李棟，宋佳寶，牟德華

（河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018）

核桃仁富含油脂、蛋白質(zhì)、糖類和維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有極高的開發(fā)利用價(jià)值。核桃仁加工制成的核桃乳色澤乳白、香味濃郁，是一種新型的營(yíng)養(yǎng)飲料[1]。核桃仁對(duì)于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病、美容、抗衰老等起著重要作用[2]。乳酸菌是一類能發(fā)酵糖產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的總稱[3]，研究表明，乳酸菌及發(fā)酵產(chǎn)物能提高免疫力[4]，維持腸道菌群平衡[5]，降低膽固醇含量，并對(duì)胃病、糖尿病和心血管疾病等[6]有一定預(yù)防作用。乳酸菌能夠降解核桃乳中的蛋白質(zhì)，使制品的風(fēng)味更加醇厚。發(fā)酵核桃乳中含有對(duì)人體有益的乳酸菌，具有腸道保健功能[7-8]，豐富了市場(chǎng)上植物蛋白飲料的品種[9]。近年來(lái)，有關(guān)乳酸菌[10-12]發(fā)酵植物蛋白飲料的研究成為熱門，在現(xiàn)有發(fā)酵核桃乳[13-15]的研制工藝中，許多學(xué)者在發(fā)酵基料中加入了牛奶、乳清粉等動(dòng)物蛋白以促進(jìn)益生菌發(fā)酵[16]，或直接以脫脂核桃粕為原料[17-18]，對(duì)發(fā)酵過程中的工藝參數(shù)進(jìn)行了探究，并對(duì)發(fā)酵核桃乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行了初步探究。本研究采用河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院飲料酒釀造研究室分離篩選出的乳酸菌（植物乳桿菌亞種KDLLL1-1和意大利腸球菌KDLLJ3-1）發(fā)酵核桃乳，以核桃乳飲料酸度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究乳酸菌發(fā)酵核桃乳飲料的最佳工藝條件，為發(fā)酵核桃乳飲料工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 乳酸菌

植物乳桿菌亞種（Lactobacillus plantarum subsp.）KDLLL1-1、意大利腸球菌（Enterococcus italica）KDLLJ3-1：河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院飲料酒釀造研究室分別從羊羔美酒大曲和開菲爾粒中分離篩選得到，經(jīng)過重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)和16S rDNA序列分析得到基因序列，在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登陸，經(jīng)BLAST相似性比對(duì)確定屬種，登錄號(hào)分別為KC454277和KJ890357。

核桃乳：河北綠嶺康維食品有限公司。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母提取物、瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；牛肉膏、MgSO4·7H2O：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；葡萄糖：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；CH3COONa·3H2O：天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司；K2HPO4·3H2O、H2MnO5S：天津市永大化學(xué)試劑廠；C6H8O7·3H3N：天津市百世化工有限公司；吐溫80：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；NaOH：天津市大陸化學(xué)試劑廠；酚酞：天津市大茂化學(xué)試劑廠。所有化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

DH300電熱恒溫培養(yǎng)箱、DK-98-11電子調(diào)溫萬(wàn)用電爐：天津市泰斯特儀器有限公司；B1-220A麥克奧迪顯微鏡：Motic實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；PL203電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Delta320 pH計(jì)：深圳市凱銘杰儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-1FDA超凈工作臺(tái)：北京華威中儀科技有限公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋：河南省鞏義市英峪予華儀器廠；LC-20A高效液相色譜儀、RID-10A紫外檢測(cè)器、LC-20ATA/B串聯(lián)泵：日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵核桃乳酸度的測(cè)定

采用酚酞指示劑法進(jìn)行酸度測(cè)定，具體參照GB 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》。

1.2.2 發(fā)酵核桃乳飲料單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 碳源種類的選擇

以發(fā)酵核桃乳酸度為指標(biāo)，將乳清粉、蔗糖分別按20 g/L的添加量加入到核桃乳中，按照植物乳桿菌亞種：意大利腸球菌=2∶1（菌懸液體積比），接種量9%，34℃發(fā)酵18 h。同時(shí)以不添加碳源（以水替代）作為對(duì)照，考察碳源種類對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響。

1.2.2.2 碳源添加量的選擇

以乳酸菌接種量9%，34℃發(fā)酵10 h，考察碳源添加量（5、10、20、30、40 g/L）對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響。

1.2.2.3 乳酸菌接種量的選擇

以碳源添加量20 g/L，34℃發(fā)酵10 h，考察乳酸菌接種量（5%、7%、9%、11%、13%）對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響。

1.2.2.4 發(fā)酵溫度的選擇

以乳酸菌接種量9%和碳源添加量20 g/L，發(fā)酵10 h，考察發(fā)酵溫度（28、31、34、37、40 ℃）對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度、碳源添加量為3個(gè)考察因素，發(fā)酵核桃乳酸度為考察指標(biāo)，利用Design-Expertv8.0.6.1軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面分析和優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 The factor and level of response surface test

1.2.4 發(fā)酵核桃乳的感官評(píng)價(jià)

由10名經(jīng)過訓(xùn)練具有感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的人員對(duì)發(fā)酵核桃乳進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果取平均值。發(fā)酵核桃乳感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 發(fā)酵核桃乳感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory scoring standards for fermented walnut milk

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均做3個(gè)平行，取平均值，利用Origin8.5軟件作圖，通過SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源種類對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響

碳源種類對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響結(jié)果見圖1。

圖1 碳源種類對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響Fig.1 The effect of carbon source types on the acid degree of fermented walnuts

由圖1可見，未添加碳源和添加蔗糖時(shí)發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)酸效果較差，相比之下，添加乳清粉時(shí)乳酸菌產(chǎn)酸效果明顯，乳清粉與蔗糖相比含有更多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)和一些小分子物質(zhì)。從工業(yè)化生產(chǎn)角度考慮，乳清粉價(jià)格比較低廉，所以最終選取乳清粉為碳源。

2.1.2 碳源添加量對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響

碳源添加量對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同碳源添加量對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響Fig.2 The effect of different carbon sources addition on the acid degree of fermented walnuts

如圖2所示，碳源添加量在5 g/L～40 g/L范圍內(nèi)，發(fā)酵核桃乳酸度隨著碳源添加量的增加先上升后下降，其原因可能是由于碳源添加量過大時(shí)抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致發(fā)酵過程受到了影響，發(fā)酵核桃乳酸度下降，最佳碳源添加量為30 g/L。

2.1.3 乳酸菌接種量對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響

乳酸菌接種量對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響結(jié)果見圖3。

圖3 乳酸菌接種量對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響Fig.3 Effect of lactic acid bacteria inoculation amount on the acid degree of fermented walnuts

如圖3所示，當(dāng)乳酸菌接種量低于11%時(shí)，隨乳酸菌接種量的提高，發(fā)酵核桃乳酸度逐漸增大。當(dāng)乳酸菌接種量高于11%時(shí)，菌種發(fā)酵產(chǎn)酸的效果變差，發(fā)酵核桃乳中酸含量下降，可能的原因是乳酸菌接種量過大，導(dǎo)致乳酸菌大量生長(zhǎng)繁殖，不利于發(fā)酵，從而導(dǎo)致最終酸度有所降低。綜上，發(fā)酵核桃乳的最佳乳酸菌接種量為11%。

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響

發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度的影響Fig.4 The influence of fermentation temperature on the acid degree of fermented walnuts

發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵核桃乳起到關(guān)鍵性作用。如圖4所示，在37℃以下，隨發(fā)酵溫度升高發(fā)酵核桃乳酸度增大，當(dāng)發(fā)酵溫度超過37℃時(shí)，發(fā)酵核桃乳酸度會(huì)隨發(fā)酵溫度升高而降低，因此最適宜的發(fā)酵溫度為37℃。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)法優(yōu)化核桃乳發(fā)酵工藝條件

發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Box-Behnken test design and results of optimization of fermentation conditions

表4 以酸度為響應(yīng)值的回歸模型及方差分析Table 4 Regression model and analysis of variance with acidity as the response value

采用Design-Expert v8.0.6.1統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表4結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，建立二次回歸方程：Y=36.87-0.18A+0.27B+0.42C-0.20AB+0.45AC+0.0001BC-1.29A2-1.23B2-2.90C2。

由表 4 可知，該模型 P＜0.05；失擬誤差 P＞0.05，即回歸模型顯著而失擬項(xiàng)不顯著，說明發(fā)酵核桃乳酸度與各因素的回歸模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方程的決定系數(shù)R2=0.851 3，擬合度良好，方程的顯著性及可靠性較高。根據(jù)F值大小可知，各因素對(duì)發(fā)酵核桃乳酸度影響的主次因素為C＞B＞A，即碳源添加量＞發(fā)酵溫度＞乳酸菌接種量。

通過軟件進(jìn)行分析得出最佳工藝條件為乳酸菌接種量10.86%，發(fā)酵溫度37.34℃，碳源添加量30.7 g/L。在此條件下，發(fā)酵核桃乳酸度預(yù)測(cè)值為36.91°T。考慮到試驗(yàn)的可操作性，修正最佳工藝條件為乳酸菌接種量11%，發(fā)酵溫度37℃，碳源添加量30 g/L。在此條件下，自選乳酸菌發(fā)酵核桃乳飲料酸度達(dá)到36.53°T，與預(yù)測(cè)值接近。說明模型擬合性良好，驗(yàn)證了模型的有效性。

2.3 發(fā)酵核桃乳飲料感官評(píng)價(jià)

發(fā)酵核桃乳飲料的感官評(píng)價(jià)結(jié)果見表5。

由表5可知，發(fā)酵后的核桃乳，色澤呈現(xiàn)乳白色和淡黃色，氣味較未發(fā)酵之前有明顯的核桃乳發(fā)酵香氣，口感細(xì)膩、酸甜適度，可被大部分感官評(píng)價(jià)者所接受。經(jīng)最佳工藝處理后，發(fā)酵核桃乳飲料的組織形態(tài)均勻、無(wú)分層，感官評(píng)分為84。

表5 發(fā)酵核桃乳的感官評(píng)價(jià)Table 5 Sensory evaluation of fermented walnut milk

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，通過響應(yīng)面分析確定自選乳酸菌發(fā)酵核桃乳最佳工藝條件：碳源選擇乳清粉，添加量為30 g/L，自選植物乳桿菌亞種 KDLLL1-1和意大利腸球菌KDLLJ3-1按照2∶1體積比，接種量為11%，37℃發(fā)酵10 h，所得發(fā)酵核桃乳飲料酸度為36.53°T，乳白色，細(xì)膩、均勻，核桃乳發(fā)酵香氣獨(dú)特，酸甜適度。