周雨蕾，李曉芳，侯溫甫，王宏勛，周敏

（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

沙門(mén)氏菌（Salmonella）是一種重要的、血清型繁多的食源性致病菌[1-2]，是全球?qū)е率澄镏卸镜淖畛Ｒ?jiàn)的致病病原體之一，主要污染包括動(dòng)物源生鮮食品如雞蛋、雞肉、畜制品[3]及蔬菜。由于不適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存、烹調(diào)或交叉污染，沙門(mén)氏菌可以在設(shè)備表面及某些食品中存活并繁殖達(dá)到引起人類(lèi)疾病的水平[4]。每年約3億人次因感染沙門(mén)氏菌而患病，給食品安全和消費(fèi)者健康帶來(lái)嚴(yán)重危害[5,6]。近年來(lái)，沙門(mén)氏菌的耐藥性極其嚴(yán)峻，耐受的抗菌藥物也呈現(xiàn)多樣化[7]，多重耐藥菌株正在源源不斷出現(xiàn)。除自身基因突變，細(xì)菌可通過(guò)抗生素耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移從外部獲得抗性，這也是臨床耐藥菌株產(chǎn)生的重要途徑[3]。

整合子是一種可移動(dòng)的DNA元件，包含一個(gè)能夠整合和表達(dá)耐藥基因的特異重組系統(tǒng)，并將耐藥基因從一種細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一種細(xì)菌，從而導(dǎo)致耐藥基因的傳播[8-9]。Ⅰ類(lèi)整合子是目前最常見(jiàn)且研究最多的整合子[10]，常因嵌入到質(zhì)?；蛘咿D(zhuǎn)座子以促進(jìn)自身在細(xì)菌中的擴(kuò)散[11]，其攜帶的多種耐藥基因盒類(lèi)型正在不斷增加[12]。插入序列（ISs）是一類(lèi)最短的可移動(dòng)元件，能插入到基因組一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)[13]，并可以轉(zhuǎn)移任何DNA片段[14]，其中ISCR1常與多種耐藥基因相關(guān)[15]。Ⅰ類(lèi)整合子的3'保守區(qū)（3'CS）后連接ISCR1及其下游的耐藥基因盒形成復(fù)合I型整合子結(jié)構(gòu)[16]，復(fù)合I型整合子同時(shí)包含有兩種遺傳元件，這使其能更容易捕獲和傳播耐藥基因。

此前的研究表明，復(fù)合I型整合子陽(yáng)性分離株對(duì)多種抗生素具有顯著的耐藥性[17-18]，對(duì)這一結(jié)構(gòu)的研究非常重要[19]，前期的研究多集中在沙門(mén)氏菌臨床株，目前國(guó)內(nèi)外只有少量文獻(xiàn)報(bào)道食源性沙門(mén)氏菌中的復(fù)合I類(lèi)整合子。本研究針對(duì)66株沙門(mén)氏菌分離株，檢測(cè)其耐藥譜、血清型和序列型，再分析沙門(mén)氏菌菌株的復(fù)合 I類(lèi)整合子和耐藥基因盒，旨在分析復(fù)合 I類(lèi)整合子在多重耐藥菌株中的作用，為科學(xué)指導(dǎo)應(yīng)用抗生素及沙門(mén)氏菌的防控提供數(shù)據(jù)參考[20]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株：從湖北武漢和荊州地區(qū)各大農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)與超市生鮮制品中分離得到的沙門(mén)氏菌株共66株（禽類(lèi)來(lái)源51株、畜類(lèi)來(lái)源7株、水產(chǎn)6株、其他來(lái)源2株），標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922，大腸桿菌工程菌DH5α。

試劑：培養(yǎng)基Luria-Bertani（LB）Agar、Luria-Bertani（LB）Broth、Mueller Hinton Agar（MHA）和麥康凱瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份責(zé)任公司；DNA分子標(biāo)準(zhǔn)量Marker，博邁德生物技術(shù)有限公司；2×Taq Master Mix，諾唯贊生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖、GelRed染料，上海拜力生物科技有限公司；抗生素阿莫西林（Amoxycillin，AML）、氨芐西林（Ampicillin，AMP）、頭孢噻肟（Cefotaxime，CTX）、頭孢呋辛鈉（Cefuroxime sodium，CXM）、氯霉素（Chloramphenicol，C）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、萘啶酸（Nalidixic acid，NA）、諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）、鏈霉素（Streptomycin，ST）、慶大霉素（Gentamicin，CN）、呋喃妥因（Nitrofurantoin，F(xiàn)）、磺胺復(fù)合物（Sulphonamides compound，S3）、四環(huán)素（Tetracycline，TE）和沙門(mén)氏菌診斷血清（60種），寧波天潤(rùn)生物有限公司；magenten總DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒，TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

凝膠電泳儀（DYCP-31DN，BIORAD）；凝膠成像儀（GelDoc XR+，BIORAD）；PCR儀（T100，BIORAD）。

1.3 方法

1.3.1 藥敏檢測(cè)

按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI2016）推薦的K-B紙片法進(jìn)行14種抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)，以大腸桿菌 ATCC25922為質(zhì)控菌株，結(jié)果判定參考CLSI2016（表1），多重耐藥定義為至少對(duì)三類(lèi)抗生素耐藥或者中介。

1.3.2 血清型檢測(cè)

采用玻片凝集法[21]進(jìn)行沙門(mén)氏菌血清型分型。

1.3.3 DNA模板的制備

按照magenten總DNA提取試劑盒方法提取沙門(mén)氏菌總DNA。

根據(jù)收集0.5～1.0 mL新鮮制備的菌液，高速離心后去上清液，加入240 μL STE、10 μL溶菌酶溶液（20 mg/mL）、5 μL RNA 酶（100 mg/mL），37 ℃下水浴10 min；繼續(xù)加入250 μL DL緩沖液、10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），移液槍吸打混勻，65 ℃下水浴30 min；加入250 μL無(wú)水乙醇，渦旋混勻15 s。

表1 抗生素判定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard for antibiotic susceptibility test

表2 Ⅰ類(lèi)整合子及ISCR1引物信息Table 2 Ⅰ integron and ISCR1 primer information

將溶液移至spin column管中，10000 r/min離心1 min，棄濾液；加入500 μL GW1緩沖液，8000 r/min離心1 min，棄濾液；繼續(xù)加入650 μL GW2緩沖液，8000 r/min離心1 min，棄濾液；12000 r/min下離心2 min，棄收集管，套上滅菌后的1.5 mL離心管，往spin column管中加入50 μL Buffer AE，靜置10 min，12000 r/min離心2 min；回收濾液得到總DNA，于-20 ℃下保存。

1.3.4 MLST分型

根據(jù) PubMLST數(shù)據(jù)庫(kù)（http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Senterica）推薦的七個(gè)管家基因擴(kuò)增引物和擴(kuò)增條件，以多重耐藥沙門(mén)氏菌總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送華大基因測(cè)序公司雙向測(cè)序,將序列上傳至MLST沙門(mén)氏菌數(shù)據(jù)庫(kù)中，與數(shù)據(jù)庫(kù)中原有的等位基因型序列進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)看家基因的基因型編號(hào)，將其組合后得到對(duì)應(yīng)的序列型（sequence type，ST）。

1.3.5 基因盒擴(kuò)增

1.3.5.1 引物設(shè)計(jì)

針對(duì)I類(lèi)整合子與ISCR1區(qū)段，利用Primer 5設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，檢測(cè)Ⅰ類(lèi)整合子和ISCR1兩端的保守區(qū)域。含有Ⅰ類(lèi)整合子與ISCR1元件的分離株，對(duì)其基因盒CS可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其中的耐藥基因。引物序列見(jiàn)表2。

1.3.5.2 PCR反應(yīng)及檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系：0.5 μL總DNA為模板，前后引物各0.5 μL，2×Taq Master Mix DNA 聚合酶 12.5 μL,用蒸餾水補(bǔ)足至25 μL。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，時(shí)間30 s；退火時(shí)間30 s；延伸72 ℃，時(shí)間2 min；最后延伸5 min。采用含有superGel染料的瓊脂糖進(jìn)行PCR產(chǎn)物的凝膠電泳，再利用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)相應(yīng)目標(biāo)基因的擴(kuò)增條帶。

1.3.6 基因盒片段的克隆與測(cè)序分析

擴(kuò)增片段的純化：采用TaKaRa普通瓊脂糖凝膠（離心柱型）DNA回收試劑盒DNA片段回收，將PCR目的產(chǎn)物純化。將凝膠回收的PCR產(chǎn)物與pMD-19T載體體外連接，連接體系總體積10 μL：PCR純化產(chǎn)物 4.5 μL，pMD-19T 0.5 μL，Solution Ⅰ（2×）5 μL；在4 ℃條件下過(guò)夜連接。參考文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化[6]，宿主菌為DH5α，將培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液送測(cè)序公司測(cè)序，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)序列進(jìn)行分析，確定耐藥基因盒陣列。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥敏檢測(cè)結(jié)果

表3 66株沙門(mén)氏菌分離株的藥敏檢測(cè)結(jié)果Table 3 Antimicrobial susceptibility test results of 66 Salmonella isolates

對(duì)66株沙門(mén)氏菌分離株進(jìn)行了藥敏檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)磺胺復(fù)合物耐藥率最高（81.82%），其次為四環(huán)素（74.24%）、萘啶酸（68.18%）、鏈霉素（65.15%）、阿莫西林（62.12%）、氨芐西林（62.12%）和氯霉素（43.94%），沙門(mén)氏菌分離株對(duì)頭孢呋辛鈉（15.15%）、慶大霉素（15.15%）、頭孢噻肟（9.09%）、環(huán)丙沙星（3.03%）和諾氟沙星（3.03%）的耐藥率較低，僅一株菌（1.51%）對(duì)呋喃妥因耐藥（表3）。多重耐藥菌株為32株，多重耐藥率為48.48%（表5），與印廣浩[25]從揚(yáng)州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)分離的豬源沙門(mén)氏菌的多重耐藥率（25%）相比偏高，但與廖成水等[26]2015年報(bào)道的雞源沙門(mén)氏菌多重耐藥率（96.94%）相比，本實(shí)驗(yàn)中沙門(mén)氏菌分離株多重耐藥率較低。

2.2 血清型及MLST型檢測(cè)結(jié)果

本次分離的32株多重耐藥菌株分為11種不同血清型，其中S. Thompson及S. Agona是優(yōu)勢(shì)血清型，分離率分別為 21.88%和 18.75%。S. Takoradi、S.Typhimurium、S. Kentucky、S. Derby均占9.38%，其它5種血清型包含的菌株數(shù)均在2株及以下（表5）。相比其它血清型，優(yōu)勢(shì)血清型S.Thompson分離株對(duì)頭孢菌素類(lèi)、磺胺類(lèi)抗生素的耐藥率達(dá)到 100%，這表明S. Thompson可能因?yàn)檩^高的耐藥性而在本地區(qū)成為流行血清型。這個(gè)結(jié)果與美國(guó)、尼日利亞和英國(guó)等地區(qū)的報(bào)道不同，他們的研究表明肉制品中沙門(mén)氏菌分離株最常見(jiàn)的血清型為S.Typhimurium[27-28]。

表4 32株多重耐藥沙門(mén)氏菌分離株血清型的分布Table 4 Distribution of 32 multi-drug resistance Salmonella isolates serovars

32株沙門(mén)氏菌中分為15種ST型，其中有3株為新的ST型（表5），其中ST26是最主要的序列型（7/32，21.88%），其次為 ST13（4/32，12.50%），ST541及ST314（9.38%，3/32）。優(yōu)勢(shì)血清型均在禽類(lèi)來(lái)源中檢測(cè)出，這說(shuō)明沙門(mén)氏菌血清型可能具有宿主差異性，不同血清型沙門(mén)氏菌有不同的宿主范圍。將本次試驗(yàn)ST分型結(jié)果與血清型結(jié)果比較可知，MLST的15種序列型與 11種血清型結(jié)果之間關(guān)系密切，符合率達(dá)31/32（96.88%），未對(duì)應(yīng)的為一株血清型未確定的粗糙型沙門(mén)氏菌分離株。表明相同血清型基本對(duì)應(yīng)固定的ST型[1]。

表5 32株多重耐藥菌株特征及耐藥基因盒信息Table 5 Information of 32 multi-drug resistant strains and gene-cassette

2.3 復(fù)合整合子檢測(cè)

2.3.1 Ⅰ類(lèi)整合子檢測(cè)

以32株多重耐藥沙門(mén)氏菌分離株的總DNA作為模板，利用PCR方法擴(kuò)增I類(lèi)整合酶基因intI1和末端消毒劑基因qacEΔ1-sul1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在32株沙門(mén)氏菌分離株中，有 14株擴(kuò)增到intI1基因片段和qacEΔ1-sul1基因片段，檢出率為43.75%（表5）。本實(shí)驗(yàn)在多重耐藥沙門(mén)氏菌中Ⅰ類(lèi)整合子的檢出率和國(guó)外 Ahmed等[29]報(bào)道的食源性多重耐藥沙門(mén)氏菌Ⅰ類(lèi)整合子的陽(yáng)性率（57.45%）相當(dāng)，但明顯低于國(guó)內(nèi)楊丹[30]報(bào)道的藏雞多重耐藥沙門(mén)氏菌Ⅰ類(lèi)整合子檢出率（95.12%），表明整合子在不同區(qū)域或不同來(lái)源的多重耐藥菌株中有差異。

對(duì)確定包含Ⅰ類(lèi)整合子的菌株進(jìn)行可變區(qū)耐藥基因盒的檢測(cè)。在14株Ⅰ類(lèi)整合子陽(yáng)性菌株中，有9株擴(kuò)增到150 bp的特異性片段，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)為空基因盒。在另外的5株分離株中，分別擴(kuò)增到0.9 kb、1.7 kb、1.9 kb、2.2 kb和 2.3 kb的特異性片段，檢出率為35.71%（5/14）。經(jīng)克隆、測(cè)序和序列分析，發(fā)現(xiàn)這5株分別含有五種不同基因盒（表 5），其陣列分別為aadA2（0.9 kb，n=1）、aacA4C-arr-3-dfr2（1.7 kb，n=1）、dfrA12-orfF-aadA2（1.9 kb，n=1）dfrA12-orfF-aadA21（2.2 kb，n=1）、dfr17-aadA5（2.3 kb，n=1）。其中aadA2、aadA4C和aadA21是氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥基因，dfr2、dfrA12和dfr17是磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因。含有Ⅰ類(lèi)整合子的菌株基本表現(xiàn)出相應(yīng)的耐藥性，Meng等人[31]研究也表明I類(lèi)整合子的存在與沙門(mén)氏菌耐藥性之間存在一定的相關(guān)性。

2.3.2 ISCR元件檢測(cè)結(jié)果

以32株沙門(mén)氏菌分離株的總DNA為模板，利用PCR方法在11株中擴(kuò)增到ISCR1元件（orf513基因），檢出率為34.38%（11/32）。利用513BF作為上游引物，消毒劑基因qacEΔ1前端序列做下游引物，通過(guò)PCR檢測(cè) ISCR1元件中的耐藥基因盒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 11株ISCR1元件陽(yáng)性菌株中有4株擴(kuò)增出2700 bp左右的片段，檢出率為 36.36%（4/11），經(jīng)克隆、測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)基因盒中有3種基因排列方式：qnrB2-yghA-1-PSF-2-qnrB1-yghA-3（ n=1）、qnrB2-yghA-1-yghA-3-qnrB1-PSF-2（ n=2）、qnrB1-yghA-1-qnrB6（n=1）。其中qnrB1、qnrB2為喹諾酮類(lèi)抗生素耐藥基因，PSF-2為噬菌體休克蛋白F，yghA-1和yghA-3為未表征的氧化還原酶基因。本實(shí)驗(yàn)中4株菌株的ISCR1耐藥基因盒都包含有qnrB，其中3株對(duì)萘啶酸（NA）表現(xiàn)為耐藥或中介，僅1株對(duì)萘啶酸表現(xiàn)為敏感。黃建芳等[32]發(fā)現(xiàn)ISCR1陽(yáng)性菌株常與qnrA1-共同傳播。Toleman等人[33]研究中報(bào)道ISCR1中的耐藥基因盒主要包括喹諾酮耐藥基因qnr以及β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因，且耐藥基因盒基因與耐藥表型具有較強(qiáng)相關(guān)性。

2.3.3 復(fù)合整合子菌株的耐藥及基因盒同源性分析

同時(shí)含有這兩種遺傳元件（Ⅰ型復(fù)合整合子）的菌株共檢測(cè)出9株，檢出率為28.13%（9/32）。其中，包含Ⅰ型復(fù)合整合子元件且均含有耐藥基因盒的只有第28號(hào)菌株（表5），其表現(xiàn)出對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)（阿莫西林和氨芐西林）、苯丙醇類(lèi)（氯霉素）、氨基糖苷類(lèi)（鏈霉素）、磺胺復(fù)合物和四環(huán)素五大類(lèi)6種抗生素的耐藥性，對(duì)喹諾酮類(lèi)（萘啶酸）表現(xiàn)出耐藥中介。Cheng等[34]和Xia等[35]的研究也表明，同時(shí)攜帶Ⅰ類(lèi)整合子和ISCR1兩種遺傳元件的沙門(mén)氏菌比攜帶單一元件的沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性。

對(duì) 28號(hào)菌株基因盒和側(cè)翼序列進(jìn)行同源性分析[36]，結(jié)果如圖 1，Ⅰ類(lèi)整合子的基因盒aacA4C-arr-3-dfr2與來(lái)自中國(guó)某醫(yī)院臨床分離沙門(mén)氏菌 Nsa217[37]質(zhì)粒（KR338349）的基因盒相似，在Nsa217質(zhì)粒耐藥基因盒的下游還含有一個(gè)完整的氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aadA16，以及一個(gè)消毒劑基因qaceΔ1，說(shuō)明Ⅰ類(lèi)整合子可能可以介導(dǎo)臨床和食品分離株之間的耐藥基因的傳播。而 ISCR1基因盒陣列qnrB2-yghA_1-qnrB6通過(guò)同源性比對(duì)，則與肺炎克雷伯菌KP15-2-53[38]質(zhì)粒（MN480461.1）中一段序列相同，KP15-2-53質(zhì)?；蚝猩舷掠畏謩e有一個(gè)IS91和IS26，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的傳播能力，有利于耐藥基因在不同菌株之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)中，66株生鮮食品來(lái)源沙門(mén)氏菌分離株對(duì)磺胺復(fù)合物、四環(huán)素、萘啶酸、鏈霉素、阿莫西林、氨芐西林的耐藥率均較高，且耐3種及以上抗生素的菌株占 48.49%，對(duì) 6種以上抗生素耐藥的菌株占7.58%。32株多重耐藥株中分為11種血清型，優(yōu)勢(shì)血清型為S. Thompson和S. Agona，MLST的序列分型將多重耐藥株分為15種ST型，優(yōu)勢(shì)序列型為ST26、ST13。試驗(yàn)中僅攜帶一種遺傳基因元件（I類(lèi)整合子或ISCR1元件）的沙門(mén)氏菌中，對(duì)抗生素耐藥的類(lèi)型最多涉及到四類(lèi)。攜帶ISCR1元件的菌株均表現(xiàn)出對(duì)3種以上的抗生素的耐藥性，且對(duì)阿莫西林、氨芐西林、頭孢唑啉、氯霉素、慶大霉素、諾氟沙星、磺胺復(fù)合物和四環(huán)素的耐藥率差異顯著。本試驗(yàn)中一株攜帶Ⅰ型復(fù)合整合子的菌株耐藥性極強(qiáng)，對(duì)五大類(lèi)6種抗生素表現(xiàn)為耐藥，且耐藥基因盒基因與耐藥表型表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性，耐藥基因盒與沙門(mén)氏菌 Nsa217質(zhì)粒和肺炎克雷伯菌的KP15-2-53質(zhì)粒分別具有同源性，表明其傳播能力較強(qiáng)。研究沙門(mén)氏菌分離株的特征及其中復(fù)合整合子的流行狀況，將有助于闡明耐藥基因的傳播機(jī)制，對(duì)食源性致病菌進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，降低或防止食品安全事件的發(fā)生。