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2型固有淋巴細胞與兒童1型糖尿病的相關(guān)性▲

2022-02-13 02:37胡瑩潔
廣西醫(yī)學 2022年23期
關(guān)鍵詞:空腹細胞因子腸道

胡瑩潔

(武漢市第四醫(yī)院內(nèi)分泌科,湖北省武漢市 430033)

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)是一種器官特異性自身免疫性疾病,表現(xiàn)為胰島β細胞破壞或功能衰竭引起的血糖升高,患者需終生依賴胰島素治療維持生命。T1DM多發(fā)生于青少年,由于多數(shù)T1DM患者發(fā)病時年齡偏低、自控能力差,使得血糖控制難度較大,其導致的糖尿病酮癥酸中毒是1型糖尿病兒童最常見的死亡原因之一,因此研究T1DM的防治手段尤為重要[1]。目前認為T1DM的發(fā)生是遺傳、免疫、環(huán)境等多種因素共同作用的結(jié)果,免疫因素可能在T1DM的發(fā)展中扮演重要角色并受到越來越多的關(guān)注[2]。

人體免疫系統(tǒng)分為固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)兩大類。固有淋巴細胞(innate lymphoid cell,ILC)是固有免疫系統(tǒng)的重要效應細胞群,廣泛存在于哺乳動物的皮膚、肺、腸道及脂肪組織等防御屏障,具有介導免疫、協(xié)助組織修復重建、調(diào)節(jié)腸道菌群等多種功能[3]。ILC可根據(jù)其表達的特定轉(zhuǎn)錄因子和分泌的細胞因子分為三類,即ILC1、ILC2和ILC3。其中,ILC2主要分布于黏膜組織(肺和腸道)、非淋巴器官(肝、腎和內(nèi)臟脂肪組織)、淋巴器官(脾、骨髓)及血液,在宿主防御、組織修復及抵抗炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[4]。ILC2主要介導Th2類免疫應答,并可以通過多種效應細胞因子調(diào)控不同信號通路,參與哮喘、特異性皮炎、嗜酸性胃腸炎等多種免疫性疾病的發(fā)生[5]。ILC2作為單獨的細胞亞群,在激活的狀態(tài)下可迅速產(chǎn)生Th2細胞相關(guān)的細胞因子和其他效應分子,包括白細胞介素(interleukin,IL)-4、IL-5、IL-9、IL-13和表皮生長因子受體配體雙向調(diào)節(jié)因子,并通過這些細胞因子驅(qū)動2型免疫反應的發(fā)生[6]。本研究通過分析T1DM患兒與正常兒童ILC2及相關(guān)細胞因子的表達差異,初步探討ILC2與T1DM的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2020年1月于武漢市第四醫(yī)院住院的20例T1DM患兒為T1DM組。納入標準:(1)年齡8~18歲;(2)符合1999年世界衛(wèi)生組織制定的1型糖尿病診斷標準[7]。排除標準:(1)2型糖尿病患兒;(2)合并糖尿病急性并發(fā)癥,如糖尿病酮癥、酮癥酸中毒、高血糖高滲狀態(tài);(3)患有T1DM以外的其他自身免疫性疾??;(4)有遺傳病家族史。另選取同期來武漢市第四醫(yī)院體檢中心體檢的20名健康兒童為正常對照組。納入標準:(1)年齡8~18歲;(2)無糖尿病及糖調(diào)節(jié)受損;(3)尿糖陰性。排除標準:(1)患有自身免疫性疾??;(2)有遺傳病家族史。本研究經(jīng)武漢市第四醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過,研究對象家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 收集一般資料:收集兩組兒童的年齡、性別、血壓。

1.2.2 生化指標檢測:于T1DM組患兒入院時采集其空腹肘靜脈血5 mL,于正常對照組兒童在體檢時采集其空腹肘靜脈血5 mL,采用己糖激酶法檢測空腹血糖及餐后2 h血糖,采用氧化酶法檢測總膽固醇、三酰甘油,采用直接法檢測LDL-C、HDL-C,使用ADVIA 2400全自動生化分析儀(Siemens公司)檢測上述指標,嚴格按照試劑盒(重慶中元生物技術(shù)有限公司,批號:H200905、H201109、H201008、H201203、H201106;積水醫(yī)療科技有限公司,批號:841RIS)說明書進行檢測。采用高效液相色譜法檢測HbA1c,檢測儀器為伯樂D-10糖化血紅蛋白儀(試劑盒:伯樂實驗室有限公司,批號:64431018)。

1.2.3 外周血單個核細胞的分離:于T1DM組患兒入院時采集其空腹肘靜脈血3 mL,于正常對照組兒童在體檢時采集其空腹肘靜脈血3 mL,經(jīng)肝素鈉抗凝后,在室溫下1 500 r/min離心10 min。離心結(jié)束后將下層細胞沉淀物移至50 mL離心管中,并加入PBS稀釋,用無菌吸管小心吸取白色細胞層置于另一無菌離心管(已事先加入等體積單核細胞分離液),室溫下2 500 r/min離心25 min,加入適量PBS,1 500 r/min離心10 min,得到的白色沉淀即為外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測PBMC中的ILC2水平:取200 μL PBMC懸液至流式細胞儀上機管,加入5 μL鼠抗人CD45抗體、5 μL鼠抗人CD127抗體、5 μL鼠抗人CD294抗體及人Lineage復合抗體(由CD2、CD3、CD4、CD7等組成),以上抗體均購自伯樂實驗室有限公司。充分混勻,室溫避光孵育40 min。將Lineage-CD45+CD127+CD294+細胞判定為ILC2,采用流式細胞儀分析ILC2占PBMC的比例。上述實驗設置3個復孔。

1.2.5 ELISA 檢測:于T1DM組患兒入院時采集其空腹肘靜脈血2 mL,于正常對照組兒童在體檢時采集其空腹肘靜脈血2 mL,常溫下3 000 r/min離心20 min,收集上清液。采用 ELISA測定血清IL-4、IL-5和IL-13水平。ELISA試劑盒購于上海恒遠生化試劑有限公司(批號:20200708、20200802、20200907)。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗;計數(shù)資料以例數(shù)表示,比較采用χ2檢驗;指標間的相關(guān)性采用Pearson檢驗進行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料及生化指標的比較 兩組的性別、年齡、收縮壓、舒張壓及總膽固醇、HDL-C、LDL-C、三酰甘油水平差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。與正常對照組相比,T1DM組的空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c水平均升高(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料及生化指標的比較

2.2 兩組ILC2占PBMC的比例及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較 與正常對照組比較,T1DM組ILC2占PBMC的比例及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均升高(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組ILC2占PBMC的比例及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比較(x±s)

2.3 T1DM患兒ILC2占PBMC的比例與一般資料、生化指標及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的相關(guān)性分析 T1DM患兒ILC2占PBMC的比例與年齡、收縮壓、舒張壓及總膽固醇、HDL-C、LDL-C、三酰甘油水平之間均無相關(guān)性(均P>0.05),但ILC2占PBMC的比例與空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c及血清IL-4、IL-5、IL-13水平之間均呈正相關(guān)(均P<0.05)。見表3和表4。

表3 T1DM患兒ILC2占PBMC的比例與一般資料、生化指標的相關(guān)性

表4 ILC2占PBMC的比例與血清IL-4、IL-5及IL-13水平的相關(guān)性

3 討 論

ILC2是近年來發(fā)現(xiàn)的一類重要的ILC亞群,它由骨髓中的淋巴祖細胞在轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合抑制劑2、RAR相關(guān)孤兒受體α(RAR related orphan receptor alpha,RORα)和GATA結(jié)合蛋白3的調(diào)控下產(chǎn)生,是小鼠和人類2型免疫反應的中樞調(diào)節(jié)因子之一[8]。有學者指出,ILC2通過分泌2類細胞因子如IL-4、IL-5和IL-13來參與宿主防御、組織修復及抵抗炎癥性疾病[9]。目前關(guān)于 ILC2在自身免疫性疾病、過敏性疾病中的研究受到越來越多的關(guān)注。

ILC主要分布在腸黏膜,可以調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)和保護腸黏膜的完整性。Monticelli等[10]的研究表明,ILC2在腸道中發(fā)揮屏障保護作用,在腸道受損時,IL-33/雙向調(diào)節(jié)因子(amphiregulin,AREG)/表皮生長因子受體信號通路可能通過ILC2抑制炎癥和/或促進上皮修復。有研究顯示,IL-33作為一種細胞因子“警報”,可在上皮細胞損傷時激活肺和腸的常駐免疫細胞亞群;IL-33是誘導體內(nèi)ILC2中AREG表達的有效刺激因子,特別是在腸道中,IL-33 通過誘導腸道中ILC2的表達從而促進AREG的分泌[11]。該研究還顯示,IL-33可誘導不同功能的ILC2群體,同時表達IL-5、IL-13和/或AREG,提示ILC2亞群參與調(diào)節(jié)腸道表面屏障的炎癥反應[11]。還有學者在惡唑酮誘導的腸道損傷模型中觀察到,IL-25可誘發(fā)與疾病嚴重程度相關(guān)的IL-13和ILC2的表達,這表明在某些情況下ILC2可能參與腸道損傷時的炎癥反應[12]。

國外有關(guān)ILC過度活化后誘導炎癥因子產(chǎn)生而引發(fā)自身免疫性疾病的研究,多集中在腸道疾病及皮膚疾病領(lǐng)域。研究顯示,在克羅恩病患者腸道內(nèi),ILC1表達升高,ILC1過度活化后通過分泌γ干擾素加重腸道的炎癥水平,而持續(xù)的炎癥會引起炎性腸道疾病[13-14],腸道菌群參與ILC的分化,同時ILC可通過產(chǎn)生不同類型的細胞因子影響腸道菌群組成[15]。還有學者發(fā)現(xiàn),腸道菌群產(chǎn)物芳香烴受體配體和丁酸可以促進胰腺中的ILC分泌IL-23和IL-22,后兩者誘導胰腺分泌細胞表達甲基化胞嘧啶鳥嘌呤二苷酸結(jié)合域蛋白14,如果腸黏膜固有層存在ILC并分泌IL-22,將影響免疫炎癥反應與免疫耐受之間的平衡,推測此機制在腸道炎癥的遷延、復發(fā)、擴散中起關(guān)鍵作用[15]。此外,Kim等[16]首次發(fā)現(xiàn)ILC2 在人及小鼠中均參與了特應性皮炎的發(fā)病過程,表面標志為Lineage-CD25+IL-33R+的ILC2在特應性皮炎皮損中聚集,從特應性皮炎皮損區(qū)分離得到的ILC2可以表達前列腺素D2受體及CD161,但從正常皮膚分離得到的ILC2并不表達前列腺素D2受體及CD161。

張淡宜等[17]的研究表明,橋本甲狀腺炎患者外周血中IL-5、IL-13水平升高。IL-13被認為是抗炎細胞因子,同時又是強促纖維化因子,其可以表現(xiàn)出不同的生物學功能,最終的效應是促進炎癥消退或者介導病理應答,在哮喘患者中IL-13是介導氣道高反應性和黏膜高分泌的主要介質(zhì)[18]。有學者通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),橋本甲狀腺炎患者PBMC中RORα、IL-5、IL-13水平均明顯升高,相關(guān)性分析顯示RORα和IL-13呈正相關(guān)[19]。RORα是調(diào)控ILC2的特征性轉(zhuǎn)錄因子,對維持ILC2分化和功能起到重要作用。進一步對外周血循環(huán)中ILC2表達水平與抗體數(shù)量的相關(guān)性進行分析,發(fā)現(xiàn)RORα與抗甲狀腺過氧化物酶抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體呈正相關(guān),IL-5也與抗甲狀腺過氧化物酶抗體呈正相關(guān),IL-13與抗甲狀腺過氧化物酶抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體呈一定的正相關(guān)趨勢[19]。這提示ILC2 活性增強可能是橋本甲狀腺炎發(fā)病的重要免疫學機制。

通過上述研究可知,ILC2調(diào)節(jié)機制在自身免疫疾病中具有重要作用,炎癥因子表達升高可促進ILC分化,從而導致自身免疫性疾病的發(fā)生,但其具體機制尚存在爭議。本研究結(jié)果顯示,T1DM患兒PBMC中的ILC2比例增高,并且T1DM患兒血清IL-4、IL-5、IL-13水平高于健康兒童,且T1DM患兒的ILC2占PBMC的比例與血清IL-4、IL-5、IL-13水平呈正相關(guān)(均P<0.05),提示T1DM患兒存在體內(nèi)ILC2增加,且炎癥反應增強,ILC2可能通過與炎癥因子相互作用,在T1DM發(fā)病過程中起到關(guān)鍵作用。本研究行進一步相關(guān)性分析,結(jié)果顯示,T1DM患兒ILC2占PBMC的比例與空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c水平均呈正相關(guān)(均P<0.05),提示ILC2可能參與T1DM的病情進展。

綜上所述,T1DM患兒體內(nèi)ILC2增加,其與患兒的血糖控制水平及炎病水平呈正相關(guān),ILC2可能通過與炎癥因子相互作用,參與T1DM的發(fā)生和發(fā)展,ILC2有可能成為T1DM潛在的治療靶點。但由于本研究臨床樣本量小,未涉及具體作用機制的研究。今后可通過動物實驗來進一步明確ILC2與Th2類細胞因子之間的上下游關(guān)系,從而闡明ILC2參與T1DM發(fā)病的分子機制。

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