劉艷飛，劉真真，呂金峰，呂薏潼，房鈺良，朱元祺,*

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島266003;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部檢驗(yàn)系，山東 青島 266071;3.青島市婦女兒童醫(yī)院 山東 青島266034;4.香港城市大學(xué) 生物科學(xué)專業(yè))

希瓦氏菌屬是于1985年建立的新屬，目前有70余個(gè)種[1]。希瓦氏菌屬于非發(fā)酵菌，廣泛分布于自然界。其中，與臨床感染相關(guān)的主要是腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)、海藻希瓦氏菌(Shewanellaalgae)、奧奈達(dá)希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)和廈門希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis)。希瓦氏菌可引起人的中耳炎、血流感染、肝膽系統(tǒng)感染以及皮膚和軟組織的感染[2]。到目前為止，國(guó)內(nèi)外關(guān)于廈門希瓦氏菌引起人體臨床感染的報(bào)道相對(duì)較少。因此，本文對(duì)臨床分離的一株耐碳青霉烯類希瓦氏菌HDC555進(jìn)行分子鑒定、藥敏表型和產(chǎn)碳青霉烯酶檢測(cè)，以及對(duì)菌株的基因組序列進(jìn)行測(cè)序和分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)和藥敏質(zhì)控菌株希瓦氏菌HDC555株分離自肺部感染患者的痰液。S1核酸酶切脈沖場(chǎng)電泳的分子量標(biāo)記沙門菌H9812和藥敏質(zhì)控菌株ATCC 25922為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器與試劑生物梅里埃公司VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)。藥敏結(jié)果判定依據(jù)CLSI-2021標(biāo)準(zhǔn)[3]。美國(guó)BIO-RAD公司脈沖場(chǎng)電泳系統(tǒng)和凝膠成像儀。其他試劑為Takara公司。

1.3 菌株碳青霉烯酶的篩選分別通過(guò)mCIM/eCIM(改良碳青酶烯滅活試驗(yàn)/EDTA改良碳青酶烯滅活試驗(yàn))和免疫金標(biāo)法篩選菌株產(chǎn)生的碳青霉烯酶。mCIM/eCIM實(shí)驗(yàn)操作步驟和結(jié)果判定依據(jù)CLSI-2021標(biāo)準(zhǔn)[3]。免疫金標(biāo)法試劑分別為上海復(fù)星NG-Test CARBA 5試劑卡(批號(hào)W20040311)和北京金山川碳青霉烯酶檢測(cè)卡(批號(hào)201031)，這兩個(gè)廠商的試驗(yàn)卡的實(shí)驗(yàn)步驟和結(jié)果判定按照試劑盒內(nèi)提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 S1核酸酶切脈沖場(chǎng)凝膠電泳(S1-PFGE)希瓦氏菌HDC555攜帶質(zhì)粒的檢測(cè)通過(guò)S1核酸酶切脈沖場(chǎng)凝膠電泳，具體操作參照文獻(xiàn)[4]。

1.5 希瓦氏菌HDC555的高通量測(cè)序基于Illumina和Nanopore技術(shù)平臺(tái)對(duì)HDC555株進(jìn)行測(cè)序，然后對(duì)獲得的序列利用一系列軟件分析菌株的生物學(xué)信息。Inkscape0.48.1軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 菌株的藥敏和碳青霉烯酶檢測(cè)結(jié)果

希瓦氏菌HDC555對(duì)頭孢唑啉、頭孢曲松、頭孢他啶、厄他培南、亞胺培南、美羅培南、環(huán)丙沙星和磺胺甲惡唑/甲氧芐啶哌耐藥，但對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、頭孢吡肟、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素和左氧氟沙星敏感。

mCIM/eCIM實(shí)驗(yàn)顯示希瓦氏菌HDC555的mCIM和eCIM都是陽(yáng)性，按照CLSI-2021中結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，在該株菌中檢出金屬β-內(nèi)酰胺酶。然而，在免疫金標(biāo)法試驗(yàn)中，上海復(fù)星NG-Test CARBA 5試劑卡和北京金山川NDM碳青霉烯酶檢測(cè)卡以及OXA-48碳青霉烯酶檢測(cè)卡顯示都顯示該株菌產(chǎn)碳NDM和OXA-48碳青霉烯酶。此外，北京金山川OXA-23碳青霉烯酶檢測(cè)卡顯示陰性，即，北京金山川OXA-23碳青霉烯酶檢測(cè)卡與OXA-48碳青霉烯酶檢測(cè)卡之間沒(méi)有呈現(xiàn)交叉反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 希瓦氏菌HDC555碳青霉烯酶檢測(cè)結(jié)果圖

2.2 菌株的S1-PFGE和高通量測(cè)序結(jié)果

S1-PFGE顯示希瓦氏菌HDC555株攜帶一個(gè)大約217 kb的質(zhì)粒,見(jiàn)圖2。高通量測(cè)序獲得了該菌的染色體和攜帶的1個(gè)質(zhì)粒的序列，分別命名為HDC555-chr和pHDC555-1。通過(guò)ANI比對(duì)，原VITEK 2 Compact儀器鑒定HDC555株為腐敗希瓦氏菌實(shí)際上是廈門希瓦氏菌。另外，質(zhì)粒pHDC555-1的序列長(zhǎng)度為217 441 bp，與S1-PFGE顯示的質(zhì)粒大小相一致。此外，序列分析顯示廈門希瓦氏菌HDC555攜帶blaOXA-199和blaNDM-1基因，并分別位于染色體和質(zhì)粒上，其他耐藥基因和信息見(jiàn)表1。

圖2 S1核酸酶切脈沖場(chǎng)凝膠電泳

表1 廈門希瓦氏菌HDC555株的生物信息分析結(jié)果

通過(guò)NCBIblast比對(duì)，HDC555的blaOXA-199區(qū)域與廈門希瓦氏菌WCJ25(JN704570.1)的blaOXA-199區(qū)域[5]高度相似,但與廈門希瓦氏菌S4(JX644945.1)的blaOXA-48區(qū)域[5]相似度稍低。blaOXA-199與blaOXA-48周圍環(huán)境區(qū)別主要是ISSheS2插入到了blaOXA-199的下游，見(jiàn)圖3。

圖3 HDC555與WCJ25和S4的MDR部分區(qū)域比較圖

質(zhì)粒pHDC555-1的MDR區(qū)域含有blaNDM-1和blaCARB-2兩個(gè)耐藥基因。blaNDM-1對(duì)應(yīng)區(qū)域源自Tn125轉(zhuǎn)座子，而其blaCARB-2區(qū)域與PGI2-C74(MK847916.1)的對(duì)應(yīng)核酸序列[6]高度相似。另外，blaNDM-1和blaCARB-2這兩個(gè)耐藥基因所在區(qū)域由插入序列IS26相連接，見(jiàn)圖4。

圖4 pHDC555-1與PGI2-C74的blaCARB-2區(qū)域比較

3 討論

隸屬于希瓦氏菌屬的廈門希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis)是Huang 于2010年首次報(bào)道[7]。該菌株分離于福建省廈門沿海的海洋沉積物。目前，臨床上應(yīng)用的微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)不能對(duì)希瓦氏菌屬進(jìn)行正確地鑒定，使得一些新菌種被誤鑒定為腐敗希瓦氏菌或海藻希瓦氏菌[8-9]。本研究的希瓦氏菌HDC555經(jīng)VITEK 2 Compact儀器最初鑒定為腐敗希瓦氏菌，但通過(guò)平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)比對(duì)，希瓦氏菌HDC555全基因組與廈門希瓦氏菌基因組的OrthoANIu value高達(dá)97.41%，即，原VITEK 2 Compact自動(dòng)儀鑒定HDC555株為腐敗希瓦氏菌實(shí)際上是廈門希瓦氏菌。另外，廈門希瓦氏菌HDC555全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)分析顯示：①HDC555-chr序列長(zhǎng)度為5023 766 bp,blaOXA-199基因位于該染色體上;②質(zhì)粒pHDC555-1的長(zhǎng)度為217 441 bp，除了與S1-PFGE顯示的質(zhì)粒大小相一致外，blaNDM-1和blaCARB-2這兩個(gè)耐藥基因都位于質(zhì)粒上。

Zong于2012年首次報(bào)道[5]攜帶blaOXA-199基因的廈門希瓦氏菌。該菌分離自一位胰腺炎患者術(shù)后所放置的胰周引流管。通過(guò)NCBIblast比對(duì)，HDC555的blaOXA-199區(qū)域長(zhǎng)度為11 940 bp，與廈門希瓦氏菌WCJ25(GenBank No：JN704570.1)的blaOXA-199區(qū)域高度相似(coverage100%,identity99.96%),但與廈門希瓦氏菌S4(GenBank No：JX644945.1)的blaOXA-48區(qū)域相似度稍低(coverage78%,identity 96.70%)。blaOXA-199上游毗鄰orf(編碼肽酶)、sprT(編碼功能未知蛋白)、endA(編碼內(nèi)切核酸酶)、rsmE(編碼核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶)，下游與ISShes2(插入序列)、lysR(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因)、acc(乙酰輔酶A羧化酶編碼基因)相鄰。blaOXA-199和blaOXA-48周圍環(huán)境高度相似，區(qū)別主要在于ISSheS2插入到了blaOXA-19的下游(圖3)。

blaCARB-2耐藥基因是染色體盒(chromosomal cassette)的一部分，早期曾被確認(rèn)為blaPSE-1基因[10-11]。關(guān)于該基因在不同的菌種和國(guó)家分布的報(bào)道不多。到目前為止，已有報(bào)道在鼠傷寒沙門菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、皮特不動(dòng)桿菌和多噬伯克霍爾德菌中有檢出blaCARB-2基因[12-13]，但在廈門希瓦氏菌中檢出blaCARB-2耐藥基因尚未見(jiàn)報(bào)道。此外，在希瓦氏菌中檢出blaNDM-1基因也比較少。到目前為止，僅僅Potter于2017年報(bào)道1株腐敗希瓦氏菌SA70株攜帶了位于染色體上的blaOXA-436基因和位于質(zhì)粒上的blaNDM-1基因，且該SA70株分離自巴基斯坦一所教學(xué)醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室的水槽把手[14]。除了blaOXA-199基因外，也有報(bào)道廈門希瓦氏菌攜帶其他D類碳青霉烯酶耐藥基因，如blaOXA-181、blaOXA-416blaOXA-538和blaOXA-894基因[15-18]。

本研究中的廈門希瓦氏菌HDC555攜帶有一個(gè)質(zhì)粒(pHDC555-1)。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)分析顯示，該質(zhì)粒的MDR(多重耐藥)區(qū)域含有blaNDM-1和blaCARB-2兩個(gè)耐藥基因：blaNDM-1對(duì)應(yīng)區(qū)域源自Tn125轉(zhuǎn)座子，基因結(jié)構(gòu)為dsbD-trpF-bleMBL-blaNDM-1-ΔISAba125;blaCARB-2對(duì)應(yīng)區(qū)域與PGI2-C74(GenBank No：MK847916.1)的對(duì)應(yīng)核酸序列高度相似，PGI2-C74包含一個(gè)Ⅰ類整合子，基因結(jié)構(gòu)為dfrA16-blaCARB-2-aadA2-cmlA1-aadA1，并且已有研究表明PGI2-C74可以從奇異變形桿菌成功地結(jié)合轉(zhuǎn)移到大腸埃希菌[6]。另外，在質(zhì)粒pHDC555-1中，blaNDM-1和blaCARB-2這兩個(gè)耐藥基因所在區(qū)域由插入序列IS26相連接，Ⅰ類整合子的組件和插入序列 IS26之間的同源重組可能促進(jìn)了MDR 區(qū)域的多樣性(圖4)。

值得注意的是廈門希瓦氏菌HDC555對(duì)頭孢三代和碳青酶烯類的厄他培南、亞胺培南和美羅培南耐藥，但對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、頭孢吡肟敏感，其原因有待于進(jìn)一步研究。另外，按照CLSI-2021中推薦的mCIM/eCIM實(shí)驗(yàn)方法，在希瓦氏菌HDC555僅僅中檢出金屬β-內(nèi)酰胺酶(盡管在指南[3]中已經(jīng)提示該方法對(duì)產(chǎn)兩種碳青霉烯酶的細(xì)菌會(huì)有假陰性)，而在免疫金標(biāo)法中顯示該菌攜帶兩種碳青霉烯酶。因此，在臨床工作中，有必要將這兩種方法相互結(jié)合，以增加檢出的陽(yáng)性率。

綜上所述，廈門希瓦氏菌未來(lái)有可能成為引起臨床感染的潛在重要病原菌。經(jīng)檢索，同時(shí)攜帶了blaOXA-199、blaNDM-1和blaCARB-2耐藥基因的廈門希瓦氏菌引起的臨床感染為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。