黃 云 許喜生 陳 凱 李 佳

(郴州市第一人民醫(yī)院燒傷整形外科，湖南省郴州市 423000)

增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)是燒傷傷口愈合的常見(jiàn)并發(fā)癥，隨著時(shí)間的推移，HS可導(dǎo)致患者身體活動(dòng)受限(如攣縮、緊繃、僵硬等)、神經(jīng)性癥狀(如疼痛、瘙癢等)，甚至產(chǎn)生焦慮，嚴(yán)重影響燒傷幸存患者的身心健康和生活質(zhì)量[1]。近年來(lái)，HS的治療方法已有較大進(jìn)展，然而HS一旦發(fā)生，很難通過(guò)非手術(shù)方式徹底清除[2]。因此，了解HS的發(fā)病機(jī)制，做到早期防治至關(guān)重要。顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN)是一種多功能分泌蛋白，在細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生及炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中起重要作用，還廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)和其他系統(tǒng)的各種疾病，如胃炎、敗血癥、結(jié)腸癌等[3]。研究表明，PGRN對(duì)機(jī)體損傷后的修復(fù)過(guò)程具有重要的調(diào)控作用[4]。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)也被稱為前列腺素內(nèi)氧化酶還原酶，目前發(fā)現(xiàn)COX包含2種異構(gòu)體，分別為COX-1和COX-2，其中誘導(dǎo)型COX-2作為炎性反應(yīng)的介質(zhì)，參與多種病理生理過(guò)程，其表達(dá)水平在炎癥刺激下呈增高趨勢(shì)[5]。此外，瘢痕組織中COX的表達(dá)水平增高，使用相關(guān)藥物阻斷COX的表達(dá)可能是治療病理性瘢痕的輔助手段[5]。因此，本研究檢測(cè)PGRN和COX-2在燒傷后HS組織中的表達(dá)水平，分析其與炎性因子的相關(guān)性，初步探討PGRN和COX-2在燒傷后HS中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年9月至2019年9月在我院燒傷整形外科診治的54例燒傷后HS患者，其中男性30例、女性24例，年齡18～48(28.59±7.8)歲；肩背部和四肢燒傷32例、面頸部燒傷22例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)臨床和病理學(xué)檢查確診為燒傷后HS；(2)瘢痕切除術(shù)前未接受其他瘢痕治療；(3)無(wú)家族性瘢痕增生史及金屬元素接觸史；(4)病理檢查提示無(wú)惡變。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并血液系統(tǒng)疾病者；(2)依從性差者；(3)合并瘢痕疙瘩者；(4)合并皮膚疾病者；(5)妊娠或哺乳期婦女；(6)合并惡性腫瘤者；(7)瘢痕組織局部感染者。本研究經(jīng)過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均對(duì)本研究知情同意。

1.2 主要試劑與儀器 PGRN多克隆抗體(上海烜雅生物科技有限公司，貨號(hào)：XY-KT-1824)，COX-2多克隆抗體(上海群己生物科技有限公司，貨號(hào)：PAB24809)，山羊抗兔IgG(H+L)二抗工作液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：A0277)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液、DAB試劑(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：SE068、DA1010)，蘇木素染色液(百濟(jì)神州生物藥業(yè)有限公司，貨號(hào)：C8470)，TRIzol試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司,貨號(hào)：10296028)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和AceQ qPCR SYBR? Green Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司,貨號(hào)：R133-01、Q511-02/03)。微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)：NanoDrop 2000c)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：HH-B11)，立式冷藏柜(青島海爾股份有限公司，型號(hào)：BCD-227B型)，微型超速冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter公司，型號(hào)：BEA21)，石蠟切片機(jī)(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司，型號(hào)：RM2245)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：CX23)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，型號(hào)：CFX384)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本獲?。涸隈：矍谐g(shù)過(guò)程中收集患者的HS組織樣本0.5 g，同時(shí)留取患者植皮取皮時(shí)多余的正常皮膚組織標(biāo)本0.5 g。將新鮮采集的一部分標(biāo)本固定在10%的中性甲醛中，使用乙醇進(jìn)行常規(guī)脫水，浸泡在二甲苯中，然后石蠟包埋，做成4 μm厚的切片待用。將其余部分標(biāo)本置于-80 ℃液氮中保存待用。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色：將1.3.1中的切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟；在0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)中煮沸(95 ℃)18 min進(jìn)行抗原修復(fù)；在切片上滴加3% H2O2室溫孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，采用PBS沖洗切片3次，每次3 min；滴加正常兔血清孵育20 min，甩去多余液體；滴加250 μL PGRN(稀釋比1∶200)和250 μL COX-2多克隆抗體(稀釋比1∶150)，置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，使用PBS沖洗切片3次，每次5 min；滴加100 μL山羊抗兔IgG二抗工作液(稀釋比1∶1 000)，37 ℃孵育40 min，使用PBS沖洗切片3次，每次5 min；滴加50 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，使用PBS沖洗3次，每次5 min；DAB顯色，水洗后使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染；梯度乙醇脫水、透明、干燥，中性樹(shù)膠封片，置于顯微鏡下觀察。隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞確定陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，陽(yáng)性細(xì)胞的判定：PGRN主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒狀；COX-2主要定位于細(xì)胞漿中，呈棕黃色顆粒、彌漫分布。結(jié)果判讀：陰性指陽(yáng)性細(xì)胞百分比<6%；弱陽(yáng)性指陽(yáng)性細(xì)胞百分比為6%～<26%；陽(yáng)性指陽(yáng)性細(xì)胞百分比為26%～49%；強(qiáng)陽(yáng)性指陽(yáng)性細(xì)胞百分比>49%。其中弱陽(yáng)性、陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性均定義為陽(yáng)性表達(dá)[6]。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：參照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取各組織的總RNA，然后參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，使用AceQ qPCR SYBR? Green Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系包括AceQ qPCR SYBR? Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，ddH2O加至10 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，90 s；變性95 ℃，30 s，退火63 ℃，30 s，延伸72 ℃，15 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算PGRN、COX-2、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-10、IL-1β及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)mRNA相對(duì)表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用(x±s)表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HS組織與正常皮膚組織中PGRN、COX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較 HS組織中的PGRN和COX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常皮膚組織(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 HS組織與正常皮膚組織中PGRN、COX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較[n(%)]

2.2 HS組織與正常皮膚組織中PGRN、COX-2及炎性因子mRNA表達(dá)水平的比較 HS組織中PGRN、COX-2、IL-6、IL-1β、TNF-α 的mRNA表達(dá)水平均高于正常皮膚組織，IL-10 mRNA表達(dá)水平低于正常皮膚組織(均P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 HS組織與正常皮膚組織中PGRN、COX-2及炎性因子的mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

2.3 HS組織中PGRN、COX-2、炎性因子的mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HS組織中PGRN mRNA表達(dá)水平與COX-2 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.489，P=0.003)；HS組織中PGRN和COX-2的mRNA表達(dá)水平與IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)，與IL-10的mRNA表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。見(jiàn)圖1、表4。

表4 HS組織中PGRN、COX-2的mRNA表達(dá)水平與炎性因子mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

3 討 論

HS是燒傷傷口愈合最常見(jiàn)的后遺癥，研究表明，在燒傷傷口愈合1年內(nèi)31%～90%的患者會(huì)出現(xiàn)HS[7]。盡管藥物療法和手術(shù)切除能夠治療HS，但復(fù)發(fā)率仍較高[8]。深入了解HS潛在的形成機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)預(yù)防和治療HS的新靶點(diǎn)。

研究表明，慢性炎癥反應(yīng)與瘢痕形成有關(guān)[9]。PGRN是一種多功能生長(zhǎng)因子，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫和炎性反應(yīng)，參與多種生物過(guò)程。Jing等[10]發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清PGRN水平升高，體外研究表明PGRN缺乏會(huì)導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子減少，PGRN在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)展中發(fā)揮促炎作用。還有研究表明，PGRN mRNA在正常皮膚組織中幾乎不表達(dá)，但在皮膚創(chuàng)傷后迅速呈現(xiàn)高表達(dá)水平，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，延緩創(chuàng)傷愈合的過(guò)程[3]。PGRN可以直接作用于真皮成纖維細(xì)胞，在傷口愈合過(guò)程中可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，而越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為真皮成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖與HS的形成密切相關(guān)[11-12]。本研究結(jié)果顯示，HS組織的PGRN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率及mRNA表達(dá)水平均高于正常皮膚組織(均P<0.05)，這表明PGRN在HS的形成中發(fā)揮重要作用。COX-2是誘導(dǎo)型炎性因子，與多種炎癥反應(yīng)相關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在HS組織和瘢痕疙瘩組織中均能檢測(cè)到COX-2的陽(yáng)性表達(dá)，并且認(rèn)為局部應(yīng)用COX-2阻滯劑抑制炎癥反應(yīng)，可阻斷前列腺素E2的產(chǎn)生，減少瘢痕形成[5]。本研究結(jié)果顯示，HS組織的COX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率及mRNA表達(dá)水平均高于正常皮膚組織(均P<0.05)，說(shuō)明COX-2表達(dá)水平升高與HS的形成相關(guān)。另外，本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，HS組織中PGRN mRNA表達(dá)水平與COX-2 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)。因此我們推測(cè)，PGRN、COX-2可能共同在HS的形成機(jī)制中發(fā)揮作用，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

IL-1β、IL-6和TNF-α是常見(jiàn)的促炎細(xì)胞因子，IL-10是一種重要的抗炎因子。研究表明，IL-1β、IL-6和TNF-α在HS組織中呈高表達(dá)水平，IL-10在HS組織中呈低表達(dá)[13-14]。本研究結(jié)果顯示，HS組織中的IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表達(dá)水平均高于正常皮膚組織，IL-10的mRNA表達(dá)水平低于正常皮膚組織(均P<0.05)，與上述研究結(jié)果一致。這表明這些炎癥細(xì)胞因子可能是HS形成過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，HS組織中的PGRN mRNA、COX-2 mRNA表達(dá)水平與IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)，與IL-10 mRNA表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，這提示PGRN、COX-2可能通過(guò)調(diào)控這些炎性因子的產(chǎn)生，參與HS的形成。

綜上所述，與正常皮膚組織相比，HS組織中PGRN、COX-2呈高表達(dá)，兩者可能通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的產(chǎn)生，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，參與燒傷后HS的形成。