趙 馳，郭蓉娟，任非非，于 姚，李俊男，李 陽

（1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京100010）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是以進行性認知功能障礙為主要特征的常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是65 歲以上人群致殘的主要原因［1，2］。在AD 進 程 中 可 以 出 現(xiàn) 不 同 程 度 的 精 神 障礙，抑郁障礙是常見的共病性精神障礙之一。流行病學(xué)研究表明，近40%的AD 患者會在癡呆進展過程中出現(xiàn)抑郁障礙［3］，且AD 患者出現(xiàn)持續(xù)性抑郁障礙的比例很高，約30%～85%，而常規(guī)的抗抑郁藥物對于AD 患者伴發(fā)抑郁治療效果不佳［4］。

抑肝散首載于明代名醫(yī)薛鎧所著的《保嬰撮要》中，原方由柴胡、鉤藤、當(dāng)歸、川芎、甘草、茯苓、白術(shù)組成，具有平肝解痙、健脾養(yǎng)血之功。日本漢方醫(yī)學(xué)將抑肝散用于治療癡呆的精神行為癥狀（behavioral and psychological symptoms of dementia，BPSD）［5］。國內(nèi)中醫(yī)學(xué)者也多將其用于神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)疾病的治療［6，7］?；A(chǔ)研究表明，抑肝散能夠抑制β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的形成，并且能夠抑制谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性作用，同時可以不同程度地提升老年大鼠前額葉皮質(zhì)的5-羥 色 胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）及 多 巴 胺（dopamine，DA）水平，從而發(fā)揮改善認知、抗抑郁、抗焦慮及神經(jīng)保護等作用［8，9］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念最先由Hopkins［10］在網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)及系統(tǒng)藥理學(xué)的基礎(chǔ)上提出，中藥復(fù)方富含的化學(xué)成分能夠針對不同靶點，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究從中藥成分、靶點與疾病靶點之間的相互作用出發(fā)，可在一定程度上揭示中藥復(fù)雜的作用機制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［11］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討抑肝散活性成分對AD 伴發(fā)抑郁障礙的作用靶點及信號通路，闡明其可能的治療機制以及復(fù)方功效與活性成分的生物相關(guān)性，為進一步明確中藥抗癡呆、抗抑郁療效及臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 抑肝散化學(xué)成分收集及篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/index.php，Version 2.3）對抑肝散中的7 味中藥進行檢索，篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-like，DL）≥0.18，血腦屏障（blood brain barrier，BBB）≥-0.3，并通過查閱文獻，納入篩選標(biāo)準(zhǔn)以外但具有明確生物活性及藥理作用的化學(xué)成分。

1.2 抑肝散靶點預(yù)測

將篩選后的活性化合物通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）進行檢索并校對，存儲化合物的2D 結(jié)構(gòu)，通過Swiss Target Prediction 服 務(wù) 器（http：//www.swisstargetprediction.ch/）進行反向靶點預(yù)測。通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/，Update in 2014-04-10）對蛋白靶點進行校正。

1.3 疾病靶點預(yù)測

通過檢索Genecards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/，Version 4.14）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/，Update in 2020-05-08）、PharmGkb 數(shù)據(jù)庫（https：//www.pharmgkb.org/）獲得AD 及抑郁障礙的靶點基因。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

使用Cytoscape-v3.7.2 構(gòu)建藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，并進一步分析網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點的屬性及聯(lián)絡(luò)關(guān)系。

1.5 靶點的基因富集分析和代謝通路分析

利用R 語言對交集基因進行GO terms 及KEGG pathway 富 集 分 析，使 用clusterProfiler 包［12］進行分析，分別對GO 生物學(xué)過程及KEGG 通路進行分析，設(shè)定P≤0.01，選取前20 位的結(jié)果，運用enrichplot 包進行可視化。

1.6 PPI 分析

蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）信息有助于挖掘抑肝散重要藥效團及效用靶點，將抑肝散治療AD 伴發(fā)抑郁的作用靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）以獲取蛋白相互作用信息［13］，運用Cytoscape 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖并進行分析。運用MCODE 插件進一步對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行模塊化分析，得到Cluster 模塊分析結(jié)果。

1.7 AutoDock Vina 分子對接

AutoDock Vina 主要用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白質(zhì)功能等方面的研究，可以預(yù)測重要活性成分與蛋白受體的結(jié)合性。將PPI 網(wǎng)絡(luò)中作用關(guān)系較為復(fù)雜的靶蛋白作為分子對接的受體，從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù) 庫PDB（http：//www.rcsb.org/）中 獲 取 目 標(biāo) 蛋白，利用AutoDock Vina 進行分子對接，對接結(jié)果通過PyMOL 進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 抑肝散活性成分篩選

基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果，共收集到1 097個活性化合物，對化合物的OB、DL、BBB 參數(shù)進行篩選，并通過查閱文獻進行補充。對于篩選標(biāo)準(zhǔn)以外的如山奈酚、槲皮素［14］、阿魏酸［15］、藁本內(nèi)酯［16］、白術(shù)內(nèi)酯［17］等經(jīng)文獻報道具有抗抑郁或抗癡呆等藥理作用的化合物也納入候選活性成分，最終共得到活性成分125 種。見表1。

表1 抑肝散活性成分基本信息表Tab 1 Active ingredients of Yigan Powder

續(xù)表

2.2 抑肝散靶點預(yù)測

基于Swiss Target Prediction 平臺反向靶點預(yù)測結(jié)果，得到抑肝散活性成分的相關(guān)人源靶點蛋白，篩選probability＞0 并去除重復(fù)靶點，利用UniprotPKB 檢索功能進行校正并轉(zhuǎn)換為經(jīng)驗證的人源靶點，最終得到預(yù)測靶點基因953 個。

2.3 疾病靶點采集

基于GeneCards、OMIM、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果，共得到AD 相關(guān)基因1 016 個，抑郁障礙相關(guān)基因1 248 個。將抑肝散預(yù)測靶標(biāo)映射至疾病靶標(biāo)中，并繪制韋恩圖（圖1），953 個預(yù)測靶標(biāo)中有166 個與AD 密切相關(guān)，179 個與抑郁障礙密切相關(guān)，其中85 個基因同時涉及兩種疾病，是抑肝散治療AD 伴發(fā)抑郁障礙的重要靶點。

圖1 靶標(biāo)韋恩圖Fig 1 Venn diagram of targets of Yigan Powder-Alzheimer's disease-depressive disorder

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

2.4.1 活性成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò) 將抑肝散的125種活性成分和953 個預(yù)測靶點信息導(dǎo)入Cytoscape軟件，據(jù)相互作用關(guān)系構(gòu)建藥物-活性成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)（圖2），節(jié)點（node）表示活性成分及預(yù)測靶點，邊（edge）表示活性成分與預(yù)測靶點之間的聯(lián)系。對活性成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)進行分析，該網(wǎng)絡(luò)由1 081 個節(jié)點及8 591 條邊構(gòu)成，平均每個節(jié)點與15.895 個節(jié)點相關(guān)聯(lián)，125 個活性成分中，有45 個活性成分對應(yīng)靶點超過100 個，可能是抑肝散的主要效用成分，其中31 個活性成分來自甘草，10 個活性成分來自鉤藤。

圖2 藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network of herbs-active ingredients-targets

2.4.2 活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò) 將125 個活性成分及與AD、抑郁障礙相關(guān)的潛在靶點構(gòu)建活性成分-潛在靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），網(wǎng)絡(luò)分析參數(shù)中的度值（degree）是指與節(jié)點相聯(lián)絡(luò)的邊的條數(shù)，活性成分的度值越高則表明該化合物相關(guān)聯(lián)的靶點越多，對節(jié)點的顏色進行調(diào)節(jié)，度值越高的節(jié)點越接近紅色，越低則越接近藍色，該網(wǎng)絡(luò)中有8 個活性成分度值大于40，以甘草及鉤藤中的活性成分為主，其中涉及4 種黃酮類物質(zhì)，2 種生物堿，可能是抑肝散治療AD 伴發(fā)抑郁的重要活性成分（表2）。

表2 抑肝散靶點網(wǎng)絡(luò)主要活性成分及節(jié)點信息Tab 2 Main active ingredients and degree in Yigan Powder target network

圖3 抑肝散活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Network of active ingredients-disease targets

在85 個交集基因中，有60 個靶基因至少與5 個活性成分相連，靶點度值越高，則其與AD 合并抑郁障礙的相關(guān)性越高，其中度值前10 位的靶點涉及雌激素受體、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、單胺氧化酶、糖原合成激酶等（表3）。

表3 抑肝散靶點網(wǎng)絡(luò)主要靶蛋白及節(jié)點信息Tab 3 Main target protein and degree in Yigan Powder target network

2.5 GO 富集分析及KEGG 通路富集分析

靶基因涉及的生物學(xué)過程主要包括認知、學(xué)習(xí)、記憶，神經(jīng)遞質(zhì)的代謝、調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)運，突觸的傳遞及調(diào)節(jié)，MAPK 活性調(diào)節(jié)，膠質(zhì)細胞再生及分化，活性氧的合成及代謝，鈣離子穩(wěn)態(tài)平衡等（圖4）。KEGG 通路富集分析結(jié)果涉及AD 相關(guān)信號通路、神經(jīng)活性配體-受體作用、多巴胺能神經(jīng)元突觸、5-HT 能 神 經(jīng) 元 突 觸、HIF-1 信 號 通 路、Rap 1 信 號 通路、癌癥相關(guān)蛋白多糖、EGFR-TKI 耐藥、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 系統(tǒng)信號通路等（圖5）。其中，AD 相關(guān)通路包括氧化磷酸化、自噬、細胞凋亡、胰島素信號通路、鈣離子信號通路等，覆蓋了核心靶點淀粉樣前體蛋白（APP）、早老素（PSEN），涉及tau 蛋白磷酸化及神經(jīng)元纖維纏結(jié)（NFTs），參與調(diào)節(jié)N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR），與神經(jīng)元凋亡、自噬缺陷、線粒體功能障礙、神經(jīng)遞質(zhì)缺陷、軸突運輸障礙、突觸可塑性受損和神經(jīng)變性等病理過程密切關(guān)聯(lián)（圖6）。

圖4 GO 生物學(xué)過程富集分析Fig 4 GO biological process enrichment analysis

圖5 KEGG 通路富集分析Fig 5 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 PPI 網(wǎng) 絡(luò) 及Cluster 模 塊 分 析

2.6.1 PPI 網(wǎng)絡(luò) 將網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)中Combined score≥0.9 的節(jié)點構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，圖中節(jié)點的面積和顏色與度值相關(guān)，邊的顏色和粗細與Combined score 相關(guān)，67 個蛋白之間存在191 種相互作用關(guān)系（見圖7）。其中，淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因 子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等為PPI 網(wǎng)絡(luò)的中心部分，涉及較多的蛋白相互作用，與抑肝散的效用機制密切相關(guān)。

2.6.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)Cluster 模塊 使用Cytoscape 軟件的MCODE 插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行Cluster 模塊分析，共得到5 個Cluster 模塊（圖7）。進一步了解5 個Cluster 模塊分別涉及的生物學(xué)功能，Cluster1 與突觸信號傳遞過程高度相關(guān)，與鈣離子信號通路及PI3k/Akt 信號通路密切相關(guān)；Cluster2 主要與谷氨酸受體活性和環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosaphate，cAMP）信號通路相關(guān)；Cluster3 與白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-17、活性氧（reactive oxygen species，ROS）生物合成相關(guān)，涉及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號通路等多條炎癥信號通路；Cluster4 與5-HT、DA 等神經(jīng)遞質(zhì)代謝過程相關(guān)；Cluster5 與類固醇代謝有關(guān)。

2.7 AutoDock Vina 分子對接

采用AutoDock Vina 進行分子對接，將Wallichilide（川芎萘呋內(nèi)酯）、7-Acetoxy-2-methylisoflavone（7-乙酰氧基-2-甲基異黃酮）作為配體，受體為PPI網(wǎng)絡(luò)中度值較高的靶蛋白，包括APP、MAPK1、STAT3，以及治療AD 和抑郁癥的一線藥物靶點蛋白乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）、5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白（serotonin transporter，SERT），AchE的對照藥物為鹽酸多奈哌齊，SERT 的對照藥物為艾司西酞普蘭，利用PyMOL 軟件將對接構(gòu)象進行可視化（圖8）。

圖8 AutoDock Vina 分子對接可視圖Fig 8 Results of AutoDock Vina molecular docking

2 種活性成分與5 種靶蛋白分別形成多種對接構(gòu)象，選取結(jié)合能較低的結(jié)果作為分子對接結(jié)果（表4），結(jié)合能越小代表配體與受體蛋白結(jié)合性越好，Wallichilide 及7-Acetoxy-2-methylisoflavone 對5種靶蛋白均有較好的結(jié)合力，但是抑肝散活性成分與對照藥物鹽酸多奈哌齊及艾司西酞普蘭相比，分子對接結(jié)合性與對照藥物相比較差。

表4 分子對接結(jié)果信息Tab 4 Results of ligand-receptor molecular docking

3 討論

阿爾茨海默病是一種復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，AD 與抑郁障礙均涉及多種發(fā)病假說，但共同存在神經(jīng)遞質(zhì)水平下降、突觸數(shù)量減少、腦源性神經(jīng) 營 養(yǎng) 因 子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平下降、線粒體功能障礙、神經(jīng)炎癥等病理生理學(xué)特征［18］。中醫(yī)自古便有“異病同治”的治療觀，中藥復(fù)方又具有多成分-多靶點-多通路的特點，可以協(xié)同調(diào)控復(fù)雜的疾病網(wǎng)絡(luò)。臨床研究表明，抑肝散具有改善認知的作用，并且能夠顯著改善AD 患者的精神行為癥狀［19］，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)用抑肝散可以減少抗精神病藥物的劑量［20］，提示抑肝散具有較好的抗癡呆、抗抑郁療效。

本研究基于數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)抑肝散干預(yù)AD 伴發(fā)抑郁障礙與125 個主要活性成分相關(guān)，靶點預(yù)測和網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明APP、MAPK、ESR、MAO、GSK3B 等靶點在抑肝散的藥理功能中起關(guān)鍵作用。APP 在人體內(nèi)經(jīng)蛋白酶裂解后便產(chǎn)生Aβ，最終引起突觸功能障礙、神經(jīng)炎癥以及細胞死亡，是AD 的核心病理過程之一。MAPK 是一種廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要由細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK），p38 和c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）組成，其中p38 居于重要地位，參與促炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并能調(diào)節(jié)細胞因子的合成，可引起不同程度的神經(jīng)炎癥，并涉及tau 蛋白過度磷酸化及細胞凋亡［21］。雌激素對記憶性膽堿能神經(jīng)元具有保護作用，并且能夠通過激活ESR 而抑制Aβ 的生成和累積，通過調(diào)節(jié)細胞骨架、蛋白轉(zhuǎn)運等生物學(xué)過程，改善突觸傳遞功能［22］，影響記憶、學(xué)習(xí)等多種行為過程。同時，雌激素應(yīng)答可以提高DA 神經(jīng)的敏感性并增加血清5-HT 的含量，在情緒障礙及認知障礙進程中發(fā)揮作用。MAO 是機體內(nèi)參與單胺類物質(zhì)代謝的主要酶類，參與5-HT、DA 等多種神經(jīng)遞質(zhì)的分解過程。SRC 是NMDAR 酪氨酸磷酸化的主要酪氨酸激酶，通過介導(dǎo)NMDARs 磷酸化引起的谷氨酸能神經(jīng)傳遞功能障礙及神經(jīng)突觸可塑性改變與AD 及抑郁障礙的病理生理過程有關(guān)［23］。GSK3B 參與tau 蛋白的磷酸化過程及神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成，還能引起腦內(nèi)Aβ 合成增加，誘發(fā)神經(jīng)元凋亡，與AD 發(fā)病密切相關(guān)［24］。同時，抑肝散亦可作用于AchE 單獨治療AD，通過抑制AchE 的活性，增強膽堿能神經(jīng)元突觸間ACh 的水平及傳遞效能，達到改善AD 患者臨床癥狀的目的?？梢?，抑肝散可以通過多種靶點和信號通路作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)揮抗癡呆、抗抑郁、抗氧化、抗炎及神經(jīng)保護等作用。

GO 富集分析結(jié)果表明，靶點關(guān)聯(lián)的生物學(xué)過程主要涉及神經(jīng)遞質(zhì)代謝，突觸傳遞，MAPK 級聯(lián)激活，鈣離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)等。通路富集分析的結(jié)果表明，靶點參與的通路主要涉及氧化磷酸化、細胞凋亡、鈣離子信號通路等。神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常是AD 和抑郁癥的共同病理生理學(xué)表現(xiàn)，抑肝散活性成分可以靶向調(diào)控AchE、SERT，改善腦內(nèi)5-HT、ACh 等神經(jīng)遞質(zhì)的代謝。MAPK 在應(yīng)激等細胞外刺激的作用下，參與處理和調(diào)節(jié)多種細胞活動。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在AD 早期階段，中樞神經(jīng)系統(tǒng)就存在p38 MAPK 的激活［25］，是AD 發(fā)生的重要機制之一，而ERK 可以與多種神經(jīng)遞質(zhì)受體結(jié)合而誘發(fā)抑郁癥狀［26］。同時，抑制p38 MAPK 活性可以阻斷NFκB 信號通路，減少IL-1β、IL-18 等致炎因子的釋放，從而減輕神經(jīng)炎癥。由于代謝、氧化、應(yīng)激等反應(yīng)，受損的神經(jīng)元細胞出現(xiàn)鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)會誘發(fā)Aβ聚集、tau 蛋白磷酸化、線粒體功能障礙等病理過程，最終影響學(xué)習(xí)和記憶［27］。鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)也會引起NMDAR 的過度激活，觸發(fā)谷氨酸毒性反應(yīng)，可以導(dǎo)致神經(jīng)元細胞凋亡。抑肝散可以通過多種途徑對鈣離子信號通路進行調(diào)控，抑制tau 蛋白過度磷酸化，改善線粒體功能，抑制神經(jīng)元細胞的凋亡［28］。PPI 網(wǎng)絡(luò)可以觀察蛋白間的相互作用及調(diào)控關(guān)系，抑肝散治療AD 伴發(fā)抑郁障礙的PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示APP、MAPK1、STAT3、SRC 等存在較多的蛋白互作關(guān)系，可能是抑肝散的關(guān)鍵效用靶點，主要參與調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)炎癥及細胞凋亡等。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過對中藥復(fù)方和疾病靶點進行分析，發(fā)掘了抑肝散治療AD 伴發(fā)抑郁障礙的復(fù)雜關(guān)系網(wǎng)絡(luò)及潛在機制。研究結(jié)果表明了抑肝散的作用靶點、生物學(xué)過程及相關(guān)通路，不僅可以針對AD 的核心靶點，減輕Aβ的沉積，也能夠起到減輕神經(jīng)炎癥、改善神經(jīng)可塑性、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)代謝等作用，能夠在一線藥物的基礎(chǔ)上改善AD 進程中出現(xiàn)的情緒障礙，與西藥聯(lián)用可以體現(xiàn)出較好的療效，可以為AD 伴發(fā)抑郁障礙的治療提供新思路，但其結(jié)果仍需相關(guān)研究進一步驗證。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法基于現(xiàn)有化合物的明確信息，不能完全明確化合物間的化學(xué)反應(yīng)以及機體代謝過程出現(xiàn)的變化，亦需進一步深入研究抑肝散藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制。

作者貢獻度說明：

趙馳：本研究方案設(shè)計者和執(zhí)行人，完成數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析、論文初稿寫作及論文審閱等工作；郭蓉娟：指導(dǎo)研究設(shè)計及數(shù)據(jù)分析，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱；任非非：參與研究設(shè)計和結(jié)果分析，對文章內(nèi)容進行審閱；于姚，參與數(shù)據(jù)采集，在統(tǒng)計分析方面提供一定技術(shù)支持；李俊男：參與文獻查閱，指導(dǎo)論文修改；李陽：參與文獻查閱，對文章內(nèi)容進行審閱。