陳建林，陶江濤，帥建，艾小江，鄭錦鋒，余小舫，肖凌云，凌云志，曾小斌

（深圳市人民醫(yī)院龍華分院，廣東 深圳 518109，1.普外科，3.中心實驗室；深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳518020，2.肝膽外科，4.感染病科）

肝癌是我國第4 位常見惡性腫瘤及第2 位腫瘤致死病因。研究顯示，2018 年全球共有841 080 例新發(fā)肝癌病例[1]，其中肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最主要的原發(fā)性肝癌種類，占比85%～90%[2]。肝癌具有起病隱匿、進(jìn)展快、復(fù)發(fā)早、預(yù)后差等臨床特點，在過去幾十年的發(fā)展中，盡管有部分針對肝癌的治療方法及藥物出現(xiàn)，但是肝癌的耐藥強、進(jìn)展快及復(fù)發(fā)率高等問題并未解決，患者5年生存率僅約32.5%，嚴(yán)重威脅人類健康[3]。究其原因，人們對肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制并不十分清楚。因此，尋找肝癌相關(guān)基因，對于理解發(fā)病機制及尋找早期診斷和治療的分子標(biāo)志物均具有重要意義。

Hippo信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的重要通路。Hippo信號通路在進(jìn)化中高度保守，當(dāng)細(xì)胞處于高密度生長或營養(yǎng)缺乏的環(huán)境中時，Hippo信號通路即被激活，MST激酶（mammalian sterile 20-like kinase）被磷酸化，在MOB1（Mps One Binder kinase activator protein 1，Mps一結(jié)合者激酶激活因子樣1）蛋白的輔助下，磷酸化下游的LATS蛋白（large tumor suppressor kinases）；隨后，激活的LATS蛋白磷酸化轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP蛋白（Yes-associated protein）和TAZ蛋白（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif），限制其入核，降低Hippo通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括CTGF、CYR61、ITGAV等多個被報道與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移密切相關(guān)的基因[4]。經(jīng)典的Hippo-YAP/TAZ信號通路被證明是促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控通路[5]，YAP蛋白高表達(dá)是肝癌發(fā)生的早期事件，對于腫瘤的形成至關(guān)重要[6]。YAP蛋白的表達(dá)水平與肝癌的Edmondson-Steiner分級、血清甲胎蛋白水平及預(yù)后顯著相關(guān)，是肝癌重要的獨立預(yù)后指標(biāo)[7]。YAP和TAZ蛋白能促進(jìn)肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。此外，Hippo-YAP/TAZ通路還能影響肝癌的耐藥性，如過表達(dá)YAP蛋白能促進(jìn)肝癌的索拉非尼耐藥[9]。相反，MST和LATS蛋白在肝癌中主要扮演抑癌的角色，如MST1/2 缺失能夠大幅降低YAP蛋白的S127 位磷酸化，促進(jìn)其入核，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長[10-11]。

在Hippo信號通路中，MOB1蛋白的功能研究相對較少，已報道的大部分研究指出MOB1 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演抑癌的角色，但其作用尚存在爭議[12]。人MOB1 蛋白包括兩個序列高度相似的同源蛋白MOB1a和MOB1b，兩者之間有96%的相同序列。在結(jié)直腸癌中，MOB1 在腫瘤組織中顯著低表達(dá)，與淋巴轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良相關(guān)，且過表達(dá)MOB1 能夠顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系的增殖、遷移能力[13]。泛素連接酶Praja2通過促進(jìn)MOB1蛋白的降解，促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長[14]。MOB1a/1b基因雙敲除會造成胚胎致死性，但MOB1aΔ/+1btr/tr和MOB1aΔ/Δ1btr/+小鼠相比于對照小鼠MOB1aΔ/+1btr/+更易形成包括肝癌在內(nèi)的各種自發(fā)性腫瘤[15]。然而也有研究指出，MOB1蛋白能促進(jìn)腫瘤的侵襲和復(fù)發(fā)，且可能在不同的腫瘤類型中發(fā)揮不同的功能。在支氣管肺泡上皮細(xì)胞條件性MOB1a/b雙敲除的小鼠中，其肺部并未形成自發(fā)肺腺癌，且尿烷誘導(dǎo)的肺腫瘤發(fā)生率下降[16]。MOB1 在51.2%的非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，且MOB1 高表達(dá)與患者生存期縮短密切相關(guān)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MOB1 蛋白能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲能力[17]。在肝癌中，MOB1蛋白對于腫瘤的生成、增殖、侵襲及遷移的影響并未得到系統(tǒng)性研究。本研究將利用生物信息學(xué)探索MOB1基因在肝癌組織中的表達(dá)情況，并分析MOB1 高表達(dá)與患者生存期之間的關(guān)系；收集肝癌臨床組織樣本，利用Western blotting驗證MOB1蛋白的表達(dá)水平；在MOB1敲低及過表達(dá)肝癌細(xì)胞系中，研究MOB1 蛋白對細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，并用Western blotting檢測相關(guān)信號通路蛋白的變化，探索MOB1蛋白在肝癌中的作用。

1 材料和方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取肝癌表達(dá)譜及生存數(shù)據(jù)，包括50例正常樣本及371例腫瘤樣本。統(tǒng)計正常樣本與腫瘤樣本中MOB1a和MOB1b的表達(dá)量并分析其表達(dá)。使用UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu）在線分析MOB1與生存預(yù)后的關(guān)系。

1.2 樣本收集

本研究獲得深圳市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審查和批準(zhǔn)（LL-KY-2019422），且已取得所有受試者本人簽署的知情同意書。28例肝癌組織及癌旁組織來自深圳市人民醫(yī)院手術(shù)切除標(biāo)本（收集時間自2020年1月至2020年12月），其中包括15例肝細(xì)胞性肝癌（HCC）、5 例肝內(nèi)膽管癌、3 例肝血管癌、1 例肝細(xì)胞腺癌、2例纖維性肝癌、1例直腸癌肝轉(zhuǎn)移、1例乳腺癌肝轉(zhuǎn)移，所有樣本均有明確的病理診斷報告。將每例患者的癌旁組織與癌組織進(jìn)行配對研究，樣本取得后，立即切成小塊分裝，并儲存于液氮中，直至使用。取50 mg左右的組織，加入含蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑的強效RIPA緩沖液，在冰上進(jìn)行高速研磨裂解后，12 000 g離心15 min，取上清進(jìn)行蛋白定量，并加入SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸15 min后于-80 ℃儲存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞活力測定

人肝癌細(xì)胞系Huh7和HepG2培養(yǎng)于含10%胎牛血清及1%青霉素/鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中，置于含5% CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在細(xì)胞增殖實驗中，將Huh7和HepG2細(xì)胞分別以2.5×103、5×103個/孔的密度接種于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，于24、48、72、96 h加入10%的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h，測定450 nm處吸光值并計算細(xì)胞活力。

1.4 siRNA敲低

MOB1a和MOB1b的siRNA及陰性對照NCsiRNA由上海吉瑪生物科技公司設(shè)計及體外合成。序列如下表1所示。轉(zhuǎn)染前1 d取對數(shù)生長期肝癌細(xì)胞傳代于6 孔板或96 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用GP-transfect-Mate試劑按照說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

表1 雙鏈siRNA序列

1.5 MOB1a過表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建

利用慢病毒介導(dǎo)的過表達(dá)質(zhì)粒pLVX-3Flag-puro構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞系。將全長的人MOB1a的編碼序列克隆至pLVX-3Flag-puro質(zhì)粒中，測序確定序列正確性。將psPAX2和pMD2.G及目的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，于48 h和72 h收集含病毒液上清，并用0.45 μm的濾膜過濾。將病毒液加入至目的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后用puromycin進(jìn)行篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。用pLVX-3Flag-puro載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照。利用Western blotting鑒定Flag-MOB1a的過表達(dá)效果。

1.6 細(xì)胞周期檢測

用0.25%胰酶-EDTA溶液消化細(xì)胞后，離心收集細(xì)胞，用PBS清洗1 次，隨后用預(yù)冷的70%乙醇溶液過夜固定細(xì)胞，最后加入100 mg/L RNaseA和50 mg/L PI溶液，置于37 ℃孵育30min，用40 μm濾膜過濾后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化情況。

1.7 蛋白表達(dá)量檢測

采用Western blotting法。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后通過濕法電泳轉(zhuǎn)移方法將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm的PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉1 h。加入一抗溶液在室溫孵育1 h或在4 ℃孵育過夜，用TBST洗膜3次。再加入HRP標(biāo)記的二抗，繼續(xù)在室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，然后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（）表示，多組均數(shù)之間采用單因素方差分析進(jìn)行比較，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK（Student-Newman-Keuls）-q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中MOB1在肝癌中高表達(dá)

對TCGA數(shù)據(jù)庫樣本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，MOB1a和MOB1b兩個基因在肝癌組織中mRNA表達(dá)水平均呈顯著上調(diào)（圖1A和1C）。隨后進(jìn)行預(yù)后生存分析，將樣本分為MOB1高表達(dá)組和MOB1低表達(dá)組，結(jié)果顯示MOB1a和MOB1b兩個基因高表達(dá)組的生存率均顯著下降（圖1B和1D）。以上結(jié)果提示，MOB1高表達(dá)促進(jìn)了肝癌的發(fā)生發(fā)展，且表達(dá)量越高，預(yù)后越差。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析MOB1 mRNA表達(dá)水平及其與肝癌的關(guān)系

2.2 在臨床組織樣本中驗證MOB1在肝癌中高表達(dá)

提取肝癌組織及配對癌旁組織的總蛋白，利用Western blotting檢測MOB1蛋白表達(dá)水平。本研究中，臨床組織樣本涉及的28例患者基本信息見表2和表3。MOB1在13例HCC樣本（13/15，86.7%）和7例其他類型肝癌樣本（7/13，53.8%）中高表達(dá)，結(jié)果如表4所示。此外，與其他類型肝癌相比，MOB1蛋白相對表達(dá)量在HCC的組織樣本中顯著升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 臨床組織樣本中MOB1蛋白的表達(dá)水平

表2 臨床樣本庫中15例HCC患者的基本信息（例）

表3 臨床樣本庫中13例其他類型肝癌患者的基本信息（例）

表4 MOB1在腫瘤樣本中的表達(dá)情況統(tǒng)計

2.3 MOB1 蛋白過表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖并增加G2/M期細(xì)胞比例

MOB1a與MOB1b蛋白具有高度同源性，MOB1a基因在肝癌細(xì)胞中表達(dá)量大于MOB1b基因。因此，后續(xù)實驗選擇MOB1a基因作為MOB1 的代表進(jìn)行研究。Western blotting結(jié)果表明，在Huh7 和HepG2 細(xì)胞中，穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系Flag-MOB1a構(gòu)建成功（圖3A和3D）。相比于空載對照組（pLVX），F(xiàn)lag-MOB1a組的細(xì)胞增殖能力（圖3B和3E）與G2/M期的細(xì)胞比例（圖3C和3F）均明顯上升（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，MOB1 的表達(dá)與肝癌細(xì)胞的增殖呈正相關(guān)。

圖3 MOB1蛋白過表達(dá)對Huh7和HepG2細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

2.4 MOB1蛋白低表達(dá)抑制細(xì)胞增殖及降低G2/M期細(xì)胞比例

為了進(jìn)一步探究MOB1蛋白與肝癌細(xì)胞增殖的關(guān)系，本研究先采用siRNA下調(diào)Huh7和HepG2細(xì)胞中MOB1 的表達(dá)，然后采用CCK-8 方法檢測MOB1的低表達(dá)對Huh7和HepG2細(xì)胞增殖的影響。Western blotting檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，轉(zhuǎn)染MOB1 siRNA的細(xì)胞MOB1 的蛋白表達(dá)明顯受到抑制（圖4A和4D，P＜0.05），表明MOB1 的干擾效率顯著。同時，Huh7 和HepG2 細(xì)胞的增殖速度亦顯著被抑制（圖4B和4E，P＜0.05）。細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，與NC-siRNA肝癌細(xì)胞相比，MOB1低表達(dá)能顯著降低G2/M期細(xì)胞比例（圖4C和4F）。

2.5 MOB1 蛋白低表達(dá)能顯著降低Cyclin D1 及p-AKT表達(dá)水平

MOB1 是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，然而MOB1蛋白低表達(dá)導(dǎo)致肝癌細(xì)胞增殖速度降低是否通過影響細(xì)胞周期還有待探究。如圖4 所示：與對照組相比較，G2/M期肝癌細(xì)胞比例隨MOB1蛋白表達(dá)下調(diào)顯著下降，提示MOB1低表達(dá)可能導(dǎo)致Huh7和HepG2細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)入M期進(jìn)行有絲分裂的肝癌細(xì)胞數(shù)量減少（圖4D，4H）。通過蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，MOB1低表達(dá)可導(dǎo)致Cyclin D1表達(dá)下降；反之，MOB1過表達(dá)使Cyclin D1表達(dá)升高（圖5）。眾所周知，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白是細(xì)胞周期進(jìn)程的重要調(diào)控因子，因此上述結(jié)果表明MOB1 低表達(dá)可通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子導(dǎo)致肝癌細(xì)胞周期停滯。

圖4 MOB1蛋白敲低表達(dá)對Huh7和HepG2細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

在經(jīng)典的Hippo-YAP信號通路中，MOB1 蛋白主要作為接頭蛋白介導(dǎo)MST1/2激酶和LATS1/2激酶之間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這一系列事件最終導(dǎo)致YAP的S127磷酸化，抑制其入核[18]。然而本研究發(fā)現(xiàn)，在Huh7和HepG2細(xì)胞中，MOB1過表達(dá)或敲低表達(dá)時，YAP的S127磷酸化水平均無明顯變化。在檢測其他與細(xì)胞周期相關(guān)的信號通路蛋白時發(fā)現(xiàn)，AKT的Ser473磷酸化水平與MOB1表達(dá)水平呈正相關(guān)（圖5）。因此，在肝癌細(xì)胞中，蛋白MOB1 可能不是通過Hippo-YAP信號通路而是通過AKT信號通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的。

圖5 MOB1蛋白過表達(dá)及敲低表達(dá)對Huh7細(xì)胞及HepG2細(xì)胞相關(guān)信號通路的影響

3 討論

MOB1 作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，在多種腫瘤中呈低表達(dá)，扮演著抑癌的角色，但其作用尚存在爭議[19]。關(guān)于MOB1 是否參與肝癌細(xì)胞的生物學(xué)作用，國內(nèi)外尚缺乏相關(guān)報道。本研究首先通過檢索TCGA數(shù)據(jù)庫，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)MOB1a和MOB1b的mRNA表達(dá)水平在肝癌組織中均顯著上升，且MOB1的高表達(dá)與患者的生存率下降顯著相關(guān)。同時，在肝癌臨床組織樣本中，MOB1蛋白顯著高表達(dá)。本研究通過在Huh7和HepG2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)MOB1蛋白，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖速率變快，且處于分裂期的細(xì)胞比例顯著升高；反之，MOB1蛋白敲低后，處于分裂期的細(xì)胞比例顯著降低。這些結(jié)果說明，MOB1蛋白可能通過調(diào)控細(xì)胞周期扮演著促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的角色。

Cyclin D1是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，在癌癥的發(fā)病機制中發(fā)揮核心作用。在正常細(xì)胞中，Cyclin D1的表達(dá)水平受到嚴(yán)格的調(diào)控；相反，在癌癥中其活性以各種方式增強[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，MOB1低表達(dá)能下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)。因此，MOB1蛋白可能通過調(diào)控Cyclin D1蛋白表達(dá)影響肝癌的細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖。

現(xiàn)有的研究主要報道MOB1蛋白是一種細(xì)胞內(nèi)的輔調(diào)節(jié)蛋白，即MOB1 直接與蛋白激酶結(jié)合，然后影響其與上下游其他蛋白的相互作用，如在Hippo-YAP信號通路中介導(dǎo)MST1/2 及LATS1/2 蛋白之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。在鼠和果蠅中，MOB1 蛋白缺失會造成胚胎致死或嚴(yán)重畸形；然而，在人HEK293A細(xì)胞中，MOB1 蛋白敲除細(xì)胞依然能夠存活，但Hippo通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到了影響，如在血清饑餓的處理下YAP蛋白的磷酸化顯著下降，這說明MOB1在HEK293A細(xì)胞中能促進(jìn)YAP蛋白的磷酸化，調(diào)控經(jīng)典的Hippo-YAP通路[21]。在Huh7和HepG2細(xì)胞中，MOB1蛋白過表達(dá)及敲低后，YAP的S127位磷酸化水平無明顯變化；但是，MOB1 蛋白的過表達(dá)能夠激活A(yù)KT蛋白磷酸化。YAP蛋白是Hippo信號通路的效應(yīng)因子，YAP蛋白的磷酸化是其入核調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān)機制[22]。在肝癌中，激活的AKT蛋白被證明能控制肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡，影響肝癌的分化及轉(zhuǎn)移，如利用LY294002處理抑制AKT蛋白S473位點磷酸化，能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，顯著增加G0/G1期細(xì)胞比例，降低增殖及周期相關(guān)蛋白CDK2、CDK4、Cyclin D1、Cyclin D3、Cyclin E、Cyclin A的表達(dá)水平[23]。因此，本研究認(rèn)為，MOB1 可能通過調(diào)控AKT/Cyclin D1 信號通路影響肝癌細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖。

綜上所述，MOB1 蛋白在肝癌中并不是傳統(tǒng)意義上的抑癌基因，相反在肝癌組織中顯著高表達(dá)。因此，MOB1可能作為一個促癌基因，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，參與肝癌的進(jìn)展，具有重要的臨床意義。