.38 lg CFU/g,而對照組為3.86 lg CFU/g。在不進行處理的情況下,魚肉在貯藏過程中TVC含量會隨時間而增加,而Ch和Ch+CIN處理中魚片的菌落總數(shù)在第8天開始顯著低于對照組,到貯藏12 d,Ch和Ch+CIN處理組魚片中的TVC仍低于6.00 lg CFU/g,而對照的TVC高達8.15,高于生魚片中TVC的最高允許限量(7.00 lg CFU/g)。結果表明,Ch和Ch+CIN處理能顯著延長鮮切草魚片的冷藏保質(zhì)期。嗜冷細菌是在冷藏溫度儲存下導致鮮魚腐敗的主要微生物群[18]。圖2-b中結果表明,隨著儲存時間的延長,嗜冷細菌的生長模式與TVC相似,不同的是Ch和Ch+CIN處理中魚片的嗜冷細菌菌落總數(shù)在第4天開始就顯著低于對照組,對照在第16 天時嗜冷細菌菌落總數(shù)達到8.43 lg CFU/g,而Ch和Ch+CIN處理分別為4.82和4.26 lg CFU/g,殼聚糖和殼聚糖-肉桂精油復合涂層對導致魚片腐敗的嗜冷細菌的抑制效果更顯著。殼聚糖涂層對魚肉制品的抗菌性能在文獻中已有過報道,殼聚糖包被的鱈魚和鯡魚樣品在冷藏12 d后細菌生長(瓊脂平板計數(shù)總數(shù),20 ℃)才達到最高允許限量,涂層樣品較對照組減少了3個對數(shù)生長周期[20]。TSAI等[21]也發(fā)現(xiàn),用1%殼聚糖溶液對生魚片進行3 h的預處理,可延緩生魚片中嗜中桿菌、嗜冷菌、大腸菌群、氣單胞菌和弧菌屬數(shù)量的增加。而影響殼聚糖抗菌作用的各種因素及其作用機制似乎與帶正電荷的殼聚糖分子與帶負電荷的微生物細胞膜之間的相互作用有關[20]。本研究發(fā)現(xiàn),與Ch涂層相比,Ch+CIN涂層添加了天然植物精油,對腐敗細菌具有更強的抑制作用。這可能是由于肉桂精油中含有高濃度的反式肉桂醛,而反式肉桂醛是一種很強的抗菌化合物,此外肉桂精油中的芳樟醇、丁香酚和其他酚類化合物也有一定的抗菌作用[22]。

a-菌落總數(shù);b-嗜冷細菌數(shù)圖2 草魚片冷藏期間菌落總數(shù)和嗜冷細菌數(shù)的變化Fig.2 Changes in total viable and psychrotrophic counts of grass carp fillets during cold storage

2.3 化學品質(zhì)分析

2.3.1 TVB-N值分析

貯藏中的魚肉在內(nèi)源酶以及細菌的作用下,蛋白質(zhì)會分解為胺類、氨以及含氮揮發(fā)性物質(zhì)和鹽基態(tài)氮,這類物質(zhì)總稱TVB-N,TVB-N與新鮮度關系緊密,因此被作為評價魚類等水產(chǎn)品變質(zhì)腐敗程度的重要指標。參考水產(chǎn)品新鮮度標準[23]：一級鮮度≤15 mg/100 g,二級鮮度≤20 mg/100 g,變質(zhì)肉>20 mg/100 g。本研究通過測定在冷藏條件下魚片中的TVB-N值來分析抗菌涂層對魚片的保鮮效果。由圖3可以看出,隨著貯藏時間的延長,鮮切草魚片的TVB-N值逐漸上升,表明其魚肉腐敗加劇,大量含氮揮發(fā)物釋放。在貯藏前4 d,所有組TVB-N值均緩慢上升,其后對照組上升趨勢加劇,TVB-N值隨貯藏時間的延長而顯著較高(P<0.05)。在第8天,對照組的TVB-N值為22.66 mg/100 g,達到變質(zhì)肉標準,而抗菌涂層處理組的TVB-N值在整個保存期內(nèi)都保持在變質(zhì)肉標準以下。由于TVB-N主要是由魚肉的細菌分解而產(chǎn)生的,而冷藏8 d后對照樣品的總活菌數(shù)比處理組顯著增高,所以這可能就是對照組冷藏8 d 后TVB-N值顯著增高的原因。JEON等[18]使用可溶性殼聚糖涂料處理鱈魚和鯡魚魚片發(fā)現(xiàn),在12 d儲存期結束時,處理組的TVB-N較對照組分別減少了33%～50%和26%～51%。TSAI等[21]也發(fā)現(xiàn)使用1%殼聚糖溶液預處理生魚片3 h,顯著延緩了魚片中TVB-N的增加。在本研究中,涂布Ch+CIN魚片的TVB-N值在12 d后顯著低于只涂布Ch的樣品(P<0.05),這可能歸功于肉桂精油的強力抗菌作用。

圖3 草魚片冷藏期間TVB-N值的變化Fig.3 Changes in TVB-N of grass carp fillets during cold storage

2.3.2 TBA分析

含脂食品中不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)物丙二醛可以與TBA試劑反應生成紅色化合物,并且在波長532 nm處有最大吸收峰,因此,TBA可以用來反映魚肉中脂肪氧化程度,并以此判斷其腐敗程度[19-20]。由圖4可知,冷藏草魚片的TBA值隨時間的延長逐漸增加。涂布了抗菌涂層劑的處理組TBA值均低于對照組,這可能是因為添加抗菌涂層劑后,減輕了因微生物釋放出的酶類作用導致的魚肉肌纖維細胞裂解[19],從而加劇了其中脂肪的氧化；其中Ch+CIN處理組TBA值上升趨勢最為緩和,且始終低于其他組,這可能是因為肉桂醛的抗氧化作用抑制了草魚片脂肪的腐敗氧化。第16天,Ch+CIN處理組TBA值僅為0.19 mg MDA/kg,顯著低于對照組的0.26 mg MDA/kg(P<0.05)。研究表明殼聚糖的阻隔性能可能有助于控制草魚片中的脂質(zhì)氧化,這也是殼聚糖抗氧化性在食品中的應用之一[1],而在殼聚糖涂層中加入肉桂油可能具有協(xié)同作用。有研究者建議,質(zhì)量良好的魚肉TBA值應<5.00 mg MDA/kg[27],在本研究中,對照和涂布抗菌涂料的草魚魚片樣品的TBA值在16 d的冷藏期內(nèi)都遠遠低于該建議的臨界值。

圖4 草魚片冷藏期間TBA值的變化Fig.4 Changes in TBA of grass carp fillets during cold storage

2.3.3 POV

涂層對魚片POV變化的影響如圖5所示,魚片樣品的POV隨貯藏時間的延長而顯著增加,在貯藏第16天時,對照組(6.12 meq/kg)與Ch(4.34 meq/kg)和Ch+CIN(3.92 meq/kg)涂布魚片樣品的POV差異顯著(P<0.05)。研究結果表明,殼聚糖涂層能有效地抑制冷藏保存草魚片中POV的產(chǎn)生。這些結果與JEON等[18]報道的殼聚糖涂層能有效地延緩鯡魚魚片中初級脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生的結果一致。

圖5 草魚片冷藏期間POV的變化Fig.5 Changes in POV of grass carp fillets during cold storage

2.4 感官評價分析

對草魚片冷藏期間的感官性狀進行了評定,結果如表1所示。對照組和涂層劑處理組的魚片質(zhì)地、氣味和色澤均在第8天開始出現(xiàn)顯著差異(P<0.05),且在冷藏12 d后Ch+CIN和Ch處理組與對照組相比出現(xiàn)顯著差異(P<0.05),說明殼聚糖聯(lián)合肉桂精油對草魚片冷藏期間的感官品質(zhì)保持具有更好的效果。對照樣品(無涂層處理)在第8天開始出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象,同時魚片出現(xiàn)質(zhì)地松散、有異味和褪色,這些現(xiàn)象可能跟魚片中水分的丟失、脂質(zhì)的高度氧化、腐敗菌的大量繁殖等有關。而添加了抗菌保鮮涂層后,其抗氧化、抑菌和氣體阻隔效果使得魚片氧化和品質(zhì)劣化程度最小化,延長了產(chǎn)品保質(zhì)期,同時保證了產(chǎn)品品質(zhì)。

表1 處理草魚片冷藏期間的感官性狀變化Table 1 Changes in sensory characteristics of grass carp fillets during cold storage

3 結論

本研究制備了一種能抑制草魚片脂質(zhì)氧化和微生物生長的含肉桂精油殼聚糖涂層,抗菌保鮮涂層用于冷藏草魚片的儲藏保鮮結果表明,添加抗菌涂層后,魚肉持水能力得到了提高,且Ch+CIN的效果大于Ch,使魚肉的觀感和色澤得以保持更長時間。殼聚糖涂層和含肉桂精油殼聚糖涂層均能很好地抑制草魚片冷藏期間菌落總數(shù)和嗜冷菌數(shù)的增加,與Ch涂層相比,Ch+CIN涂層添加了天然植物精油,對腐敗細菌具有更強的抑制作用。添加抗菌涂層Ch和Ch+CIN后,冷藏草魚片中TVB-N含量、TBARS、POV隨著冷藏時間的增加分別在冷藏第8、16天、冷藏第16天較對照出現(xiàn)了顯著下降,且涂布Ch+CIN魚片的TVB-N值在12 d后顯著低于只涂布Ch的魚片,說明Ch+CIN涂層對魚片的保鮮效果更好。感官特性分析表明無涂層對照組和涂層處理組的魚片質(zhì)地、氣味和色澤均在第8天開始出現(xiàn)顯著差異,在冷藏12 d后Ch+CIN和Ch處理組出現(xiàn)顯著差異。綜上所述,在冷藏16 d內(nèi)Ch+CIN涂層處理草魚片能很好地保持草魚片的感官特性,延長草魚魚片的保質(zhì)期,直至儲存周期(第16天)都沒有出現(xiàn)任何明顯的質(zhì)地、氣味、色澤變化,且無顯著微生物生長,保質(zhì)期達到16 d以上,較無涂層空白對照延長貨架期8 d以上。因此殼聚糖和肉桂精油處理草魚片能增加冷藏期間草魚片的防腐保鮮能力,而殼聚糖與肉桂精油同時使用可以為冷藏草魚片提供更好的防腐保鮮效果,這也是一種可用作水產(chǎn)品儲藏保鮮的安全、方便和高效的活性涂層材料。