張 葉 李 霞

(遼寧省腫瘤醫(yī)院放療科，遼寧省沈陽市 110042)

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見也是預后最差的惡性腫瘤，2020年肺癌死亡病例數(shù)在所有癌癥中位居首位[1]。肺癌根據(jù)病理學分型可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)兩大類，其中NSCLC占比超過85%[2]。NSCLC發(fā)病早期的臨床表現(xiàn)具有多樣性，故其早期診斷率不高，很多患者在就診時已處于腫瘤晚期，預后不佳[3]。NSCLC的快速生長和遠處轉(zhuǎn)移是治療的難點[4]。因此，尋找與NSCLC發(fā)生和發(fā)展密切相關的新型分子生物學標志物并明確其在NSCLC中的作用，具有十分重要的意義。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是目前研究的熱點，由于其特殊的閉合環(huán)狀結構和超高的穩(wěn)定性，circRNA在NSCLC發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[5]。例如，circFGFR1是一種circRNA，circFGFR1在NSCLC組織和細胞系中表達增高，circFGFR1可通過吸附miR-381-3p的方式促進C-X-C趨化因子受體4誘導NSCLC細胞遷移、侵襲、增殖和免疫逃逸[6]。本研究通過GEO2R在線軟件分析GEO數(shù)據(jù)庫中NSCLC相關數(shù)據(jù)集GSE158695以篩選差異表達的circRNA，并選取其中倍數(shù)變化(fold change，F(xiàn)C)最為明顯的circRNA，即circCCDC109B(circBase ID：hsa_circ_0070659；探針I(yè)D：ASCRP004014)進行初步研究，探討其對NSCLC細胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常支氣管上皮細胞株16HBE、人NSCLC細胞株A549和H1299均購自中科院上海細胞庫。氣道上皮細胞基礎培養(yǎng)基(美國ATCC公司，批號：CAT NO.YB-H010)，DMEM及胎牛血清(Gibco公司，批號：CAT NO.11966-025、CAT NO.16140-089)，TRIzol試劑盒及LipofectamineTM3000試劑盒(Invitrogen公司，批號：CAT NO.15596-026、CAT NO.L3000-008)，GoscriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒及GoTaq?qPCR試劑盒(美國Promega公司，批號：CAT NO.A5003、CAT NO.A6102)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成；特異性circCCDC109B小干擾RNA sicirc-1和sicirc-2，以及陰性對照小干擾RNA siNC均由廣州市銳博生物科技有限公司設計并合成；6-羥基熒光素琥珀酰亞胺酯標記的特異性circCCDC109B寡聚核苷酸探針由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 GEO2R在線軟件分析GEO數(shù)據(jù)庫中NSCLC相關數(shù)據(jù)集：以circRNA和NSCLC為關鍵詞，從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中搜索NSCLC相關數(shù)據(jù)集文件，選定數(shù)據(jù)集GSE158695(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc= GSE158695)作為分析對象。按照GEO2R在線軟件的說明分別設定癌旁組織組(n=3)和NSCLC組(n=3)并進行在線分析，下載差異表達的circRNA的表達文件，再以校正P值<0.01且|log2FC|≥1.5為篩選標準，篩選差異表達的circRNA。

1.2.2 細胞培養(yǎng)：將人正常支氣管上皮細胞株16HBE培養(yǎng)于氣道上皮細胞基礎培養(yǎng)基，將人NSCLC細胞株A549和H1299培養(yǎng)于DMEM，并置于含有5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長至融合率為70%～80%時，以0.25%胰蛋白酶消化，并按1∶3比例進行傳代。以上兩種培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素。

1.2.3 細胞分組及轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的A549和H1299細胞，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次(3 min/次)后加入0.25%胰蛋白酶消化3 min，用DMEM終止消化后，按2×105個細胞/孔的密度將細胞接種于6孔板，并隨機分為陰性對照小干擾RNA轉(zhuǎn)染組(siNC組)、1# circCCDC109B小干擾RNA轉(zhuǎn)染組(sicirc-1組)和2# circCCDC109B小干擾RNA轉(zhuǎn)染組(sicirc-2組)，轉(zhuǎn)染6 h后，棄去轉(zhuǎn)染試劑，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。次日細胞貼壁生長至融合率為50%時，按照LipofectamineTM3000試劑盒說明書將sicirc-1、sicirc-2或siNC轉(zhuǎn)染至A549和H1299細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染48 h后進行后續(xù)的實驗。sicirc-1序列為5′-GCCATCTTCACAGCAGGTTTT-3′，sicirc-2序列為5′-ACAGCAGGTTTTGCGTGTGAA-3′，siNC序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。

1.2.4 RNase R酶處理及實時熒光定量PCR檢測circCCDC109B的表達水平[7]：取人NSCLC細胞株A549和H1299細胞、人正常支氣管上皮細胞株16HBE細胞，以及1.2.3各組轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，按照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，在提取的總RNA中加入RNase R酶(3 U/1 000 ng)，37 ℃孵育10 min以消化線性RNA。按照GoscriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應條件為70 ℃變性5 min，25 ℃退火5 min，42 ℃延伸60 min，70 ℃滅活15 min，4 ℃冷卻。按照GoTaq?qPCR試劑盒說明書進行實時定量PCR。反應體系包括上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 1 μL、RNase-free水8 μL，總體積為10 μL。circCCDC109B上游引物序列為5′-GTTGGTTCATTCCTTCAGGACC-3′,下游引物序列為5′-AGGTGGCACCACGGTACTAT-3′。PCR反應條件：95 ℃(30 s)預變性；94 ℃(5 s)變性；95℃(15 s)→60 ℃(34 s)退火、延伸，40個循環(huán)；95 ℃(15 s)→60 ℃(1 min)→95 ℃(15 s)。以β-actin為內(nèi)參(上游引物序列為5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3′，下游引物序列為5′-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3′)，采用2-ΔΔCt法計算circCCDC109B的相對表達水平。實驗重復3次。

1.2.5 免疫熒光原位雜交檢測circCCDC109B的差異表達[8]：收集2019年3月至2019年4月遼寧省腫瘤醫(yī)院收治的3例行腫瘤切除術的NSCLC患者的腫瘤組織及對應的癌旁組織標本，常規(guī)清洗、脫水、石蠟包埋固定，制成厚度為5 μm的切片；常規(guī)70%、85%和100%乙醇梯度脫水，20 μg/mL蛋白酶K消化5 min、PBS清洗3次(3 min/次)；預雜交液37 ℃孵育1 h后加入含有6-羥基熒光素琥珀酰亞胺酯標記的circCCDC109B寡聚核苷酸探針的雜交液37 ℃孵育過夜；次日，棄去雜交液，依次行2×檸檬酸鈉緩沖液(saline sodium citrate buffer，SSC)37 ℃洗10 min，1×SSC 37 ℃洗5 min，0.5×SSC室溫洗10 min；滴加DAPI染液復染，避光孵育8 min，用PBS沖洗3 min后滴加抗熒光淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。實驗重復3次。

1.2.6 克隆形成實驗檢測A549和H1299細胞增殖能力[9]：取1.2.3各組轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，采用0.25%胰蛋白酶消化3 min后接種于6孔板中(接種密度為1×103個細胞/孔)，并置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。1周后用PBS清洗2次(3 min/次)，采用4%多聚甲醛固定15 min，再用0.5%結晶紫染色15 min，置于顯微鏡下觀察拍照，并隨機選取3個視野計算克隆形成數(shù)目(以包含50個以上細胞為1個克隆)。實驗重復3次。

1.2.7 Transwell實驗檢測A549和H1299細胞遷移能力[10]：取1.2.3各組轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，采用0.25%胰蛋白酶消化3 min后，調(diào)整細胞計數(shù)為1.5×104個并接種于Transwell小室上室內(nèi)，加入100 μL含10% 胎牛血清的DMEM；Transwell小室下室內(nèi)加入500 μL含20%胎牛血清的DMEM，37 ℃、5% CO2孵育48 h。取出Transwell小室，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)部細胞，用PBS沖洗3 min，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%結晶紫染色15 min，置于倒置顯微鏡下觀察Transwell小室下層細胞并隨機選取3個視野進行計數(shù)。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 在數(shù)據(jù)集GSE158695中差異表達的circRNA NSCLC相關數(shù)據(jù)集GSE158695中差異表達的circRNAs見圖1。相較于癌旁組織，在NSCLC癌組織中差異表達的circRNA共有55個，其中表達上調(diào)的circRNA有51個，表達下調(diào)的circRNA有4個；其中又以circCCDC109B(circBase ID：hsa_circ_0070659，探針I(yè)D：ASCRP004014)的上調(diào)倍數(shù)最明顯(log2FC=4.25)，見表1。

圖1 數(shù)據(jù)集GSE158695中差異表達的circRNA

表1 NSCLC中差異表達的circRNA

2.2 circCCDC109B在NSCLC組織及細胞系中的表達情況 免疫熒光原位雜交染色結果顯示，circCCDC109B在NSCLC癌組織中的表達水平高于癌旁組織，見圖2A。實時熒光定量PCR結果顯示，circCCDC109B在NSCLC細胞系A549和H1299中的表達水平均高于人支氣管上皮細胞系16HBE(P<0.05)，見表2。與其母基因線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體顯性負亞基β(mitochondrial calcium uniporter dominant negative subunit beta，CCDC109B)比較，circCCDC109B由CCDC109B前體RNA的2號和3號外顯子環(huán)化形成，見圖2B。

圖2 circCCDC109B在NSCLC組織中的表達情況及其環(huán)形結構

表2 NSCLC細胞系和人支氣管上皮細胞系中circCCDC109B相對表達水平的比較(x±s)

2.3 下調(diào)circCCDC109B表達對A549細胞和H1299細胞增殖、遷移的影響 相比于siNC組，sicirc-1組和sicirc-2組A549細胞和H1299細胞內(nèi)的circCCDC109B表達水平降低(P<0.05)，見表3，提示轉(zhuǎn)染成功。克隆形成實驗結果顯示，相比于siNC組，sicirc-1組和sicirc-2組A549細胞和H1299細胞的克隆形成數(shù)減少(P<0.05)，見表3。Transwell遷移實驗結果顯示，相比于siNC組，sicirc-1組和sicirc-2組A549細胞和H1299細胞的遷移能力降低(P<0.05)，見表3和圖3。

表3 3組A549和H1299細胞circCCDC109B相對表達水平、克隆形成數(shù)和遷移能力的比較(x±s)

圖3 下調(diào)circCCDC109B表達對A549細胞和H1299細胞遷移的影響

3 討 論

隨著高通量測序技術的不斷進步，越來越多的非編碼RNA種類被發(fā)現(xiàn)，如高度保守性的微小RNA、轉(zhuǎn)錄超保守的circRNA及在物種間缺少保守性的長鏈非編碼RNA等[11-13]。這類非編碼RNA缺少轉(zhuǎn)錄功能或者具有非常有限的蛋白質(zhì)編碼能力[14]。與線性的信使RNA和長鏈非編碼RNA不同，circRNA缺乏線性的多聚腺苷酸尾巴而呈現(xiàn)一種閉合環(huán)狀結構[15]。隨著RNA測序技術的快速發(fā)展，越來越多的新的circRNA被發(fā)現(xiàn)，它們在多種疾病中的表達和功能也受到了越來越多的關注[16-17]。

circRNA在多種腫瘤性疾病中表達，且通過調(diào)控細胞周期、細胞增殖和凋亡、細胞侵襲和遷移、細胞耐藥等參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展[18-23]。circCCDC109B位于人染色體4q25正義鏈上，是由CCDC109B前體RNA的2號和3號外顯子環(huán)化形成，其基因組長度為1 355 bp，剪切后的長度為237 bp，位于基因組的chr4:110580167-110581521。目前關于circCCDC109B的研究鮮見報告。本研究通過GEO2R在線軟件對circCCDC109B進行分析，發(fā)現(xiàn)相比于癌旁組織，circCCDC109B在NSCLC組織中的表達水平明顯增高(P<0.05)。進一步行免疫熒光原位雜交染色和實時熒光定量PCR實驗，結果顯示，circCCDC109B在NSCLC組織和細胞系中的表達水平均上調(diào)(均P<0.05)，提示circCCDC109B可能參與NSCLC的發(fā)生。

研究顯示，多個circRNA均參與NSCLC的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。如Zhang等[24]發(fā)現(xiàn)，circSATB2在NSCLC組織和細胞系中表達增加，且circSATB2可通過外泌體轉(zhuǎn)運的方式自分泌到周圍的細胞并吸附miR-326，促進肌動蛋白交聯(lián)蛋白同源體1的表達，從而促進NSCLC細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究采用轉(zhuǎn)染circCCDC109B特異性小干擾RNA的方法構建circCCDC109B低表達的細胞模型，并通過功能缺失性細胞增殖實驗(克隆形成實驗)和細胞遷移實驗(Transwell實驗)觀察下調(diào)circCCDC109B表達對NSCLC細胞系A549和H1299增殖和遷移能力的影響。結果顯示，相比于siNC組，sicirc-1組和sicirc-2組A549細胞和H1299細胞的克隆形成數(shù)減少、遷移能力降低(P<0.05)，說明下調(diào)circCCDC109B的表達可抑制A549細胞和H1299細胞系的增殖和遷移能力，這提示circCCDC109B可能作為癌基因參與NSCLC的進展。

綜上所述，NSCLC組織和細胞系中circCCDC109B表達上調(diào)，下調(diào)circCCDC109B的表達可以抑制NSCLC細胞的增殖和遷移。但腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個涉及多因素的復雜過程，包括細胞黏附力減弱、細胞外基質(zhì)降解、細胞遷移、新生血管形成等多個病理學改變，本研究只是初步分析circCCDC109B在NSCLC中的表達及部分生物學功能，其具體作用機制仍需進一步深入探討。