張雯雯，張艷妮，楊麗榮，張宏博，段艷，郭文瑞

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢驗檢測中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

肉品因富含脂肪、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，易發(fā)生氧化，嚴(yán)重影響其色澤、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味及營養(yǎng)價值，進而造成經(jīng)濟損失。近些年來，市場上抗氧化劑的使用越來越多，但經(jīng)研究證明，常用的合成抗氧化劑可誘發(fā)腸胃病，甚至是導(dǎo)致癌癥，天然抗氧化物相對安全性較高，因此深受廣大消費者的青睞[1]。目前，常用的天然抗氧化劑有多酚、維生素、多糖、皂苷四大類，其中多酚類抗氧化物研究較多，主要因其苯環(huán)上連接的多羥基結(jié)構(gòu)經(jīng)相關(guān)反應(yīng)后發(fā)揮抗氧化作用，如茶多酚、單寧等[2]。常用的維生素類抗氧化劑如維生素E（vitamin E，VE）、維生素C（vitamin C，VC），通過與其他物質(zhì)的相互作用及相關(guān)基因調(diào)控脂類代謝[3]。蝦青素是一種類胡蘿卜素，存在于各種海洋生物中，它是一種生物抗氧化劑，比維生素E和其他類胡蘿卜素具有更強的自由基清除活性[4]。皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，皂苷主要通過清除自由基、減少細(xì)胞損傷、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激等機制達到抗氧化的效果[5]。多糖是超過10個單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，多糖的抗氧化作用主要體現(xiàn)在提高機體抗氧化酶活性、清除體內(nèi)自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、保護生物膜等方面[3-6]。

目前，天然抗氧化物的研究已經(jīng)比較深入，越來越多研究者通過研究抗氧化物的抗氧化能力，以期將其聯(lián)合使用，從而使其各有效成分通過多靶點、多環(huán)節(jié)綜合發(fā)揮其功效。經(jīng)陳雪[7]研究，在對DPPH自由基的清除能力測定中，南瓜多糖和人參皂苷復(fù)配物要強于單一組。本試驗選擇具有多酚結(jié)構(gòu)的單寧、人參皂苷、枸杞多糖、蝦青素等4種天然抗氧化物在不同濃度下對DPPH、ABTS+、羥基、超氧陰離子等自由基清除能力、金屬離子螯合能力、總還原能力、脂質(zhì)抗氧化能力的影響，為天然抗氧化劑的復(fù)配應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單寧提取物（純度99%）、人參皂苷提取物（純度80%）、枸杞多糖提取物（純度50%）、蝦青素提取物（純度10%）：西安瑞林生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-偶氮二（2-甲基丙基醚）二鹽酸鹽[2，2'-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH]、2，2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、羅恩試劑、硫酸亞鐵、30%過氧化氫（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、VC、鄰二氮菲（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；2-硫代巴比妥酸（分析純）：上?？曝S實業(yè)有限公司；鄰苯三酚（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SYNERGY H 1酶標(biāo)儀（96孔板）：雷康恒泰（北京）商貿(mào)有限公司；DHP-9802電熱恒溫水浴鍋：北京長安科學(xué)儀器廠；AL204萬分之一電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；JC-HW-2渦旋振蕩器：北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

單寧、人參皂苷、枸杞多糖、蝦青素分別配制濃度為 5 mg/mL 的溶液，并分別稀釋為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，作為待測樣品備用。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

參考Kop等[8]的研究方法，取4 g DPPH用無水乙醇定容至100 mL容量瓶內(nèi)，配制濃度為0.04 mg/mL的DPPH溶液避光放置備用；取0.1 mL樣品加入到新配制的3.9 mL DPPH溶液中，混勻，在37℃水浴條件下反應(yīng)60 min，在517 nm處測吸光度，計算公式如下。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A3]×100

式中：A1為3.9 mL DPPH+0.1 mL樣品的吸光度；A2為3.9 mL乙醇+0.1 mL樣品的吸光度；A3為3.9 mL DPPH+0.1 mL乙醇的吸光度。

1.3.3 ABTS+自由基清除能力的測定

參考孫玉姣等[9]的研究方法，取同等體積的7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L K2S2O8溶液，置于100 mL棕色廣口瓶中，混合均勻，于室溫（20℃）靜置12 h～16 h，再用無水乙醇稀釋45倍作ABTS工作液（OD734nm=0.7±0.02）備用。取 0.2 mL 樣品，加入到 0.8 mL ABTS溶液中，振蕩10 s，充分混合后避光靜置6 min，在734 nm處測吸光度為A1，以0.2 mL乙醇代替樣品為空白組，測得吸光度A0，計算公式如下。

ABTS+自由基清除率/%=（1-A1/A0）×100

1.3.4 羥基自由基清除能力的測定

參考王賀等[10]的方法，取樣品2 mL，加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）（pH7.4），混勻再加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1 mL 0.01%過氧化氫溶液，混勻后在37℃水浴1 h，在536 nm處測吸光度，對照組用蒸餾水代替過氧化氫溶液，空白組用蒸餾水代替樣品，計算公式如下。

羥基自由基清除率/%=（As－Ac）/（Ab－Ac）

式中：As為試驗樣品的吸光度；Ac為對照組的吸光度；Ab為空白組的吸光度。

1.3.5 超氧陰離子自由基清除能力的測定

參考王雅等[11]的研究方法，取2 mL樣品、4 mL 0.05 mol/L Tris-HCl溶液（pH8.2），在25℃水浴加熱20 min；取出后加入60 μL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，充分混勻在25℃水浴加熱5 min；取出后加入200 μL 10 mmol/L鹽酸溶液，終止反應(yīng)，在325 nm處測吸光度。

超氧陰離子自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A3]×100

式中：A1為60 μL鄰苯三酚+2 mL樣品的吸光度；A2為 60 μL 蒸餾水+2 mL 樣品的吸光度；A3為 60 μL鄰苯三酚+2 mL蒸餾水的吸光度。

1.3.6 金屬離子螯合能力

參考齊佳慧等[12]的研究方法，取0.5mL樣品、0.1mL 10g/LVC溶液、0.1mL4g/L硫酸亞鐵溶液、1mL0.2mol/L氫氧化鈉溶液，混勻后，在37℃水浴靜置20 min；取出后，加入0.2 mL 10%三氯乙酸溶液，靜置10 min，再取0.2 mL上清液，加0.5 mL 1 g/L鄰二氮菲溶液，充分混勻，靜置10 min，在510 nm處測吸光度。用0.5 mL蒸餾水做空白對照，計算公式如下。

金屬離子螯合能力/%=（1-As/Ac）×100

式中：As為樣品的吸光度；Ac為空白樣的吸光度。

1.3.7 總還原能力

參考齊佳慧等[12]的研究方法，將15.2 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液和0.68g磷酸二氫鉀混勻后定容至100mL，配制成0.2 mol/L pH6.6的磷酸緩沖鹽溶液。取0.5 mL不同濃度樣品，加入1 mL PBS緩沖液、1 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻后，在50℃水浴加熱20 min；取出后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液充分混勻，終止反應(yīng)；取1 mL上清液、1 mL蒸餾水、1 mL 0.15%三氯化鐵溶液，混勻后，靜置20 min；在700 nm處測量吸光度，蒸餾水做空白試驗。

總還原能力=A1-A0

式中：A1為樣品的吸光度；A0為空白樣的吸光度。

1.3.8 脂質(zhì)抗氧化能力

參考孫玉姣等[9]的研究方法，取0.4 mL 10%蛋黃勻漿液，加入0.2 mL樣品，再加入0.2 mL 40 mmol/L AAPH，混勻，37℃溫浴1 h，再加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，1 mL 0.67%β-硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）溶液，100μL2mol/L鹽酸，2mL 0.1 mol/L PBS（pH7.4），混勻，95℃水浴 30 min，立即放入冰水浴，冷卻，5 000 r/min離心15 min，取上清液，于532 nm處測吸光度，用蒸餾水做空白試驗。

脂質(zhì)抗氧化能力/%=（1-A1/A0）×100

式中：A1為樣品的吸光度；A0為空白樣的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用spss18.0進行平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及主成分分析，采用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除能力

4種天然抗氧化劑DPPH自由基清除能力的變化見圖1。

圖1 4種天然抗氧化劑DPPH自由基清除能力的變化Fig.1 Changes in DPPH free radical scavenging ability of four natural antioxidants

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，可表示對羥基、烷基及過氧化自由基抑制作用[13]。如圖1所示，單寧濃度在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL時，對DPPH自由基清除能力在90%以上且隨著濃度的增加變化不大，較高于其它3種抗氧化物，可能是由于單寧為多酚類物質(zhì)，可以更快地從酚或酚陰離子轉(zhuǎn)移電子到DPPH自由基，形成較強的氫鍵[14]。蝦青素、人參皂苷的DPPH自由基清除能力均隨濃度增高呈上升趨勢，枸杞多糖與人參皂苷在0.4 mg/mL～1.0 mg/mL濃度時，DPPH自由基清除能力差異不明顯，清除能力均在18%～34%之間。結(jié)果表明，4種天然抗氧化劑皆對DPPH自由基有清除作用，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL時，單寧清除能力較高。

2.2 ABTS+自由基清除能力

ABTS+自由基清除試驗是測定化合物抗氧化能力的重要方法[15]。4種天然抗氧化劑ABTS+自由基清除能力的變化如圖2所示，

圖2 4種天然抗氧化劑ABTS+自由基清除能力的變化Fig.2 Changes in the ABTS+free radical scavenging ability of four natural antioxidants

單寧濃度在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL時，對ABTS+自由基清除能力在81%～86%，變化不明顯，0.6 mg/mL～1.0 mg/mL時人參皂苷的ABTS+自由基清除能力與單寧相近，濃度在 0.2 mg/mL～1.0 mg/mL，單寧的 ABTS+自由基清除能力高于蝦青素組。劉曉培[16]的研究表明單寧純化物具有較強的ABTS+自由基清除能力。人參皂苷及枸杞多糖的ABTS+自由基清除能力隨著濃度的增加呈上升趨勢，單寧濃度在0.2 mg/mL～0.8 mg/mL時，對ABTS+自由基清除能力隨著濃度的增長而上升，蝦青素與枸杞多糖的ABTS+自由基清除能力無明顯差異。結(jié)果表明，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL之間4種天然抗氧化劑的ABTS+自由基清除能力為單寧優(yōu)于其他3種。

2.3 羥基自由基清除能力

4種天然抗氧化劑羥基自由基清除能力的變化見圖3。

圖3 4種天然抗氧化劑羥基自由基清除能力的變化Fig.3 Changes in the scavenging ability of four natural antioxidant hydroxyl radicals

羥基自由基是活性氧中最活潑的氧自由基[17]，也是毒性最大的自由基，是造成生物體損傷的主要因素[18]。如圖3所示，在0.2 mg/mL～0.6 mg/mL之間的枸杞多糖清除羥基自由基的能力較高于蝦青素和人參皂苷，而蝦青素、單寧的羥基自由基清除能力無明顯差異，根據(jù)張麗等[19]研究，枸杞多糖具有較強的羥基自由基清除能力。在濃度為0.8 mg/mL時，4種抗氧化物差異不明顯。在樣品濃度為1.0 mg/mL時，人參皂苷的羥基自由基清除能力為75.70%，大于其他3種。根據(jù)張馨妍等[20]的研究結(jié)果顯示在西洋參總皂苷提取出的6種人參皂苷皆有較強的羥基自由基清除能力。結(jié)果表明，0.2 mg/mL～0.6 mg/mL的枸杞多糖及1.0 mg/mL的人參皂苷具有較好的清除羥基自由基的能力。

2.4 超氧陰離子自由基清除能力

4種天然抗氧化劑超氧陰離子自由基清除能力的變化見圖4。

圖4 4種天然抗氧化劑超氧陰離子自由基清除能力的變化Fig.4 Changes in superoxide radical scavenging ability of four natural antioxidants

超氧陰離子自由基是機體內(nèi)壽命最長的自由基，通常作為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)劑，產(chǎn)生活性更強的自由基[21]。如圖4所示，濃度在0.4 mg/mL～1.0 mg/mL，人參皂苷對超氧自由基的清除能力高于單寧、枸杞多糖和蝦青素，且濃度增大清除能力呈增長趨勢，即有一定的計量效應(yīng)。黃文靜等[22]、楊炳偉[23]的研究表明皂苷類對超氧陰離子自由基具有較強的清除能力。單寧、蝦青素以及枸杞多糖的超氧陰離子自由基清除能力無明顯差異。結(jié)果表明，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL間人參皂苷對超氧陰離子自由基的清除能力較強。

2.5 總還原能力

4種天然抗氧化劑總還原能力的變化見圖5。

圖5 4種天然抗氧化劑總還原能力的變化Fig.5 Changes in total reducing power of four natural antioxidants

如圖5所示，單寧的總還原能力與其濃度呈正比，具有一定的劑量依賴性，在0.4 mg/mL～1.0 mg/mL，單寧的總還原能力高于枸杞多糖、人參皂苷、蝦青素，根據(jù)Zargar等[24]研究，提取于金合歡、尤金妮亞、菩提樹、銀合歡、番石榴等植物樹葉的單寧具有較強的還原性。而枸杞多糖的總還原能力又高于人參皂苷和蝦青素，人參皂苷和蝦青素的總還原能力無明顯差異。結(jié)果表明，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL 4種天然抗氧化物的總還原能力：單寧優(yōu)于枸杞多糖及人參皂苷、蝦青素。

2.6 金屬離子螯合能力

4種天然抗氧化劑金屬離子螯合能力的變化見圖6。

圖6 4種天然抗氧化劑金屬離子螯合能力的變化Fig.6 Changes in metal ion chelating ability of four natural antioxidants

金屬離子在有機體內(nèi)具有多樣的配位作用和重要的催化作用，當(dāng)金屬離子與有機配體形成穩(wěn)定的螯合物后，螯合物可以發(fā)揮獨特的生理生化功能[25]。單寧是一種水溶性的多羥基物質(zhì)，對金屬具有較強的螯合作用[26]。如圖6所示，通過對4種天然抗氧化劑金屬離子螯合能力分析，隨濃度升高4種抗氧化劑螯合金屬離子能力均呈上升趨勢。濃度在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL時，單寧金屬離子螯合能力在76%～85%之間，高于枸杞多糖、人參皂苷、蝦青素。人參皂苷金屬離子螯合能力在50%～62%，高于蝦青素和枸杞多糖。蝦青素的螯合能力與枸杞多糖無明顯差異。結(jié)果表明，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL間4種天然抗氧化物的金屬離子鏊合能力：單寧優(yōu)于人參皂苷、蝦青素及枸杞多糖。

2.7 脂質(zhì)抗氧化能力

4種天然抗氧化劑脂質(zhì)抗氧化劑能力的變化見圖7。

圖7 4種天然抗氧化劑脂質(zhì)抗氧化能力的變化Fig.7 Changes in lipid antioxidant capacity of four natural antioxidants

自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化并產(chǎn)生丙二醛，丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合形成粉紅色復(fù)合物，該復(fù)合物在532 nm處有最大吸收峰，當(dāng)體系加入抗氧化劑后將使該復(fù)合物顏色減弱，進而采用分光光度計測定該抗氧化劑的活性[27]。如圖7所示，4種抗氧化物皆隨其濃度增高脂質(zhì)抗氧化能力呈上升趨勢，濃度在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL，單寧脂質(zhì)抗氧化能力較強且具有良好的量效關(guān)系，優(yōu)于枸杞多糖、人參皂苷及蝦青素。結(jié)果表明，在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL 4種天然抗氧化物的脂質(zhì)抗氧化能力：單寧＞枸杞多糖＞人參皂苷＞蝦青素。

2.8 4種天然抗氧化物抗氧化作用主成分分析

為探究4種天然抗氧化物的DPPH自由基、ABTS+自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基、總還原能力、金屬離子螯合能力對抗氧化性貢獻差異及其影響作用大小，得到4種天然抗氧化劑主成分特征值、貢獻率和累積貢獻率，如表1所示。成分得分系數(shù)反映抗氧化各指標(biāo)對主成分影響的相對大小和方向，數(shù)值反映原變量對因子影響的大小，正負(fù)代表變化方向的差別。4種天然抗氧化物成分得分系數(shù)矩陣見表2。

表1 4種天然抗氧化主成分特征值及貢獻率Table 1 Characteristic values and contribution rates of the four natural antioxidant main components

表2 4種天然抗氧化物成分得分系數(shù)矩陣Table 2 Matrix of score coefficients of four natural antioxidants

主成分分析（principal component analysis，PCA）目的在于利用原變量間相關(guān)性較強的特點，用較少的指標(biāo)盡可能多地反映原數(shù)據(jù)信息，且所含信息互不重復(fù)，具有更優(yōu)越的性能[28]。主成分分析中貢獻率越大，說明主成分所包含的原始變量信息越強。單寧的特征值在1以上的一個成分為主成分，貢獻率為89.285%。枸杞多糖特征值在1以上的兩個成分為主成分，累計貢獻率是92.886%，人參皂苷特征值在1以上的1個成分為主成分，貢獻率為92.508%；蝦青素特征值在1以上的1個成分為主成分，貢獻率為93.912%，皆能較好地代表原始數(shù)據(jù)所反映的信息，符合主成分分析要求。

由表2可知，單寧抗氧化性主成分1其因子得分系數(shù)在0.16以上，其中DPPH自由基清除能力，ABTS+自由基清除能力，總還原能力，金屬離子螯合能力相對較高。枸杞多糖主成分1各因子的得分系數(shù)最高的是DPPH自由基，主成分2影響最高的因子是羥基自由基。人參皂苷及蝦青素都只有一個主成分，且各指標(biāo)相關(guān)程度很高，說明這一個主成分可以很好地反映抗氧化能力測定結(jié)果。人參皂苷抗氧化性影響最高的是超氧自由基清除能力。蝦青素的抗氧化性各因子得分系數(shù)最高的是DPPH自由基清除能力。主成分分析結(jié)果與不同濃度下各天然物質(zhì)的各抗氧化指標(biāo)研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

經(jīng)不同物質(zhì)在不同濃度下抗氧化活性分析，單寧的ABTS+、DPPH自由基清除能力最強。枸杞多糖及1.0 mg/mL的人參皂苷具有良好的清除羥基自由基的能力。人參皂苷對超氧陰離子自由基的清除能力較強。單寧的總還原能力較強，枸杞多糖次之。單寧螯合金屬離子能力較強，人參皂苷次之。4種天然抗氧化劑對脂質(zhì)抗氧化能力由強到弱為單寧、枸杞多糖、人參皂苷、蝦青素。經(jīng)主成分分析，單寧的DPPH自由基清除能力較好。蝦青素的DPPH自由基清除能力較好，人參皂苷的超氧陰離子自由基清除能力較好，枸杞多糖的羥基自由基清除能力及總還原能力較好。