孫亞楠，楊紅玉，郭 婧，李 楠，蔡玉茹

宮頸癌是全球女性癌性死亡的一個主要原因，病死率僅次于乳腺癌，近年我國宮頸癌發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重影響了女性健康[1-3]。人類乳頭瘤病毒(HPV)感染被認(rèn)為是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的影響因素[4]，在已知的200種HPV類型中，HPV 16和18感染關(guān)聯(lián)的患病率約為70%[5]。雖然HPV感染已成為宮頸癌發(fā)病的一個明確原因，但是并非所有感染HPV的婦女都會發(fā)展為宮頸癌，而未感染HPV的婦女也會患宮頸癌，這表明個體遺傳因素的變異在影響女性HPV感染和宮頸癌易感性方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其中一個因素為先天免疫系統(tǒng)病原體識別受體即Toll樣受體(TLRs)。TLRs在細(xì)菌、病毒和其他病原體及抗腫瘤免疫應(yīng)答方面均有重要作用，其也是感染、組織損傷等多種因素引發(fā)炎癥反應(yīng)的起始因子[6]。同時，炎癥也是重要的致癌因素，炎癥相關(guān)TLR基因的遺傳變異在影響致病性感染和癌癥易感性方面具有潛在作用[7]。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是廣泛存在于生物基因組中的一種新型分子標(biāo)志物，可能影響基因的調(diào)控、表達(dá)和功能[8-10]，基于炎癥在宮頸癌中的重要作用及TLR基因SNPs與宮頸癌易感性的關(guān)聯(lián)性，本研究旨在檢測TLR4基因SNPs，探討其與宮頸癌易感性的關(guān)系，以期為宮頸癌的防治提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八〇醫(yī)院婦產(chǎn)科和河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科2012—2020年來院的503例宮頸癌(宮頸癌組)和495例體檢健康者(對照組)。宮頸癌患者入組條件：經(jīng)病理檢查確診，排除患有其他癌癥、接受過放化療者，患者彼此間無親屬關(guān)系。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：無腫瘤家族史和宮頸相關(guān)疾病者。納入對象基本特征信息包括年齡、初婚年齡和生育史。宮頸癌組臨床信息包括腫瘤類型和腫瘤分期，腫瘤分期依據(jù)國際婦產(chǎn)科學(xué)聯(lián)合會(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)并經(jīng)患者知情同意。

1.2位點(diǎn)篩選和基因分型 選取TLR4基因的4個SNPs位點(diǎn)：rs4986790、rs10759931、rs11536889和rs1927911。全血DNA提取：收集所有樣本的外周血2 ml，采用全血DNA提取試劑盒提取基因組DNA(北京艾德萊)，DNA樣本采用微量分光光度計定量，并于-70 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩２捎镁酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)行基因分型，酶切產(chǎn)物采用3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分型。PCR試劑盒購自Takara公司，限制性內(nèi)切酶為快反應(yīng)內(nèi)切酶購自Thermo公司。位點(diǎn)基本信息、引物設(shè)計和限制性內(nèi)切酶見表1。

表1 TLR4基因SNPs基本信息和PCR-RFLP實(shí)驗(yàn)條件

2 結(jié)果

2.1臨床資料比較 宮頸癌組年齡為(44.43±7.60)歲，對照組年齡為(44.05±7.08)歲；宮頸癌組初婚年齡為(24.52±3.02)歲，對照組初婚年齡為(26.16±3.166)歲；宮頸癌組初產(chǎn)年齡為(26.23±2.80)歲，對照組初產(chǎn)年齡為(27.98±3.17)歲；宮頸癌組產(chǎn)次≤2次者485例，>2次者18例；對照組產(chǎn)次≤2次者483例，>2次者12例。2組在初婚年齡、初產(chǎn)年齡方面比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，在年齡、產(chǎn)次方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因此，在后續(xù)Logistic回歸分析時應(yīng)對初婚年齡和初產(chǎn)年齡予以校正。此外，宮頸癌組病理分型為鱗癌479例(95.2%)，腺癌19例(3.8%)，其他5例(1.0%)；FIGO分期Ⅰ期218例(43.3%)、Ⅱ期196例(39.0%)、Ⅲ期56例(11.1%)、Ⅳ期33例(6.6%)。

2.2平衡性校驗(yàn)結(jié)果 所有SNPs位點(diǎn)在2組群體中符合Hardy-weinberg平衡(P>0.05)，表明研究群體具有良好的代表性；連鎖不平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示：4個SNPs位點(diǎn)間不存在連鎖遺傳，D'趨近于1，因此可以進(jìn)行單倍型分析。見表2。

表2 TLR4基因多態(tài)性與宮頸癌易感性的平衡性校驗(yàn)分析

2.3基因多態(tài)性分析 TLR4基因rs4986790、rs10759931和rs11536889等位基因和基因型分布2組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而rs1927911的基因型分布2組間比較無差異(P>0.05)。校正初婚年齡和初產(chǎn)年齡后，rs4986790的AG基因型、rs10759931的GG基因型和rs11536889的CC基因型與宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險增加有關(guān)(P<0.05，P<0.01)。此外，通過對宮頸癌早期(Ⅰ+Ⅱ期)和晚期(Ⅲ+Ⅳ期)與基因型分布的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，TLR4的4個SNPs位點(diǎn)基因多態(tài)性與宮頸癌FIGO分期無明顯關(guān)聯(lián)，TLR4的4個SNPs位點(diǎn)等位基因和基因型分布與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)聯(lián)。見表3。

表3 TLR4的4個SNPs位點(diǎn)的等位基因和基因型分布與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性分析

2.4單倍型多態(tài)性分析 在單倍型分布率與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性分析中，以單倍型A-A-G-C為參考，單倍型G-A-G-T、G-A-C-C和A-A-C-T與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)，而單倍型A-A-C-C則與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險降低有關(guān)(P<0.05，P<0.01)；宮頸癌組和對照組單倍型G-A-G-T分布率分別為0.166和0.133，攜帶該單倍型個體的宮頸癌易感性風(fēng)險值為1.627(95%CI：1.224，2.163，P=0.001)。見表4。

表4 宮頸癌單倍型分布與發(fā)病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性分析

3 討論

TLR4基因位于9號染色體q32-q33，包含4個外顯子，在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、多形核白細(xì)胞和脾細(xì)胞中高度表達(dá)[11]。TLR4在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與介導(dǎo)機(jī)體對病毒、細(xì)菌、真菌等外來病原體引起的炎癥反應(yīng)[12]，并參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，尤其是以感染作為危險因素的腫瘤[13-15]。宮頸癌易感性受遺傳和環(huán)境因素的影響，HPV感染是宮頸癌發(fā)病的主要環(huán)境因素，研究表明，TLR4的表達(dá)與HPV陽性宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，而發(fā)生在TLR4啟動子區(qū)的變異會影響TLR4的表達(dá)水平[16]。隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析的不斷深入，已有多項(xiàng)研究報道TLR 2、4和9基因多態(tài)性在宮頸癌易感性中的重要作用[17-20]，但這些研究得出的結(jié)果并不一致。

基于TLR4基因在炎癥和腫瘤中的易感性，本研究選取了TLR4基因的4個功能型SNPs位點(diǎn)，分別位于5'-UTR(rs10759931)、3'-UTR(rs11536889)、外顯子(rs4986790)和內(nèi)含子(rs1927911)，涵蓋了該基因的不同區(qū)域。本研究結(jié)果顯示：rs4986790、rs10759931和rs11536889位點(diǎn)與宮頸癌的發(fā)病存在明顯關(guān)聯(lián)，攜帶基因型AG(rs4986790)、GG(rs10759931)和CC(rs11536889)的個體具有潛在的宮頸癌易感性，發(fā)病風(fēng)險分別增加了1.687、1.888和3.776倍。ZIDI等[19]報道TLR4 rs4986790位點(diǎn)的G等位基因和AG基因型與宮頸癌風(fēng)險增加有關(guān)，印度北部地區(qū)群體的rs11536889雜合基因型GC與宮頸癌風(fēng)險增加有關(guān)[20-22]，而且位于TLR4基因3'-UTR區(qū)的SNPs(rs11536889)的G等位基因被證實(shí)在TLR4表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。與本研究所得出結(jié)果不同的是，印度宮頸癌群體TLR4基因內(nèi)含子rs1927911位點(diǎn)的雜合基因型與宮頸癌風(fēng)險顯著相關(guān)[22]，而在波蘭女性群體中，rs10759931變異則對宮頸癌發(fā)病起保護(hù)作用[18]。可見，不同群體的疾病易感基因譜不盡相同。

由于單倍型分析較單一的SNPs分析更能體現(xiàn)出遺傳易感性在腫瘤發(fā)病中的表現(xiàn)度[24]，本研究對TLR4基因的4個SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示4個SNPs位點(diǎn)不存在連鎖遺傳，共構(gòu)成單倍型10種，其中7種單倍型分布率超過4%，通過對單倍型分布率分布和宮頸癌發(fā)病情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)單倍型A-A-G-C和G-A-G-T分布率與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險存在明顯關(guān)聯(lián)，以單倍型A-A-G-C作為對照，3種單倍型與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)，1種單倍型與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險降低有關(guān)，但由于單倍型G-A-C-C、A-A-C-T和A-A-C-C分布率2組間均較低，不能準(zhǔn)確反映其與宮頸癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)性，而單倍型G-A-G-T分布率在研究群體中相對較高，其風(fēng)險值評估可以作為參考，攜帶單倍型G-A-G-T的個體患宮頸癌的風(fēng)險提高了1.627倍。

本研究仍存在較多不足之處，首先，由于HPV感染是宮頸癌發(fā)病的重要因素，較多研究將HPV感染作為混雜因素對基因多態(tài)性分析進(jìn)行校正[21-22,25]，本研究由于樣本收集較早，早期并未對HPV感染的臨床數(shù)據(jù)收集完善，若剔除早期樣本量又不能很好反映基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病的關(guān)聯(lián)。近些年，隨著宮頸癌患者和健康體檢者HPV感染檢測的常規(guī)化，后續(xù)將對HPV感染類型和靶基因多態(tài)性的關(guān)系進(jìn)行深入探討；其次，本研究基于病例對照研究，缺少相應(yīng)機(jī)制和功能學(xué)的同步佐證，后續(xù)我們將研究TLR家族參與炎癥所致腫瘤的機(jī)制；再次，本研究樣本只收集本地區(qū)的2家醫(yī)院，存在選擇偏倚情況，擴(kuò)大收集范圍和增加樣本量仍是今后研究應(yīng)改進(jìn)之處。

綜上，TLR4基因rs4986790、rs10759931和rs11536889位點(diǎn)的多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險存在明顯關(guān)聯(lián)，TLR4可以作為宮頸癌的易感基因，為宮頸癌的早期篩查和個性化診治提供參考依據(jù)。