周 毅，王雪笠，黎炳護(hù)，朱艷霞，甄 寧，高利濤，劉 軍，王 麗，智建霞，張莉莉

在高血壓慢性病程中，各級(jí)動(dòng)脈出現(xiàn)結(jié)構(gòu)或功能改變，包括細(xì)胞增殖、遷移、調(diào)亡及基質(zhì)成分的改變和重排等各種復(fù)雜動(dòng)態(tài)過(guò)程，最終引起血管重構(gòu)。高血壓血管重構(gòu)的早期事件和重要環(huán)節(jié)是血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的表型轉(zhuǎn)化。高血壓狀態(tài)下腦動(dòng)脈中膜VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，由正常的收縮表型(分化表型)轉(zhuǎn)化為合成表型(去分化表型)，自身發(fā)生VSMC增殖和遷移引起中膜增厚，是造成管腔狹窄的主要原因[1]。腦動(dòng)脈這種組成結(jié)構(gòu)的改變使得毛細(xì)血管床灌注及腦血流量減少，最終引起腦卒中。辣椒中的活性成分辣椒素(Cap)已被證明對(duì)肥胖、糖尿病和心血管疾病有積極的治療作用[2-3]。美國(guó)國(guó)家健康和營(yíng)養(yǎng)調(diào)查Ⅲ的一項(xiàng)大規(guī)模、以人群為基礎(chǔ)的前瞻性研究表明，經(jīng)常食用辣椒與較低的病死率有關(guān)[4]。同樣，意大利的一項(xiàng)基于人群的研究報(bào)告稱，每天食用辣椒可以顯著降低心腦血管相關(guān)死亡的發(fā)生率[5]。此外，Cap被證明可以減輕神經(jīng)退行性疾病模型動(dòng)物的行為缺陷，如減少異常的不自主運(yùn)動(dòng)，改善空間學(xué)習(xí)和記憶能力[6-7]。Cap能夠通過(guò)AMPK/NF-κB信號(hào)通路，降低基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá)來(lái)抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的遷移和侵襲。Cap貼劑能夠治療化療誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病理性疼痛，不僅緩解了疼痛，還避免了中樞神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)[8]。一項(xiàng)涉及10個(gè)對(duì)照研究及398名參與者的薈萃分析表明，膳食中補(bǔ)充Cap可降低血清總膽固醇水平[9]。本研究旨在探討Cap是否能夠抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)VSMC的增殖遷移，減輕醋酸去氧皮質(zhì)酮(DOCA)-鹽引起的大鼠血壓升高，進(jìn)而抑制高血壓引起的頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 雄性WKY大鼠(SPF級(jí)，10周齡)，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)[SYXK(軍)2017-0058]。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。胰酶細(xì)胞消化液購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。Cap、辣椒素抑制劑(CapZ)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。AngⅡ、DOCA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物造模及分組：WKY大鼠使用10%水合氯醛麻醉，俯臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，左側(cè)背部剪毛，備皮，使用碘伏嚴(yán)格消毒。沿脊柱外側(cè)、肋骨下緣做一長(zhǎng)2.0～2.5 cm切口，從腹后膜進(jìn)入找到腎臟，暴露整個(gè)左側(cè)腎臟，并游離腎蒂，切除左側(cè)腎臟。消毒后縫合肌層和皮膚。腎臟切除后觀察1周，然后將40只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(Con組)，肩胛部皮下注射普通植物油，普通飼料喂養(yǎng)，正常飲水；模型組(DOCA組)，肩胛部皮下注射40 mg/kg DOCA油劑，飲水中加入1%氯化鈉溶液和0.1%氯化鉀溶液；DOCA+Cap組，在DOCA組基礎(chǔ)上飼料中添加0.01% Cap；DOCA+Cap+CapZ組，在DOCA+Cap組基礎(chǔ)上飼料中添加0.01% CapZ。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組：采用組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMC。取小鼠胸主動(dòng)脈，用含青、鏈霉素的無(wú)菌PBS液浸洗，仔細(xì)剝除纖維層和外膜?？v行剖開(kāi)血管使內(nèi)膜面向上，用眼科彎剪輕刮2～3遍去除血管內(nèi)皮細(xì)胞。更換培養(yǎng)皿，將血管中層組織剪切成1 mm3小塊，接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，組織塊間隙約為0.5 cm，瓶?jī)?nèi)加入含20%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基，直立于37 ℃、5% CO2無(wú)菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 h，待組織塊緊貼瓶底后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)基浸沒(méi)組織塊，3 d后更換培養(yǎng)基。待組織塊有細(xì)胞爬出，且足夠傳代后行第一次傳代，后待細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底面積80%～90%即可傳代培養(yǎng)。傳代至第三代時(shí)，應(yīng)用α-SMA鑒定原代VSMC。

1.2.3MTT法觀察VSMC增殖情況：將3×104/ml的細(xì)胞懸液種植在96孔板上。應(yīng)用AngⅡ(100 nmol/L)、Cap(1 μmol/L)、CapZ(1 μmol/L)將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+Cap組、AngⅡ+Cap+CapZ組。然后細(xì)胞樣品與20 μl MTT在37 ℃下孵育4 h, 200 μl DMSO充分混合細(xì)胞。用酶標(biāo)儀(Bio-Rad, CA, USA)測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處吸光度。

1.2.4劃痕實(shí)驗(yàn)觀察VSMC遷移情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板后，用移液器槍頭沿培養(yǎng)板底部劃“一”字形劃痕單層培養(yǎng)細(xì)胞，以此計(jì)時(shí)，鏡下記錄初始劃痕區(qū)的相對(duì)距離。吸除原有培養(yǎng)液，無(wú)血清培養(yǎng)液輕洗2次，洗掉去除的細(xì)胞，加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液及各組對(duì)應(yīng)的干預(yù)試劑繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下記錄劃痕的寬度并照相。

1.2.5Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白水平：采用Western blot法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和MMP-9蛋白水平。蛋白質(zhì)樣本取自原代培養(yǎng)VSMC。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上用抗PCNA(1︰500)、抗MMP-9(1︰500)和抗β-肌動(dòng)蛋白(1︰2000)一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。洗滌后，將PVDF膜與辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的二抗在室溫下孵育2 h，然后應(yīng)用Gel Doc 2000成像儀(美國(guó)CA Bio-Rad)采用密度法定量蛋白水平，以β-actin為正常對(duì)照。

1.2.6血壓測(cè)定：在大鼠清醒狀態(tài)下，使用智能無(wú)創(chuàng)鼠尾血壓測(cè)定儀測(cè)量各組大鼠鼠尾收縮壓(SBP)，每周測(cè)量1次。測(cè)量時(shí)首先將大鼠固定在合適的固定籠中，放置在37 ℃恒溫加熱架上預(yù)熱5～10 min，使鼠尾血管充分?jǐn)U張以便感應(yīng)器感應(yīng)。然后將鼠尾套在血壓測(cè)量感應(yīng)器壓套上，壓力傳感器達(dá)鼠尾近心端約1/4處時(shí)固定傳感器和大鼠。待大鼠充分安靜后，打開(kāi)血壓檢測(cè)系統(tǒng)，獲取血壓波形，并用軟件記錄。每次測(cè)量間隔2 min，每只大鼠重復(fù)測(cè)量5次，取平均值。

1.2.7HE染色觀察頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生情況：應(yīng)用10%水合氯醛麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠后以4%多聚甲醛溶液灌注固定，灌注結(jié)束后取大鼠頸動(dòng)脈，置于4%多聚甲醛溶液中在4 ℃冰箱中固定24 h。灌注固定血管石蠟包埋，切片厚度6 μm，采用HE染色分析測(cè)量外彈性層(EEL)內(nèi)面積、內(nèi)彈力層(IEL)內(nèi)面積和管腔面積。內(nèi)膜面積=IEL內(nèi)面積-管腔面積，EEL和IEL之間為中膜面積，通過(guò)計(jì)算內(nèi)膜與中膜面積的比值來(lái)評(píng)估內(nèi)膜增生程度。應(yīng)用Tissue Gnostics顯微鏡記錄圖片。

2 結(jié)果

2.1AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖遷移情況 應(yīng)用組織貼片法原代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈來(lái)源的VSMC，用免疫熒光法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)(圖1)，表明培養(yǎng)細(xì)胞可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VSMC遷移情況，24 h后AngⅡ組細(xì)胞劃痕寬度明顯減小，細(xì)胞向劃痕處遷移，空白對(duì)照組細(xì)胞無(wú)此現(xiàn)象；AngⅡ組細(xì)胞遷移情況優(yōu)于空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。應(yīng)用MTT法檢測(cè)VSMC增殖情況，結(jié)果顯示AngⅡ組細(xì)胞增殖情況優(yōu)于空白對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖1 免疫熒光法檢測(cè)原代培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)(×400)

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察AngⅡ?qū)SMC遷移的作用(×100)

圖3 MTT法檢測(cè)AngⅡ?qū)SMC增殖的影響

2.2Cap抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC表型轉(zhuǎn)化情況 為觀察Cap對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖、遷移的影響，我們給予Cap(1 μmol/L)及CapZ(1 μmol/L)后觀察細(xì)胞增殖遷移情況。應(yīng)用MTT和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞PCNA表達(dá)，觀察細(xì)胞增殖情況；應(yīng)用劃痕試驗(yàn)及Western blot法檢測(cè)細(xì)胞MMP-9表達(dá)，觀察細(xì)胞遷移情況。結(jié)果顯示，AngⅡ組大于空白對(duì)照組，AngⅡ+Cap組小于AngⅡ組，AngⅡ+Cap+CapZ組大于AngⅡ+Cap組(P<0.05)；PCNA和MMP-9水平，AngⅡ組大于空白對(duì)照組，AngⅡ+Cap組小于AngⅡ組，AngⅡ+Cap+CapZ組大于AngⅡ+Cap組(P<0.05)。見(jiàn)圖4～6。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠VSMC遷移情況

2.3Cap對(duì)DOCA-鹽飲食大鼠血壓的影響 單純Cap膳食干預(yù)對(duì)大鼠血壓無(wú)明顯影響，DOCA組SBP較Con組顯著升高(P<0.05)，提示Cap膳食本身對(duì)SBP無(wú)明顯影響。DOCA+Cap組SBP較DOCA組升高程度明顯減小(P<0.05)；DOCA+Cap+CapZ組SBP較DOCA+Cap組又明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖7。

圖7 Cap膳食對(duì)DOCA-鹽飲食大鼠血壓的影響

表1 Cap膳食對(duì)DOCA-鹽飲食大鼠收縮壓的影響

2.4Cap對(duì)DOCA-鹽引起的高血壓大鼠血管重構(gòu)的影響 頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生程度，DOCA組明顯大于Con組，DOCA+Cap組明顯小于DOCA組，DOCA+Cap+CapZ組明顯大于DOCA+Cap組(P<0.05)，見(jiàn)圖8。

圖8 HE染色觀察Cap膳食對(duì)高血壓大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜的影響(×200)

3 討論

已經(jīng)證實(shí)，高血壓是腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10]。在高血壓慢性病程中，各級(jí)動(dòng)脈出現(xiàn)結(jié)構(gòu)或功能上的系列改變，最終引起血管重構(gòu)。高血壓動(dòng)脈重構(gòu)的早期事件和重要環(huán)節(jié)是VSMC的表型轉(zhuǎn)化。成年個(gè)體血管中VSMC主要為分化表型，多種收縮蛋白高表達(dá)，而維持非常低的增殖與合成能力，主要發(fā)揮收縮功能以調(diào)節(jié)血管張力和維持血壓。

圖5 MTT法檢測(cè)各組大鼠VSMC增殖情況

圖6 Western blot法檢測(cè)各組大鼠VSMC PCNA和MMP-9的表達(dá)

與骨骼肌或心肌細(xì)胞不同的是，VSMC可以在各種刺激下發(fā)生去分化而出現(xiàn)未分化細(xì)胞的表型特征，如增殖遷移活躍、基質(zhì)蛋白合成增多、離子通道和微結(jié)構(gòu)改變等，被稱為表型轉(zhuǎn)化。適度的VSMC表型轉(zhuǎn)化是血管對(duì)環(huán)境刺激的適應(yīng)性反應(yīng)。例如在輕度機(jī)械損傷或血管生成時(shí)，VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，通過(guò)增殖、遷移并合成細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)血管修復(fù)或血管形態(tài)的形成。但是在血壓升高的情況下，VSMC的表型轉(zhuǎn)化導(dǎo)致VSMC大量增殖和遷移，并在內(nèi)膜下聚集，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)和多種炎性因子，最終引起血管重構(gòu)和血管疾病的發(fā)生[9]。發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化的VSMC是血管重構(gòu)的主要成分，在動(dòng)脈粥樣硬化病變中，增殖的VSMC及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)占病變體積的70%以上[11]。原代培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈VSMC在AngⅡ刺激下發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，細(xì)胞增殖遷移能力顯著增強(qiáng)。我們應(yīng)用DOCA-鹽模型在體研究高血壓對(duì)血管內(nèi)膜增生的作用，結(jié)果顯示，高血壓狀態(tài)下，DOCA組大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜較Con組大鼠增生明顯，動(dòng)脈內(nèi)膜顯著增厚。

Cap是辣椒中的辛辣成分，在世界范圍內(nèi)作為蔬菜和香料食用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Cap膳食可以改善內(nèi)皮細(xì)胞功能[13]，減輕動(dòng)脈粥樣硬化[14-15]，延緩腦卒中的發(fā)生。此外，Cap膳食還能夠改善腦卒中后腦血管側(cè)支循環(huán)[16-18]。還有研究證實(shí)，Cap可以維持血糖穩(wěn)態(tài)，改善高血糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙，并預(yù)防糖尿病心血管并發(fā)癥[19-20]。本研究表明，Cap能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的VSMC增殖遷移。在體研究結(jié)果顯示，Cap膳食能夠顯著降低DOCA-鹽飲食大鼠血壓的升高，且能夠明顯減輕高血壓引起的頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生。

總之，Cap能夠抑制VSMC表型轉(zhuǎn)化，降低DOCA-鹽引起的大鼠血壓升高，減輕因高血壓導(dǎo)致的大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生，為高血壓引起的血管重構(gòu)治療提供了新方法。