梁愛武，吳官柱，龍 馨，賴慶來，李 軍，羅珍瑤，韋筱園，李 婷，黃天圓

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive Pulmonary disease，COPD）是一種內(nèi)科常見的、以持續(xù)氣流受限和呼吸癥狀為特征的可防治的異質(zhì)性疾?。?］。最新的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，COPD 的全球患病 率 約 為11.7%［2］，全 世 界 共 有3.84 億 人 患 有COPD，其中約有6 500 萬人被診斷患有中度至重度COPD［3］。世衛(wèi)組織預(yù)測，至2030 年，COPD 年死亡率可達(dá)450 萬，成為第三大死亡原因［4］。而中國總患病人數(shù)約9 990 萬，已造成重大疾病負(fù)擔(dān)［5］。COPD 是慢性肺部和氣道炎癥性疾病，炎癥因子使氣道及肺組織炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致肺功能呈進(jìn)行性下降［6］，并影響糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）的活性［7］，部分患者對糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GC）治療不敏感，產(chǎn)生GC 抵抗［8，9］。尋找能有效提高COPD 患者對GC 敏感性的藥物成為治療面臨的主要挑戰(zhàn)。

前期臨床研究表明［10-14］，使用扶肺固腎飲聯(lián)合舒利迭吸入治療COPD 穩(wěn)定期重度、極重度患者可明顯改善臨床證候積分、BODE 指數(shù)、減少年發(fā)作次數(shù)、提高患者生活質(zhì)量。為探討扶肺固腎飲的作用機(jī)制，本研究用煙熏聯(lián)合脂多糖、冷空氣刺激制造COPD 大鼠模型，予以不同濃度的扶肺固腎飲進(jìn)行干預(yù)，探討該藥對COPD 大鼠氣道炎癥及糖皮質(zhì)激素受體的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

選取50 只8 周齡Wistar 雄性大鼠，體重180～220 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。大鼠為長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物許可證編號SCXK（湘）20140010。本實(shí)驗(yàn)通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1. 2 藥物及配制

扶肺固腎飲組成：山萸肉20 g，生地20 g，山藥30 g，黨參20 g，大棗10 g，陳皮15 g，茯苓25 g，桔梗15 g，蘇子15 g，丹皮10 g，澤瀉15 g，白術(shù)20 g，生姜10 g，姜半夏20 g，丹參10 g，生龍骨30 g，炙甘草10 g。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院向江陰天江藥業(yè)有限公司購入中藥顆粒，每付顆粒重量為50 g。

1.3 主要試劑與儀器

真龍牌香煙（煙堿量1.4 mg/盒，焦油量14 mg/盒，由廣西卷煙總廠生產(chǎn)）；脂多糖，Solarbio 公司；水合氯醛晶體，成都市科隆化學(xué)品有限公司；酒精，Solarbio 公司；大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、大鼠白介素-17A（IL-17A）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）、金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）酶聯(lián)免疫試劑盒均購于武漢華美生物工程有限公司，RT、PCR、總RNA 提取試劑盒均購于寶生物TaKaRa 公司；DAB 顯色試劑盒、SP 免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物公司；自制大鼠造模煙熏箱：大小為150 cm×80 cm×50 cm，每側(cè)均設(shè)有小孔；離心機(jī)，吳諾斯生物。

1.4 COPD 大鼠模型的制備及分組

50 只Wistar 雄性大鼠，隨機(jī)分為5 組：空白對照組、COPD 模型組及扶肺固腎飲高、中、低劑量組，每組10 只，除空白對照組，其余4 組以煙熏聯(lián)合脂多糖、冷空氣刺激制造COPD 大鼠模型：第1、14 天用10%水合氯醛溶液對大鼠進(jìn)行麻醉，將0.1 mL脂多糖（1 mg/mL）滴入大鼠氣管內(nèi)，將大鼠朝上提起，使脂多糖均勻分布于大鼠的左右兩肺。第2～28 天（第14 天除外）將造模組大鼠置于自制煙熏箱內(nèi)，內(nèi)熏15 支真龍牌香煙，30 min/次，一天兩次。空白對照組于第1、14 天將0.1 mL 的生理鹽水注入到大鼠的氣管內(nèi)。造模結(jié)束后，隨機(jī)法處死2 只空白對照組、2 只模型組大鼠，將其全肺組織送至廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院做病理學(xué)檢測確定已成功造模，將余下大鼠隨機(jī)分組為模型組和扶肺固腎飲高、中、低劑量組。

造模成功后，空白對照組、COPD 模型組予蒸餾水3 mL/只灌胃，扶肺固腎飲高、中、低劑量組分別予1.02、0.51、0.26 g 中藥配方顆粒/100 g/d 灌胃，每日2 次，連續(xù)給藥28 d。

1.5 給藥

造模完成后，給予中藥干預(yù)，依據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)第4 版，按照人和大鼠計(jì)量換算系數(shù)6.17 計(jì)算可得高、中、低劑量中藥組每100 g 大鼠所需中藥配方顆粒分別為1.02 g/d、0.51 g/d、0.26 g/d。將已加熱的蒸餾水（6 mL/只）、中藥顆?；靹颍玫礁鹘M大鼠1 d 所需的中藥量。灌胃給藥時(shí)，于每日9：00、18：00，分兩次，3 mL/次，連續(xù)28 d。空白對照組、模型組給予3 mL/次/只蒸餾水。連續(xù)28 d。期間需觀察實(shí)驗(yàn)鼠狀態(tài)、呼吸、咳嗽、反應(yīng)速度、進(jìn)食飲水量、口鼻分泌物及大小便情況，每7 天記錄1 次大鼠體重。

1.6 樣本采集及處理

1.6.1 血清、肺泡灌洗液制備與處理 各組大鼠灌胃28 d 后采集樣本，將大鼠麻醉，把大鼠的腹部臟器拔向一側(cè)，使大鼠腹主動脈充分暴露后采血，采血量約為3 mL/只。取血完成后，使大鼠氣管充分暴露，從氣管1/2 處用一次性注射器注入2 mL 生理鹽水，然后回抽1.5 mL，灌洗3 次。將收集好的血清、右肺泡灌洗液離心后取上清液進(jìn)行分裝放置在-80 ℃冰箱中備用。

1.6.2 肺組織的提取 血清及右肺泡灌洗液（BALF）采集完畢后，將大鼠胸腹部的皮膚剪開，使胸腔、腹腔暴露，快速取出左肺組織并放置于4%甲醛中固定備用。

1.7 指標(biāo)測定

1.7.1 蘇木素-伊紅染色觀察大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的變化 取肺組織切片，行蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封片后，用光學(xué)顯微鏡觀察組織病理結(jié)構(gòu)。

1.7.2 大鼠血 清及右BALF TNF-α、TGF-β1、IL-17A 以及左肺組織中MMP-9、TIMP-1 的含量檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定實(shí)驗(yàn)鼠血清和右BALF TNF-α、TGF-β1、IL-17A 以 及 左 肺組 織 中MMP-9、TIMP-1 的含量，操作遵循試劑盒說明書。反應(yīng)終止后，立即在450 nm 波長處用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度（OD 值），通過數(shù)據(jù)計(jì)算TNF-α、TGF-β 1、IL-17A、MMP-9、TIMP-1 的含量。

1.7.3 大鼠肺組織GR mRNA 和蛋白測定 用免疫組織化測定各組大鼠左肺組織中糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)水平。采集各組免疫組化切片的圖像，使用軟件Image-Pro Plus 6.0 對結(jié)果進(jìn)行分析，并求出GR 的平均灰度值。采用RT-PCR 測定各組大鼠左肺組織的GR mRNA 表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以描述，多組間用單因素方差分析，組間比較用LDS 法（方差齊）或秩和檢驗(yàn)（方差不齊），P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況比較

空白對照組大鼠整體狀態(tài)好，皮毛光澤，呼吸平穩(wěn)，體重增長正常，反應(yīng)敏捷，進(jìn)食及攝水量均正常。模型組大鼠整體狀態(tài)差，毛發(fā)無光澤并有明顯脫落現(xiàn)象，出現(xiàn)咳嗽、氣喘，口鼻可見白色稀薄分泌物，體重增加速度明顯變慢，反應(yīng)變遲鈍，進(jìn)食及攝水量減少。經(jīng)扶肺固腎飲干預(yù)后，大鼠一般情況較模型組均有所好轉(zhuǎn)，中劑量組好轉(zhuǎn)度高于高、低劑量組。造模期間模型組、高劑量中藥組、低劑量中藥組大鼠各死亡1 只，給藥期間3 組中藥干預(yù)組大鼠各死亡1 只。

2.2 大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的變化

空白對照組大鼠支氣管黏膜上皮結(jié)構(gòu)相對完整，纖毛排列較整齊，無炎細(xì)胞浸潤，肺泡壁結(jié)構(gòu)相對完整，泡腔無擴(kuò)大（圖1A）。模型組大鼠支氣管黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死，杯狀細(xì)胞增生，纖毛黏連、縮短、部分脫落，肺泡壁變薄斷裂，大量炎性細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)肺大泡（圖1B）。扶肺固腎飲高、中、低劑量組大鼠氣道黏膜上皮結(jié)構(gòu)較完整，纖毛排列相對模型組整齊，炎性細(xì)胞及肺大泡形成相比模型組少（圖1C、D、E）；表明扶肺固腎飲可改善COPD 大鼠的氣道炎癥反應(yīng)，見圖1。

圖1 扶肺固腎飲對COPD 大鼠肺組織結(jié)構(gòu)影響（HE，×400）Fig 1 Effect of Fufei Gushen Decoction on organizational structure of lung tissue of COPD rats

2.3 各組大鼠血清及右BALF 中TNF-α、TGF-β1、IL-17A 的含量比較

與空白對照組相比，模型組大鼠血清及右BALF 中TNF-α、TGF-β1、IL-17A 的 含 量 明 顯 增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，各中藥干預(yù)組大鼠血清及右BALF 中TNF-α、TGF-β1、IL-17A 的含量均有所減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中中劑量組大鼠血清及右BALF中TNF-α、TGF-β1、IL-17A 減少量明顯多于高劑量組、低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、2。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、TGF-β1、IL-17A 含量的比較（pg/mL，）Tab 1 TNF-α，TGF-β1，IL-17A levels in serum of rats（pg/mL，

表1 各組大鼠血清中TNF-α、TGF-β1、IL-17A 含量的比較（pg/mL，）Tab 1 TNF-α，TGF-β1，IL-17A levels in serum of rats（pg/mL，

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，βP＜0.01，ΔP＜0.001；與中劑量中藥組相比，αP＜0.05，kP＜0.01。

IL-17A 15.21±3.87 24.36±4.85*19.51±3.86#α 16.26±3.91Δ 17.38±4.05βk 5.799 0.001組別空白對照組模型組高劑量中藥組中劑量中藥組低劑量中藥組n 10 98 9 8 FP TNF-α 65.08±12.25 152.47±20.36*110.73±10.49#α 82.27±11.81Δ 97.07±15.74βk 40.149＜0.001 TGF-β1 86.58±10.19 210.74±11.63*174.66±12.78#α 120.25±10.98Δ 147.05±12.46βk 129.645＜0.001

2.4 各組大鼠左肺組織中MMP-9、TIMP-1 的表達(dá)比較

表2 各組大鼠右BALF 中TNF-α、TGF-β1、IL-17A 含量的比較（pg/mL，）Tab 2 TNF-α，TGF-β1，IL-17A levels in right BALF of rats（pg/mL，

表2 各組大鼠右BALF 中TNF-α、TGF-β1、IL-17A 含量的比較（pg/mL，）Tab 2 TNF-α，TGF-β1，IL-17A levels in right BALF of rats（pg/mL，

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，βP＜0.01，ΔP＜0.001；與中劑量中藥組相比，αP＜0.05，kP＜0.01。

IL-17A 16.37±4.59 25.71±6.24*20.29±5.13#α 17.18±3.55Δ 18.25±4.82βk 4.364＜0.001組別空白對照組模型組高劑量中藥組中劑量中藥組低劑量中藥組n 10 98 9 8 FP TNF-α 124.00±10.46 270.00±12.14*201.00±10.94#α 169.00±11.58Δ 184.00±7.96βk 184.715＜0.001 TGF-β1 150.48±12.84 330.27±13.58*260.76±12.57#α 210.42±11.53Δ 240.07±14.69βk 193.875＜0.001

與空白對照組相比，模型組大鼠肺組織中MMP-9 的表達(dá)明顯增加、TIMP-1 的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，各中藥干預(yù)組大鼠肺組織中MMP-9 的表達(dá)均有所減少、TIMP-1 的表達(dá)均有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中扶肺固腎飲中劑量組大鼠肺組織中MMP-9 減少量與TIMP-1 的增加量明顯多于高劑量、低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 各組大鼠肺組織勻漿中MMP-9、TIMP-1 的表達(dá)（OD 值）Tab 3 MMP-9 and TIMP-1 levels in lung tissue homogenate of rats（OD value）

2.5 各組大鼠左肺組織中GR mRNA 和蛋白水平比較

與空白對照組相比，模型組大鼠肺組織中GR mRNA 和蛋白的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，各中藥干預(yù)組大鼠肺組織中GR mRNA 和蛋白的表達(dá)均有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中扶肺固腎飲中劑量組大鼠肺組織中GR mRNA 和蛋白的增加量明顯多于高劑量組、低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表4）。GR 陽性表達(dá)率見圖2。

圖2 各組大鼠免疫組化GR 表達(dá)陽性表達(dá)圖（光學(xué)顯微鏡，×400）Fig 2 Expression of GR in lung tissue of rats by immunohistochemical method（light microscope，×400）

表4 各組大鼠肺組織GR mRNA 和蛋白水平Tab 4 mRNA and protein expression of GR in lung tissue of rats

表4 各組大鼠肺組織GR mRNA 和蛋白水平Tab 4 mRNA and protein expression of GR in lung tissue of rats

組別空白對照組模型組高劑量中藥組中劑量中藥組低劑量中藥組n 10 98 9 8 FP GR mRNA 0.350±0.037 0.110±0.020 0.363±0.051 0.591±0.038 0.310±0.034 164.735 0.000 GR protein 305.76±23.12 112.62±9.87 386.91±40.53 678.28±50.32 360.65±30.65 276.564 0.000

3 討論

肺部和氣道慢性炎癥是COPD 的主要特征，細(xì)胞炎癥因子損傷為COPD 病情進(jìn)展的核心機(jī)制［15］，TGF-β1、蛋白酶-抗蛋白酶失衡對COPD 氣道重塑有關(guān)鍵作用［16］。有研究表明，TNF-α、TGF-β1、IL-17A 及MMP-9 表達(dá)水平高低均與COPD 損害程度呈正相關(guān)［17-20］。其中IL-17A 具有較強(qiáng)的促炎作用，是廣泛表達(dá)的前炎性細(xì)胞因子，參與炎癥細(xì)胞如TNF-α 的活化過程，并誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞氣道浸潤［21］，氣道炎癥又是引起TGF-β1 在肺內(nèi)高表達(dá)的根本原因［22］，而MMP-9 與TIMP-1 的比例是氣道組織破壞與修復(fù)平衡的標(biāo)志［23］。由此可見，有效地降低TNF-α、TGF-β1、IL-17A、MMP-9 表達(dá)水平，增加TIMP-1 的表達(dá)水平，可在一定程度上減緩COPD病情進(jìn)展。

糖皮質(zhì)激素是目前治療COPD 穩(wěn)定期患者最為廣泛使用的抗炎藥物，其抗炎作用表達(dá)需要與GR 相結(jié)合［24］。但臨床中糖皮質(zhì)激素對COPD 進(jìn)行性發(fā)展的控制效果不佳［25，26］，考慮部分COPD 患者存在糖皮質(zhì)激素抵抗可能性，提高糖皮質(zhì)激素療效成了治療COPD 的切入點(diǎn)。多項(xiàng)研究［27，28］表明中醫(yī)藥在減輕糖皮質(zhì)抵抗方面療效顯著，本研究也發(fā)現(xiàn)COPD 大鼠在加用扶肺固腎飲干預(yù)后，其肺組織中GR mRNA 及蛋白的表達(dá)較模型組升高，具有一定的提高糖皮質(zhì)激素療效的功效。

COPD 歸屬于中醫(yī)“肺脹病”，其病位在肺，可致脾腎虧虛，以痰瘀內(nèi)阻為標(biāo)，肺臟、脾臟、腎臟虧虛為本［29，30］。本研究基于“補(bǔ)肺固腎，化痰祛瘀”，采用扶肺固腎飲進(jìn)行治療。扶肺固腎飲是梁愛武教授依據(jù)多年臨床治療COPD 經(jīng)驗(yàn)以及COPD 的發(fā)病特點(diǎn)，以六君子湯合六味地黃丸加減化裁而來。方中黨參、山藥補(bǔ)肺健脾，山茱萸、生地黃可補(bǔ)益肝腎，此四味君藥共同補(bǔ)益肺腎、益氣養(yǎng)陰。茯苓、澤瀉利濕化濁，丹皮活血化瘀和瀉熱，三者形成“三瀉”之功，加白術(shù)以助茯苓健脾祛濕。陳皮、半夏、生姜化痰止咳，桔?；挡⑤d藥上行至肺，生龍骨、蘇子降氣止咳平喘，加丹參以祛瘀，大棗可健脾，炙甘草可調(diào)諸藥。治療COPD 穩(wěn)定期病人，扶肺固腎飲可達(dá)標(biāo)本兼治的效果。在本實(shí)驗(yàn)中可以觀察到COPD 大鼠模型組TNF-α、TGF-β1、IL-17A 等炎癥因子明顯升高，說明COPD 大鼠氣道炎癥反應(yīng)較為明顯。而模型組大鼠經(jīng)扶肺固腎飲干預(yù)后，炎癥因子水平較前明顯下降，同時(shí)MMP-9 表達(dá)減少，TIMP-1 表達(dá)有所增加，尤以中劑量扶肺固腎飲改善效果最佳，證實(shí)扶肺固腎飲可作用于不同途徑以降低氣道炎癥反應(yīng)及減少氣道重塑的作用，為有效的治療藥物。

綜上所述，扶肺固腎飲可以通過降低大鼠血清和肺泡灌洗液中TNF-α、TGF-β1、IL-17A 的含量，減少肺組織中MMP-9、增加TIMP-1 的表達(dá)，最終改善COPD 大鼠氣道炎癥反應(yīng)、減少氣道重塑。同時(shí)可增加肺組織中GR mRNA 及蛋白的表達(dá)，以減少糖皮質(zhì)激素抵抗從而增加糖皮質(zhì)激素療效。

本實(shí)驗(yàn)主要研究了扶肺固腎飲對慢性阻塞性肺 疾 病 大 鼠TNF-α、TGF-β1、IL-17A 及MMP-9、TIMP-1 表達(dá)及糖皮質(zhì)激素受體的影響，但具體作用靶點(diǎn)及機(jī)理未明確，大鼠氣道炎癥指標(biāo)也遠(yuǎn)不僅于此。本研究時(shí)間較短，在實(shí)驗(yàn)過程中存在誤差，可能會影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，對研究結(jié)果產(chǎn)生一定的偏倚。未來可嘗試進(jìn)一步試驗(yàn)，探討扶肺固腎飲可能的作用機(jī)理及藥物的作用靶點(diǎn)，以達(dá)到精準(zhǔn)治療，以及進(jìn)一步研究扶肺固腎飲對慢性阻塞性肺疾病大鼠其他氣道炎癥指標(biāo)表達(dá)的影響，為中醫(yī)藥有效防治慢性阻塞性肺疾病做出進(jìn)一步的貢獻(xiàn)。