喬勇 唐穎楠 周莉莉 鄒蔓姝 夏新華

摘要：目的? 制備斑蝥素半乳糖化脂質(zhì)體（Lac-CTD-Lips）凍干粉，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行考察。方法? 利用冷凍干燥法制備Lac-CTD-Lips凍干粉，以粒徑、外觀、復(fù)溶時間及復(fù)溶后外觀為指標(biāo)，采用單因素試驗篩選凍干處方最佳工藝，考察凍干前后脂質(zhì)體的形態(tài)學(xué)變化、粒徑、pH值及包封率。結(jié)果? 采用內(nèi)外加法，凍干保護(hù)劑的質(zhì)量濃度為20%，甘露醇-海藻糖比為3∶2，以速凍的方式，于-50 ℃凍干機(jī)冷阱預(yù)凍，冷凍干燥24 h，可獲得較滿意的凍干粉。與凍干前比較，凍干后脂質(zhì)體形態(tài)未發(fā)生明顯變化;凍干前后脂質(zhì)體的粒徑分別為（211.6±0.05）nm、（233.2±0.12）nm，Zeta電位分別為（0.08±0.01）mV、（-3.30±0.21）mV，包封率分別為（86.11±0.64）%、（84.20±0.15）%。結(jié)論? Lac-CTD-Lips凍干工藝穩(wěn)定、可行，可為其進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：斑蝥素;半乳糖化脂質(zhì)體;凍干粉;粒徑

中圖分類號：R283.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）10-0070-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.016????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Objective To prepare lyophilized powder of cantharidin galactosylated liposome （Lac-CTD-Lips）; To investigate its physical and chemical properties. Methods Lac-CTD-Lips lyophilized powder was prepared by using freeze-drying method. With particle size， appearance， resolution time and reconstituted appearance as indexes， single factor test was used for the optimization of the process of freeze-drying prescription. The morphological changes， particle size， pH value and encapsulation efficiency of liposomes before and after lyophilization were investigated. Results Using internal and external addition， the concentration of the lyoprotectant was 20%， and the mannitol-trehalose ratio was 3：2. In the form of quick freezing， the freeze-drying process was as follows： pre-frozen at -50 ℃ in a cold-drying machine， then freeze-dried for 24 hours to obtain lyophilization powder. Compared with before lyophilization， no significant change in morphology occurred during this lyophilization process. The particle sizes of the pre and post freeze-drying process were （211.6±0.05）nm and （233.2±0.12）nm， Zeta potential were （0.08±0.01）mV and （-3.30±0.21）mV， the encapsulation efficiency were （86.11±0.64）% and （84.20±0.15）%， respectively. Conclusion Freeze-drying process of Lac-CTD-Lipsis is stable and feasible， which can build a solid foudation for further study.

Keywords： cantharidin; galactosylated liposomes; freeze-drying powder; particle size

目前肝癌主要采用手術(shù)和藥物治療，其中手術(shù)治療占主要地位，而現(xiàn)有的抗癌藥物生物利用率低，毒副作用大，且易產(chǎn)生耐藥性，對腫瘤組織特異性差，常引起多重不良反應(yīng)[1]。因此，開發(fā)高效低毒且具有靶向性的抗肝癌制劑勢在必行[2-4]。

斑蝥素（cantharidin，CTD）是斑蝥體內(nèi)提取的倍半萜類衍生物。研究表明，斑蝥素具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、改變多種蛋白表達(dá)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等藥理作用[5-6]。但斑蝥素水溶性差、口服生物利用度低、毒性大，限制了其在臨床腫瘤治療方面的應(yīng)用[7-10]。脂質(zhì)體是由脂質(zhì)雙分子層所形成的一種超微球形載體制劑，是納米載藥系統(tǒng)的典型代表。目前，以新型脂質(zhì)體為載體的多種藥物遞送系統(tǒng)在介導(dǎo)基因治療、靶向給藥、抗腫瘤等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢[11]。

普通斑蝥素脂質(zhì)體（CTD-Lips）易被機(jī)體免疫識別吞噬。肝實質(zhì)細(xì)胞內(nèi)存在去唾液酸糖蛋白受體（asialogly-coprotein receptor，ASGPR），亦稱半乳糖受體，可高效識別半乳糖殘基，本課題組前期合成了肝靶向分子硬質(zhì)醇乙酰化半乳糖苷，并對斑蝥素半乳糖化脂質(zhì)體（Lac-CTD-Lips）的處方配比和制備工藝進(jìn)行了優(yōu)選[12]，制備出的Lac-CTD-Lips可靶向于肝臟，既提高藥物在病灶的局部濃度，又減少藥物對其他非靶向組織的毒副作用。然而，液態(tài)Lac-CTD-Lips在貯存期間易發(fā)生聚集、融合及藥物滲漏;同時，天然磷脂易氧化、水解，難以滿足藥物制劑穩(wěn)定性的要求[13]。真空冷凍干燥技術(shù)制備凍干脂質(zhì)體是目前提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性以解決液態(tài)脂質(zhì)體無法長期貯存問題的最佳方法。凍干制劑特有的疏松多孔結(jié)構(gòu)，可使藥物易于重新復(fù)溶而恢復(fù)活性;而且凍干制劑含水量低，易于長期穩(wěn)定保存，可有效避免脂質(zhì)體以水溶液方式貯存而導(dǎo)致的一系列問題[14-16]。本研究制備Lac-CTD-Lips凍干粉，優(yōu)化凍干處方工藝，并考察凍干制劑的理化性質(zhì)，為探索解決脂質(zhì)體類制劑的貯存穩(wěn)定性問題提供依據(jù)。

2.4.4? 凍干保護(hù)劑內(nèi)加海藻糖量考察

本試驗固定凍干保護(hù)劑的質(zhì)量濃度為20%，甘露醇與海藻糖的配比為3∶2，設(shè)計內(nèi)加海藻糖量分別為海藻糖總量的0%、12.5%、25.0%、37.5%（即外加甘露醇與海藻糖的配比分別為3∶2、3∶1.75、3∶1.5、3∶1.25）。結(jié)果表明，脂質(zhì)體進(jìn)行冷凍干燥時，內(nèi)加海藻糖量為海藻糖總量的37.5%為佳。見表4。

2.5? 斑蝥素凍干脂質(zhì)體最佳制備方法驗證

采用乙醇注入法制備Lac-CTD-Lips，即精密稱取斑蝥素、磷脂、膽固醇、十八醇半乳糖苷適量，溶于一定量的無水乙醇，超聲溶解后，將其緩慢滴入預(yù)熱的pH 6.4磷酸鹽緩沖液中，并置于55 ℃水浴中攪拌（轉(zhuǎn)速200 r/min）。減壓蒸餾除去無水乙醇，用磷酸鹽緩沖液定容，探頭超聲（冰?。?0 min，分別采用0.45 μm和0.22 μm微孔濾膜過濾進(jìn)行整粒，即得Lac-CTD-Lips。移取2 mL脂質(zhì)體溶液至含0.75海藻糖的稱量瓶中，外加3∶1.25甘露醇-海藻糖（凍干保護(hù)劑的質(zhì)量濃度為20%，甘露醇∶海藻糖=3∶2），搖勻，將樣品以速凍方式（-50 ℃）進(jìn)行預(yù)凍。預(yù)凍12 h后開啟真空泵，減壓至1 Pa，真空干燥24 h，即得Lac-CTD-Lips凍干品。

2.6? 凍干前后理化性質(zhì)考察

2.6.1? 外觀形態(tài)

乙醇注入法制備的Lac-CTD-Lips外觀為半透明膠體溶液，有淡藍(lán)色乳光;凍干品外觀飽滿，可見明顯的疏松結(jié)構(gòu)，呈白色;復(fù)溶后脂質(zhì)體為乳白色半透明膠體溶液。

2.6.2? 透射電鏡觀察

取適量凍干前和凍干后復(fù)溶的Lac-CTD-Lips混懸液樣品，用2%磷鎢酸負(fù)染法制樣，干燥后置于透射電鏡下觀察脂質(zhì)體形態(tài)，結(jié)果見圖2、圖3。在透射電鏡下，Lac-CTD-Lips外觀圓整、大小均一，凍干后復(fù)溶的Lac-CTD-Lips為不規(guī)則圓形球粒，分散均勻。

2.6.3? 粒徑

取適量凍干前及凍干后復(fù)溶的脂質(zhì)體混懸液樣品，于Nano ZS納米粒度及Zeta電位儀測定其平均粒徑及分布。結(jié)果表明，相對于凍干前，凍干后脂質(zhì)體粒徑稍有增大，凍干前Lac-CTD-Lips的平均粒徑為（211.6±0.05）nm，復(fù)溶后平均粒徑為（233.2±0.12）nm，二者粒徑分布圖均呈現(xiàn)一個單峰，見圖4。

2.6.4? Zeta電位

取少量凍干前與凍干后復(fù)溶的脂質(zhì)體混懸液，稀釋相同倍數(shù)，用Nano ZS納米粒度及Zeta電位儀測定其Zeta電位。結(jié)果顯示，Lac-CTD-Lips凍干前的Zeta電位為（0.08±0.01）mV，復(fù)溶后Zeta電位為（-3.30±0.21）mV，表明凍干前后電位無明顯變化，見圖5。

2.6.5? pH值

取凍干前與凍干后復(fù)溶的脂質(zhì)體混懸液適量，用pH計測定Lac-CTD-Lips凍干前后樣品pH值，結(jié)果見表5。

2.6.6? 包封率

精密量取凍干前與凍干后復(fù)溶的Lac-CTD-Lips混懸液各1 mL，加入9 mL甲醇-乙腈混合溶液，超聲使其澄清，微孔濾膜過濾后HPLC進(jìn)樣分析，計算總藥量。另精密量取凍干前與凍干后復(fù)溶的脂質(zhì)體溶液各0.5 mL，加于Sephadex G-50凝膠柱頂部（直徑1.5 cm，柱床高20 cm），以蒸餾水洗脫，洗脫流速為2 mL/min。收集22～46 mL脂質(zhì)體部分，減壓蒸至1 mL，用甲醇-乙腈混合溶液定容至10 mL，超聲使其澄清，過0.22 μm微孔濾膜，HPLC進(jìn)樣分析，計算包封的藥物含量，計算其包封率。包封率（%）=系統(tǒng)中包封的藥量÷系統(tǒng)中總藥量×100%。結(jié)果表明，凍干前后脂質(zhì)體的包封率變化不大，見表6。

3? 討論

本試驗對乙醇注入法制得的Lac-CTD-Lips進(jìn)行冷凍干燥研究，以凍干樣品外觀、粒徑、復(fù)溶時間及復(fù)溶后外觀為評定指標(biāo)，考察預(yù)凍方式、干燥時間、凍干保護(hù)劑種類、加入方式及用量對凍干前后脂質(zhì)體的影響，最終確立Lac-CTD-Lips的最優(yōu)凍干工藝條件為：加入質(zhì)量濃度為20%的甘露醇-海藻糖（3∶2）作為凍干保護(hù)劑，速凍溫度為-50 ℃，預(yù)凍時間為12 h，干燥時間為24 h。

篩選凍干保護(hù)劑發(fā)現(xiàn)，單一凍干保護(hù)劑難以滿足脂質(zhì)體系統(tǒng)的需要，故考慮將2種凍干保護(hù)劑聯(lián)用。試驗結(jié)果表明，對于Lac-CTD-Lips，將甘露醇和海藻糖聯(lián)用，并采用內(nèi)外加法（先內(nèi)加適量海藻糖再外加聯(lián)用凍干保護(hù)劑）可獲得較好的凍干效果。

對Lac-CTD-Lips凍干制劑進(jìn)行了制劑學(xué)評價，考察了脂質(zhì)體凍干前后形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果表明，凍干脂質(zhì)體可見明顯的疏松結(jié)構(gòu)，外形飽滿，色澤均勻;凍干品再分散性良好，復(fù)溶性較好，60 s內(nèi)即可溶解完全;脂質(zhì)體凍干后粒徑略有增大，Zeta電位無明顯變化，體系穩(wěn)定性沒有降低;包封率>80%。

冷凍干燥過程對脂質(zhì)體磷脂雙分子層有一定破壞作用，易造成脂質(zhì)體融合和藥物泄漏。一方面，由于冷凍時外水相先形成冰晶，導(dǎo)致外水相鹽濃度增大，脂質(zhì)體膜內(nèi)外滲透壓增大，藥物容易泄漏;另一方面，干燥時，脫水作用破壞磷脂與水分子之間的氫鍵，促使脂質(zhì)體膜發(fā)生融合[17]。糖類作為凍干保護(hù)劑，可有效防止以上現(xiàn)象發(fā)生，其機(jī)制主要為水置換假說[18]。由于糖類自身帶有多羥基結(jié)構(gòu)，在冷凍干燥過程中，可代替失去的水分子，與磷脂極性基團(tuán)相結(jié)合形成氫鍵，對脂質(zhì)體進(jìn)行保護(hù)，維持脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的完整性[19]。

本試驗利用磷脂對脂溶性藥物斑蝥素的包覆，促進(jìn)藥物在水性介質(zhì)中的分散，針對性地解決了斑蝥素用于臨床的一些缺點(diǎn)，并為其他脂溶性藥物開發(fā)提供了新的研究途徑。利用冷凍干燥技術(shù)將Lac-CTD-Lips制成凍干制劑，有助于提高其貯存的穩(wěn)定性，并可為進(jìn)一步開展Lac-CTD-Lips肝靶向性與抗肝腫瘤作用研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊紹梅，張娜.肝癌治療藥物的研究進(jìn)展[J].中國新藥與臨床雜志， 2015，34（2）：93.

[2] LORENZER C， DIRIN M， WINKLER A M， et al. Going beyond the liver：Progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics[J]. J Control Release，2015，203：1-15.

[3] SEHGAL A， BARROS S， IVANCIU L， et al. An RNAi therapeutic targeting antithrombin to rebalance the coagulation system and promote hemostasis in hemophilia[J]. Nat Med，2015，21（5）：492-497.

[4] BORODOVSKY A， YUCIUS K， SPRAGUE A， et al. Aln-CC5， an investigational RNAi therapeutic targeting C5 for complement inhibition[J]. Blood，2014，124（21）：7.

[5] FRANSSEN E J， JANSEN R W， VAALBURG M， et al. Hepatic and intrahepatic targeting of an anti-inflammatory agent with human serum albumin and neoglycoproteins as carrier molecules[J]. Biochem Pharmacol，1993，45（6）：1215-1226.

[6] SHI B， ABRAMS M， SEPP-LORENZINO， L， et al. Expression of asialoglycoprotein receptor 1 in human hepatocellular carcinoma[J]. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry， 2013，61（12）：901-909.

[7] ABU L A S， MATSUMOTO H， DOI Y， et al. Tumor-type-dependent vascular permeability constitutes a potential impediment to the therapeutic efficacy of liposomal oxaliplatin[J]. Eur J Pharm Biopharm，2012，81（3）：524-531.

[8] JUANG V， LEE H P， LIN A M， et al. Cationic PEGylated liposomes incorporating an antimicrobial peptide tilapia hepcidin 2-3：an adjuvant of epirubicin to overcome multidrug resistance in cervical cancer cells[J]. Int J Nanomedicine，2016，15（11）：6047-6064.

[9] 曹詠梅.用于基因轉(zhuǎn)染的陽離子脂質(zhì)體研究進(jìn)展[J].化學(xué)試劑，2015， 37（6）：515-518.

[10] 王平，王曉晶，潘小霞，等.斑蝥素衍生物的合成、抗肝癌活性及構(gòu)效關(guān)系研究[J].化學(xué)通報，2018，81（4）：355-360.

[11] 黃淵余，梁子才.去唾液酸糖蛋白受體及其在藥物肝靶向遞送中的應(yīng)用[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2015，42（6）：501-510.

[12] 鄒蔓姝，鐘思雨，周莉莉，等.斑蝥素半乳糖化脂質(zhì)體制備工藝研究[J].中草藥，2018，49（12）：2809-2816.

[13] 王選東.水飛薊賓脂質(zhì)體的制備及物理化學(xué)性質(zhì)研究[D].蘇州：蘇州大學(xué)，2010.

[14] 袁松，孫會敏，丁麗霞.脂質(zhì)體物理化學(xué)穩(wěn)定性研究進(jìn)展[J].中國藥事，2011，25（4）：384-388.

[15] 唐文雅，宋艷志，鄧意輝.脂質(zhì)體凍干保護(hù)劑的種類及其作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2012，29（7）：560-569.

[16] 鮑士寶，喻婷婷，馬福敏，等.VC納米脂質(zhì)體懸浮液及其前體脂質(zhì)體的制備與穩(wěn)定性研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（3）：228-236.

[17] GHANBARZADEH S， VALIZADEH H， ZAKERIMILANI P. The effects of lyophilization on the physico-chemical stability of sirolimus liposomes[J]. Adv Pharm Bull，2013，3（1）：25-29.

[18] MOBLEY W C， SCHREIER H. Phase transition temperature reduction and glass formation indehydroprotected lyophilized liposomes[J]. Journal of Controlled Release，1994，31（1）：73-87.

[19] FONTE P， SOARES S， SOUSA F， et al. A stability study perspective of the effect of freeze-drying using cryoprotectants on the structure of insulin loaded into PLGA nanoparticles[J]. Biomacromolecules，2014，15（10）：3753-3765.

（收稿日期：2018-09-30）

（修回日期：2018-10-22;編輯：陳靜）