徐志強(qiáng)，劉化冰，張曉兵，趙燕平，鐘永健，顧 超，李 崢

（浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，杭州 310024）

0 引言

植物氮代謝過程主要包括無機(jī)態(tài)氮的還原與同化和有機(jī)態(tài)含氮化合物的轉(zhuǎn)化、合成與分解等過程[1-2]，其中硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、谷氨酸脫氫酶(GDH)等關(guān)鍵酶活力對(duì)氮素代謝有極為重要的影響[3]。硝酸還原酶(NR)的活性高低可以直接反映出土壤中氮素的利用情況，進(jìn)而影響植物產(chǎn)量和品質(zhì)的形成[4]。谷氨酰胺合成酶(GS)及其同工酶活性在植物的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)和分配中具有重要作用[5]。谷氨酸合成酶(GOGAT)將NH4+同化為谷氨酸并進(jìn)一步參與蛋白質(zhì)、核酸代謝的過程[6]。谷氨酸脫氫酶(GDH)是生物界普遍存在的一種多聚酶，具有合成氨和脫氨的雙重功能[7]?？緹煷x過程中產(chǎn)生的煙堿、游離氨基酸等產(chǎn)物對(duì)提高煙草品質(zhì)有著重要作用。同時(shí)氮代謝也對(duì)煙葉的次生代謝產(chǎn)生影響，類胡蘿卜素和酚類化合物是煙株的主要次生代謝產(chǎn)物，同時(shí)也是煙葉的重要香氣前體物質(zhì)[7-10]。王新發(fā)等[11]研究表明不同基因型、不同氮用量處理的煙葉類胡蘿卜素含量存在差異。趙勝利[12]研究發(fā)現(xiàn)，酚類化合物總量在不同的煙草中有顯著差異，其調(diào)制后的降解產(chǎn)物，能起到增加香氣量和改善余味的作用。因此，研究不同烤煙品種氮代謝及次生代謝的差異，對(duì)煙葉品質(zhì)的提高具有重要意義。本研究分析烤煙部分香氣前體物質(zhì)的形成與氮代謝過程的內(nèi)在聯(lián)系。以期為不同烤煙品種選擇適宜的氮用量提供理論基礎(chǔ)，為田間管理措施的改進(jìn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年在浙江中煙基地單元南陽(yáng)市方城縣金葉園進(jìn)行。供試地土壤類型為黃壤，土壤pH為7.48，有機(jī)質(zhì)含量為11.45 g/kg，堿解氮含量為55.00mg/kg，速效磷含量為15.01mg/kg，速效鉀含量為135.00mg/kg。供試‘煙草’(Nicotiana tabacum L.)品種為‘NC71’、‘云煙105’、‘豫煙13號(hào)’。田間種植行距120 cm，株距55 cm，于2020年4月18日移栽，田間管理措施按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)要求進(jìn)行。

試驗(yàn)采取裂區(qū)設(shè)計(jì)，其中品種為主區(qū)，施氮量為副區(qū)。施氮量設(shè)置低氮N1(30kg/hm2)、中氮N2(45kg/hm2)、高氮N3(60 kg/hm2)3個(gè)處理。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 經(jīng)濟(jì)性狀測(cè)定 根據(jù)烤煙國(guó)標(biāo)(GB2635-1992)對(duì)烤后煙葉分級(jí)，并統(tǒng)計(jì)各處理產(chǎn)量，以2020年當(dāng)?shù)氐臒熑~收購(gòu)價(jià)格計(jì)算產(chǎn)值，統(tǒng)計(jì)各處理各等級(jí)煙葉比例，級(jí)外煙不計(jì)產(chǎn)值。

1.2.2 酶活性測(cè)定 于移栽后110天取中部葉片，采用試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）測(cè)定硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、谷氨酸脫氫酶(GDH)的活性。

1.2.3 其他生理指標(biāo)測(cè)定 游離氨基酸采用茚三酮顯色法測(cè)定，類胡蘿卜素采用96%乙醇浸提法測(cè)定，煙堿采用乙酸萃取法測(cè)定，總酚采用福林酚法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、極差法多重比較和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮量對(duì)品種經(jīng)濟(jì)性狀的影響

由表1可知，相同氮用量下產(chǎn)量、產(chǎn)值以‘云煙105’最高，‘NC71’次之，均價(jià)和中上等煙比例以‘NC71’品種最高，‘云煙105’次之，各項(xiàng)經(jīng)濟(jì)性狀均以‘豫煙13號(hào)’較低。從氮用量方面來看，‘豫煙13號(hào)’各經(jīng)濟(jì)性狀均隨氮用量的增加而減少；‘NC71’各經(jīng)濟(jì)性狀均隨氮用量的增加而增加；‘云煙105’在中氮情況各經(jīng)濟(jì)性狀達(dá)到最優(yōu)；這說明‘豫煙13號(hào)’最適氮用量最低，因此，可以認(rèn)為‘NC71’適宜氮用量最高，‘云煙105’次之，‘豫煙13號(hào)’適宜在低氮條件下種植。

表1 各品種不同氮用量條件下主要經(jīng)濟(jì)性狀的比較

2.2 不同施氮量對(duì)品種氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

由表2可知，NR、GOGAT酶活性在品種間整體表現(xiàn)為‘豫煙13號(hào)’＞‘云煙105’＞‘NC71’，GDH酶活性表現(xiàn)為‘NC71’＞‘云煙105’＞‘豫煙13號(hào)’，GS酶活性表現(xiàn)為在‘豫煙13號(hào)’＞‘NC71’＞‘云煙105’。這說明‘豫煙13號(hào)’煙葉成熟期NR、GS和GOGAT的活性較高，GDH酶活性較低，而‘云煙105’和‘NC71’則相反。

表2 各品種不同氮用量條件下氮代謝關(guān)鍵酶活性差異的比較

不同施氮量處理氮代謝關(guān)鍵酶活性也存在一定差異。NR、GS、GOGAT的活性隨施氮量的增加而升高，低氮處理的NR、GS和GOGAT的活性顯著低于中氮、高氮處理。GDH活性‘豫煙13號(hào)’、‘NC71’品種隨施氮量的增加升高，在高氮下有最大值；而‘云煙105’的GDH活性隨施氮量的增加先增加后降低，在中氮水平下有最大值。這說明GDH活性存在著品種與氮用量互作現(xiàn)象。

‘NC71’高氮水平下NR酶活性與‘豫煙13號(hào)’低氮水平下、‘云煙105’中氮水平下差異不顯著，‘NC71’高氮水平下GOGAT酶活性與‘豫煙13號(hào)’、‘云煙105’中氮水平下差異不顯著，表明‘NC71’在高氮水平下與‘豫煙13號(hào)’在中低氮水平下NR酶活性、GOGAT酶和GS酶活性相近。這說明‘NC71’氮同化和吸收的能力較弱，‘豫煙13號(hào)’較強(qiáng)，‘云煙105’居中。

由表3可知，煙葉氮代謝關(guān)鍵酶活性在不同施氮量、品種間均存在顯著性差異。說明施氮量、品種及施氮量與品種互作對(duì)煙葉氮代謝關(guān)鍵酶活性均有重要影響。NR活性中，受品種和施氮量效應(yīng)均顯著，其中以施氮量對(duì)NR活性的影響最大。GS活性中，品種、施氮量及其互作效應(yīng)影響均顯著，施氮量對(duì)GS活性貢獻(xiàn)率最大，品種次之，施氮量與品種的互作效應(yīng)最弱。GOGAT活性中，主要受施氮量影響，品種、施氮量與品種互作效應(yīng)不顯著。GDH活性中，受品種影響最大，施氮量影響次之，施氮量與品種的互作影響最小，但三者均達(dá)到了顯著差異。

表3 施氮量和品種對(duì)烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響雙因素分析

2.3 不同施氮量對(duì)品種氮代謝產(chǎn)物及次生代謝產(chǎn)物含量的影響

由表4可知，游離氨基酸含量、類胡蘿卜素含量在不同品種間整體表現(xiàn)為‘豫煙13號(hào)’＞‘云煙105’＞‘NC71’。煙堿含量、總酚含量在3個(gè)品種間也存在差異，整體表現(xiàn)為‘豫煙13號(hào)’＞‘NC71’＞‘云煙105’。這說明‘豫煙13號(hào)’煙葉成熟期游離氨基酸、類胡蘿卜素、煙堿、總酚的含量較高，其余2個(gè)品種的含量相對(duì)較低。

表4 各品種不同氮用量條件下氮代謝產(chǎn)物及次生代謝產(chǎn)物含量差異的比較

不同施氮量處理的氮代謝及次生代謝產(chǎn)物含量也存在一定差異。游離氨基酸、煙堿含量隨施氮量增加而增加。類胡蘿卜素含量‘豫煙13號(hào)’、‘云煙105’隨施氮量增加而增加，在高氮下有最大值；而‘NC71’的類胡蘿卜素含量隨施氮量的增加先增加后降低，在中氮水平下有最大值?！茻?105’、‘NC71’的總酚含量隨施氮量增加而增加，在高氮下有最大值；‘豫煙13號(hào)’的總酚含量隨施氮量增加呈先漲后降的趨勢(shì)，在中氮水平下有最大值。這說明類胡蘿卜素、總酚的含量存在品種與氮用量互作現(xiàn)象。

‘NC71’高氮水平下游離氨基酸、總酚的含量與‘豫煙13號(hào)’低氮水平下‘、云煙105’中氮水平下差異不顯著‘；NC71’高氮水平下煙堿含量顯著低于‘豫煙13號(hào)’低氮水平下煙堿的含量，類胡蘿卜素含量顯著低于‘豫煙13號(hào)’低氮水平下‘、云煙105’中氮水平下的類胡蘿卜素含量，這說明‘NC71’需要在高氮處理下煙株才能保持較好的次生代謝，而‘豫煙13號(hào)’在低氮水平下煙株就可以保持較好的次生代謝‘，云煙105’在中氮處理下可以保持較好的次生代謝。

方差分析結(jié)果如表5所示，烤煙氮代謝產(chǎn)物及次生代謝產(chǎn)物在不同施氮量、品種間均存在顯著差異，品種與施氮量的互作對(duì)產(chǎn)物含量也有影響。不同施氮量處理游離氨基酸含量差異顯著，而不同品種間差異不顯著。煙堿含量受品種、施氮量及其互作效應(yīng)的影響，且都達(dá)到了顯著水平，其中品種對(duì)煙堿含量影響最大，施氮量次之，品種與施氮量的互作效應(yīng)影響最小。類胡蘿卜素含量的品種效應(yīng)、施氮量效應(yīng)顯著，其中品種對(duì)類胡蘿卜素含量貢獻(xiàn)率更大?？偡雍吭谄贩N間、施氮量間都達(dá)到了顯著差異水平，其中品種對(duì)總酚含量影響最大，施氮量次之。

表5 比較施氮量和品種對(duì)氮代謝產(chǎn)物及次生代謝產(chǎn)物含量的影響雙因素分析

2.4 烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性與其次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)分析

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明（表6），NR與類胡蘿卜素呈極顯著正相關(guān)，與游離氨基酸、煙堿和總酚均呈顯著正相關(guān)；GS與游離氨基酸、煙堿、類胡蘿卜素和總酚均呈顯著正相關(guān)；GOGAT與游離氨基酸和類胡蘿卜素呈顯著正相關(guān)；GDH與游離氨基酸、煙堿、類胡蘿卜素和總酚的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平。

表6 烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性與其次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)分析

3 討論與結(jié)論

烤煙吸收的氮素主要以硝態(tài)氮為主[13]，試驗(yàn)結(jié)果表明，隨施氮量增加，硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)活性均提高，與岳紅賓[14]、高琴等[15]研究結(jié)果相同，表明植株吸收、同化、再同化氮素能力與施氮水平呈正相關(guān)。本試驗(yàn)在煙葉成熟期取樣，谷氨酸脫氫酶(GDH)表現(xiàn)為脫氨作用，與前人研究結(jié)果一致[16-17]。隨施氮量增加，不同品種的類胡蘿卜素含量增加，本試驗(yàn)結(jié)果與王新發(fā)[18]、史宏志等[19]、李飛[20]的研究結(jié)果相同。游離氨基酸、煙堿等氮代謝產(chǎn)物含量隨著施氮水平的提高而增加[21-22]，表明氮代謝強(qiáng)弱與施氮量呈正相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，氮代謝關(guān)鍵酶活性與其次生代謝產(chǎn)物有一定的相關(guān)關(guān)系，其中，硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)與游離氨基酸、煙堿、類胡蘿卜素和總酚均呈顯著或極顯著正相關(guān)，表明NR、GS對(duì)氮代謝次生代謝產(chǎn)物含量影響較大，酶活性的改變會(huì)影響氮代謝次生代謝產(chǎn)物的含量，進(jìn)而達(dá)到改善煙葉內(nèi)在品質(zhì)的目的。

同時(shí)，不同品種間氮代謝特性差異較大[23-24]，煙株葉片中的氮代謝產(chǎn)物也在一定程度上表現(xiàn)了不同品種氮吸收、同化的差異。‘豫煙13號(hào)’在成熟期NR、GS、GOGAT活性較高，GDH活性較低，表明其吸收、同化氮素能力仍較強(qiáng)?！甆C71’在成熟期，NR、GOGAT活性較弱，GDH活性較強(qiáng)，表明吸收、再同化氮素能力弱，氮素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解量較大，此研究結(jié)果與周健飛等[22]的研究相同?！茻?05’氮代謝特征介于兩者之間。本研究表明，總酚含量在不同品種間存在差異，‘云煙105’與‘NC71’的總酚含量均隨著施氮量增加呈增長(zhǎng)趨勢(shì)?！?3號(hào)’的總酚含量在中氮處理下達(dá)到最大值。品種間類胡蘿卜素含量整體表現(xiàn)為‘豫煙13號(hào)’＞‘云煙105’＞‘NC71’，總酚含量整體表現(xiàn)為‘豫煙13號(hào)’＞‘NC71’＞‘云煙105’，與氮代謝相關(guān)酶活性變化規(guī)律基本一致。

綜上所述，成熟期氮代謝強(qiáng)弱和次生代謝產(chǎn)物含量與施氮量正相關(guān)，改變NR、GS活性會(huì)影響氮代謝次生代謝產(chǎn)物含量?！甆C71’在成熟期吸收、再同化氮素能力弱，高氮（施氮60 kg/hm2）處理下，有利于氮代謝及其次生代謝的積累，從而有助于烤煙部分香氣前體物質(zhì)的形成，進(jìn)而改善煙葉香氣質(zhì)量、提高煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)‘。豫煙13號(hào)’在低氮（施氮30 kg/hm2）處理下‘，云煙105’在中氮（施氮45 kg/hm2）處理下表現(xiàn)最優(yōu)。