童敬澍，馬浙平，毛書奇，盧長江，陸才德

（寧波大學(xué)附屬李惠利醫(yī)院 肝膽胰外科，浙江 寧波 315040）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前世界上第五大常見的惡性腫瘤，全球每年新增HCC近70 萬人，其中50%發(fā)生在我國，其病死率在我國惡性腫瘤中位列第二[1]。門靜脈癌栓（portal vein tumor thrombosis，PVTT）作為HCC最常見的并發(fā)癥之一，是引起HCC患者肝功能減退、門靜脈高壓、腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的重要原因，伴有PVTT的HCC患者自然病程僅為3個月，預(yù)后較差[2]。異常凝血酶原（protein induced by vitamin K absence or antagonist-II，PIVKA-II）是在肝癌細(xì)胞中，因凝血酶原前體羧化不足產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)PIVKA-II在HCC的增殖、血管浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用，并與微血管侵犯（MVI）獨(dú)立相關(guān)[3]。然而PIVKA-II與PVTT大血管的關(guān)系尚不明確，本研究旨在探究PIVKA-II與PVTT的關(guān)系，及其在HCC患者發(fā)生PVTT的預(yù)測價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性收集自2019年9月至2020年12月寧波大學(xué)附屬李惠利醫(yī)院肝膽胰外科收治的206例HCC患者臨床資料，按照納入排除標(biāo)準(zhǔn)，最終有191例患者納入本研究，如圖1。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）依據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）》[4]確診為HCC；（2）于我院行一次及以上腹部增強(qiáng)CT或MRI平掃，并且行一次及以上血清PIVKA-II、D-二聚體、AFP、AFP-L3、血常規(guī)、生化全套檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）行HCC根治術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)；（3）伴其他全身嚴(yán)重疾病；（4）長期服用華法林、維生素K及其拮抗劑。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批（審批號：KY2020PJ125）。

1.2 PVTT診斷和分型評估

本組HCC患者的PVTT通過腹部增強(qiáng)CT或MRI診斷，所有影像資料均由兩位及以上具有副高以上年資的影像科醫(yī)師判讀。PVTT的分型按照程氏分型標(biāo)準(zhǔn)：I型，癌栓侵及肝葉或肝段的門靜脈分支；II型，癌栓侵及門靜脈左或右支；III型，癌栓侵及門靜脈主干；IV型，癌栓侵犯及腸系膜上靜脈[5]。

1.3 分組和內(nèi)部驗(yàn)證方法

為研究PIVKA-II對HCC患者發(fā)生PVTT的預(yù)測價值并確定其最佳截?cái)嘀担狙芯坎捎藐?duì)列內(nèi)部驗(yàn)證方法，即所有HCC患者按照3∶2的比例隨機(jī)分為試驗(yàn)組和驗(yàn)證組，在試驗(yàn)組中計(jì)算PIVKA-II和D-二聚體的最佳截?cái)嘀?，并在?yàn)證組中驗(yàn)證其預(yù)測PVTT的價值，見圖1。

圖1 分組方法及設(shè)計(jì)思路示意圖

1.4 檢驗(yàn)儀器與標(biāo)本處理

使用μTASWako i30全自動電泳熒光免疫分析儀（日本）及配套檢測試劑盒（富士膠片和光純藥株式會社）檢測所有HCC患者的血清PIVKA-II、甲胎蛋白（AFP）、甲胎蛋白異質(zhì)體（AFP-L3）；其余相關(guān)血液指標(biāo)包括白蛋白（ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、總膽紅素（TBIL）、凝血酶原時間（PT）、凝血功能國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）。所需的血液標(biāo)本均在HCC患者進(jìn)行手術(shù)、介入或化療前空腹時采集，并經(jīng)過3 500 r/min離心10 min分離血清，且在2 h內(nèi)完成各指標(biāo)檢驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析：各數(shù)據(jù)正態(tài)性采用Kolmogorov-Smirnov法檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征曲線（receiver operation curve，ROC）評估PIVKA-II和D-二聚體對HCC患者發(fā)生PVTT的預(yù)測價值并計(jì)算其最佳截?cái)嘀?。采用Logistic回歸分析HCC患者發(fā)生PVTT的危險因素。采用Spearman等級相關(guān)檢驗(yàn)分析PIVKA-II與PVTT程氏分型等級的相關(guān)性。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)組和驗(yàn)證組的基線資料

試驗(yàn)組和驗(yàn)證組之間基線特征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 試驗(yàn)組和驗(yàn)證組的基線資料及比較

2.2 試驗(yàn)組和驗(yàn)證組內(nèi)有PVTT與無PVTT之間比較分析

分別比較兩組臨床資料，伴有PVTT 的患者PIVKA-II、AFP、AFP-L3、D-二聚體水平高于無PVTT的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2，圖2）。

圖2 試驗(yàn)組和驗(yàn)證組有PVTT與無PVTT之間PIVKA-II的差異比較

表2 試驗(yàn)組和驗(yàn)證組內(nèi)伴有PVTT與無PVTT之間臨床資料比較

2.3 試驗(yàn)組中研究PIVKA-II和D-二聚體對HCC患者發(fā)生PVTT的預(yù)測價值并確定其最佳截?cái)嘀?/h3>

在試驗(yàn)組HCC 患者中，繪制ROC 曲線研究PIVKA-II和D-二聚體對合并PVTT的預(yù)測價值（圖3）。PIVKA-II的ROC曲線下面積為0.747（95%CI0.652～0.842，P＜0.001），PIVKA-II預(yù)測HCC患者發(fā)生PVTT的最佳截?cái)嘀禐?26.5 mAU/mL，敏感度為78.8%，特異度為69.8%；D-二聚體ROC曲線下面積為0.828（95%CI0.751～0.904，P＜0.001），D-二聚體預(yù)測HCC患者發(fā)生PVTT的最佳截?cái)嘀禐?86 μg/L，敏感度為78.8%，特異度為77.8%；PIVKA-II與D-二聚體兩者聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積為0.861（95%CI0.791～0.932，P＜0.001），在PIVKA-II與D-二聚體各自最佳截?cái)嘀迪拢瑑烧呗?lián)合預(yù)測HCC患者發(fā)生PVTT的敏感度為90.4%，特異度為57.1%。兩者聯(lián)合預(yù)測發(fā)生PVTT的敏感度較單一指標(biāo)均有所提高，但特異度下降。

圖3 試驗(yàn)組中PIVKA-II和D-二聚體對HCC患者發(fā)生PVTT的預(yù)測價值

2.4 驗(yàn)證組中驗(yàn)證PIVKA-II和D-二聚體對HCC患者發(fā)生PVTT的預(yù)測價值并驗(yàn)證其最佳截?cái)嘀?/h3>

為驗(yàn)證PIVKA-II和D-二聚體對HCC患者發(fā)生PVTT的預(yù)測價值并驗(yàn)證其上述最佳截?cái)嘀?，在?yàn)證組中通過繪制ROC曲線驗(yàn)證。PIVKA-II的驗(yàn)證組ROC曲線下面積為0.802（95%CI0.693～0.911，P＜0.001），將PIVKA-II以試驗(yàn)組中確定的426.5 mAU/mL為界，其預(yù)測HCC 患者發(fā)生PVTT 的敏感度為79.4%，特異度為69.0%；D-二聚體的驗(yàn)證組ROC曲線下面積為0.894（95%CI0.825～0.963，P＜0.001），將D-二聚體以試驗(yàn)組中確定的286 μg/L為界，其預(yù)測HCC患者發(fā)生PVTT的敏感度為88.2%，特異度為76.2%；在各自最佳截?cái)嘀迪拢瑑烧呗?lián)合預(yù)測發(fā)生PVTT的敏感度為94.5%，特異度為57.1%，兩者聯(lián)合檢測來預(yù)測PVTT的敏感度較單獨(dú)檢測有所提高。

2.5 HCC患者發(fā)生合并PVTT的危險因素分析

將本研究中伴有PVTT的HCC患者與無PVTT的HCC患者對比，單因素分析顯示：PIVKA-II≥426.5 mAU/mL、AFP≥20 ng/L、AFP-L3 ≥10%、ALB≥30 g/L、ALT≥40 U/L、D-二聚體≥286 μg/L是發(fā)生PVTT的獨(dú)立危險因素；多因素分析顯示，PIVKA-II≥426.5 mAU/mL、D-二聚體≥286 μg/L是HCC患者發(fā)生PVTT的獨(dú)立危險因素，見表3。

表3 HCC患者發(fā)生PVTT的單因素、多因素分析

2.6 合并PVTT的HCC患者血清PIVKA-II水平與PVTT的程氏分型等級呈線性相關(guān)

本研究共86 例伴有PVTT的HCC患者中，患者PVTT分型等級越高，其血清PIVKA-II水平也相應(yīng)增高，兩者呈線性相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=0.400，P＜0.001），見圖4。

圖4 PIVKA-II水平與PVTT的程氏分型等級關(guān)系

3 討論

由于肝臟解剖特點(diǎn)和HCC生物學(xué)特性，HCC極易侵犯肝血管系統(tǒng)，包括門靜脈主干分支的大血管和肝段以上的小血管系統(tǒng)。PVTT是HCC常見的大血管侵犯形式，其發(fā)生率在HCC患者中占40%以上，發(fā)生PVTT的HCC患者預(yù)后極差[6]，及時診斷或預(yù)測PVTT是改善HCC患者預(yù)后的重點(diǎn)。本研究重點(diǎn)探究PIVKA-II與HCC患者發(fā)生PVTT的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，即使是在PIVKA-II水平普遍升高的HCC患者中，PVTT患者與無PVTT患者之間的PIVKA-II水平差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，雖然這種差異也體現(xiàn)在AFP和AFP-L3 上，但多因素分析顯示僅PIVKA-II的差異有意義，這表明不僅是腫瘤本身，而且是PVTT與PIVKA-II的內(nèi)在關(guān)聯(lián)引起的PVTT患者PIVKA-II升高。目前關(guān)于PIVKA-II與血管侵犯的研究表明，PIVKA-II通過與生長因子受體c-Met結(jié)合并激活蛋白酪氨酸激酶1（JAK1）、VEGF、表皮生長因子受體（EGFR）等一系列下游信號通路，誘導(dǎo)HCC增殖和血管浸潤，并導(dǎo)致MVI[7-8]。因此，用PIVKA-II預(yù)測PVTT具備理論基礎(chǔ)，但其深入的內(nèi)在相關(guān)腫瘤生物學(xué)機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

PIVKA-II作為HCC的新一代腫瘤標(biāo)志物，其優(yōu)勢正在逐步體現(xiàn)。臨床上將PIVKA-II≥40 mAU/mL作為診斷HCC的標(biāo)準(zhǔn)，但尚無診斷或預(yù)測PVTT的標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)PIVKA-II≥426.5 mAU/mL是HCC患者發(fā)生PVTT的獨(dú)立危險因素，并且用該標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測PVTT的靈敏度達(dá)78.8%。目前PVTT的診斷主要依靠CT、MRI等影像學(xué)檢查，但由于影像學(xué)檢查只能檢測到肝葉門靜脈分支以下的大血管PVTT，對于肝段及以上更細(xì)小的門靜脈分支PVTT只能根據(jù)顯微鏡下的病理學(xué)檢查，此外影像學(xué)檢查普遍具有費(fèi)用昂貴、易漏診誤診等自身局限性，其診斷PVTT的敏感度僅在70%左右[9]，因此用PIVKA-II來協(xié)助診斷或預(yù)測PVTT具有臨床價值。早在2007年，我國的程樹群教授首次提出了PVTT的程氏分型，并為之后PVTT的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，目前臨床上根據(jù)HCC患者的腫瘤和PVTT的大小、位置情況，采取對應(yīng)的個性化治療，如根治性手術(shù)、經(jīng)肝動脈化療栓塞（TACE）、射頻消融、放療、免疫靶向治療等[10]，因此精準(zhǔn)、有效、及時地評估HCC患者的PVTT情況十分重要。本研究發(fā)現(xiàn)，PIVKA-II的升高程度與PVTT程氏分型等級存在線性相關(guān)，提示PIVKA-II越顯著升高的HCC患者，更需謹(jǐn)慎評估治療PVTT，以減少相關(guān)并發(fā)癥，改善患者預(yù)后。

國外的一項(xiàng)大樣本回顧性研究表明，AFP≥20 000 ng/mL是診斷HCC合并PVTT的截?cái)嘀?，但其敏感度僅為24%，診斷效能并不理想[11]。HCC新型標(biāo)志物miRNA的圖譜研究表明，雖然miRNA可以提示HCC的靜脈侵犯，但miRNA并不能診斷或預(yù)測PVTT的發(fā)生[12]。目前尚無診斷PVTT的特定腫瘤標(biāo)記物，本研究從PIVKA-II的理論基礎(chǔ)出發(fā)，研究PIVKA-II對PVTT的預(yù)測價值，旨在填補(bǔ)這一空缺。此外本研究發(fā)現(xiàn)作為反應(yīng)血液高凝狀態(tài)指標(biāo)的D-二聚體也是PVTT形成的獨(dú)立危險因素，可以與PIVKA-II聯(lián)合預(yù)測PVTT。對于這一現(xiàn)象研究者認(rèn)為，在PVTT形成過程中，門靜脈局部血液呈高凝狀態(tài)，從而引起D-二聚體的反應(yīng)性升高。PIVKAII聯(lián)合D-二聚體可以將預(yù)測PVTT的敏感度提高至90.4%，但特異度降至57.1%，考慮到延誤診治PVTT將導(dǎo)致不良后果，敏感度比特異度更為重要，應(yīng)盡量提高預(yù)測PVTT的敏感度。因此，即便目前尚缺乏支持D-二聚體預(yù)測PVTT的理論依據(jù)，仍可將D-二聚體作為聯(lián)合預(yù)測PVTT的補(bǔ)充指標(biāo)，國外一項(xiàng)回顧性研究表明PIVKA-II、D-二聚體與PVTT相關(guān)聯(lián)（以PIVKA-II≥221.3 mAU/mL為界，靈敏度為83.7%），其結(jié)果也支持本研究的結(jié)論[13]。

為確定PIVKA-II預(yù)測PVTT的最佳截?cái)嘀挡p少統(tǒng)計(jì)偏倚，本研究采取隨機(jī)分組的內(nèi)部驗(yàn)證思路方法，即先在試驗(yàn)組中計(jì)算得PIVKA-II ≥426.5 mAU/mL是預(yù)測PVTT的最佳截?cái)嘀?，并在?yàn)證組中驗(yàn)證其靈敏度為79.4%，證明該截?cái)嘀档目煽啃浴Ｔ摲椒ㄔ陬愃蒲芯恐兄饕扇⊥獠框?yàn)證，但外部驗(yàn)證在本研究中并不適用，一是由于樣本量的限制，二是由于本研究主要探討PIVKA-II而非多種變量。研究者在表1 中將試驗(yàn)組和驗(yàn)證組的基線資料進(jìn)行對比，以增加本研究隨機(jī)分組內(nèi)部驗(yàn)證的科學(xué)性。本研究為單中心回顧性研究，存在局限性，相關(guān)結(jié)果仍需多中心、大樣本隨機(jī)對照、外部驗(yàn)證進(jìn)一步研究。

綜上所述，HCC患者PIVKA-II≥426.5 mAU/mL是發(fā)生PVTT的獨(dú)立危險因素，PIVKA-II具有良好的預(yù)測PVTT的價值。